Введение к работе
Актуальность проблемы. Задачи, стоящие перед отечественным здравоохранением по снижению уровня инфекционных болезней, тесно связаны с их бактериологической диагностикой, которая в значительной степени зависит от качества и ассортимента питательных сред.
Однако научные и практические учреждения нашей страны все еще недостаточно обеспечены стандартными питательными средами и поэтому вынуждены использовать среды лабораторного приготовления, которые получают с применением низкокачественных компонентов и не всегда проверяют с эталонными тест-штаммами, т.е. их применение происходит без необходимого контроля. Нестандартность питательных сред, приготовляемых в условиях лабораторий, отрицательно влияет на результаты диагностики инфекций. За рубежом используют только коммерческие питательные среды, имеющие соответствующие сертификаты качества (А.Г.Бойцов, О.Н.Ластова, А.А.Порин, 2000; National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1990).
Одним из факторов, определяющих качество питательных сред, является наличие в их составе стандартных белковых основ. Питательными субстратами большинства сред служат белковые гидролизаты различного происхождения. При этом в качестве белкового сырья используют чаще всего мясо, рыбу, рыбную муку и казеин.
Основным белковым сырьем в промышленном производстве питательных сред в НПО «Питательные среды» является каспийская килька (М.М.Меджидов, 2003). Однако из-за экологических проблем Каспия ее улов значительно снизился и стал ощущаться дефицит этого сырья. Поэтому необходимы резервные источники сырья, позволяющие осуществить замену кильки на другие источники сырья без изменения конечных характеристик получаемых препаратов и условий на всех стадиях технологического процесса.
Одним из наиболее используемых компонентов питательных сред является ферментативный пептон. Промышленный выпуск сухого пептона в РФ был прекращен и в незначительных объемах начинает возрождаться. Пептоны производства Семипалатинского и Винницкого мясокомбинатов не отличаются стабильностью, что вызывает необходимость закупки дорогостоящих пептонов фирм, использующих в качестве сырья мясо высшей категории (В.И.Артюхин, А.П.Шепелин, Н.В.Киселева, 1990). В этой связи разработка технологии получения отечественного пептона, не уступающего по качеству зарубежным аналогам с использованием более дешевого сырья, является актуальной задачей.
За рубежом в составе коммерческих питательных сред для культивирования и выделения микроорганизмов широко используются гидролизаты сои (Culture Media Manual, bioMerieux, 1994; Microbiology Manual «Merck», 1990). В нашей стране до недавнего времени среды на основе сои не выпускались, что, прежде всего, связано с отсутствием разработок отечественных технологий получения соевых гидролизатов.
В приготовлении питательных сред в качестве стимулятора роста микроорганизмов широко используют экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) (А.К.Баранова, 1978; Б.М.Раскин, 1982). Однако существующие технологии его получения не обеспечивают прозрачность растворов (Н.А.Ковчик, И.И.Литвиненко, 1980). Данный показатель является важным, особенно при использовании ЭКД в составе жидких сред, т.к. о наличии роста микроорганизмов судят по помутнению среды. Кроме того, водные растворы ЭКД, представляющие собой полидисперсную коллоидную систему, быстро забивают поры фильтрующего материала и скорость фильтрации резко падает. Отсюда вытекает необходимость совершенствования технологии получения ЭКД на этапе фильтрации и повышения степени прозрачности растворов препарата.
Известно, что выделение чистых культур микроорганизмов значительно осложняется, если в микробной ассоциации присутствует протей, способный к роению. Для подавления роения протеев обычно используют различные химические вещества. Однако данные вещества, препятствуя роению протеев, могут ингибировать и рост выделяемых микроорганизмов. Вместе с тем, роение протеев может быть устранено на средах, содержащих питательную основу с минимальным содержанием минеральных веществ – электролит-дефицитную (G.H.Sandus, 1960). В РФ питательные среды на электролит-дефицитной основе не выпускались, что было связано с отсутствием технологии ее получения.
В мировой практике при бактериологическом анализе мочи, помимо неселективной среды – электролит-дефицитной, используют также селективную среду и среду для определения антибактериальных субстанций в моче (Culture Media bioMerieux, 1994). Данный комплекс питательных сред позволяет осуществить быструю идентификацию возбудителей уроинфекций и оценить эффективность антимикробной терапии. Аналогичные питательные среды в РФ отсутствуют.
В последние годы в ряде стран отмечают вспышки эшерихиоза, вызванного высокопатогенными для человека E. coli O157:H7, продуцирующими шигаподобный токсин (Ю.А.Ратинер, В.М.Бондаренко, A.Siitonen, 1998; Griffin P.M., Ciclak P.R., 1994). В связи с высокой патогенностью и глобальным распространением данной инфекции задача совершенствования способов индикации E. coli O157:H7 весьма актуальна. При этом особое внимание следует уделить исследованиям, направленным на разработку селективных сред, способствующих получению чистой культуры.
Ввиду неуклонного роста численности больных и высокой летальности при инфекционных заболеваниях бактериемия и сепсис являются одной из актуальных проблем современной медицины (В.Б.Белобородов, 1998; В.А.Руднов, 2000; В.С.Савельев, Б.Р.Гельфанд, 2006).
В диагностике бактериемии и сепсиса особое значение имеют микробиологические исследования крови, которые являются обязательным компонентом даже при подозрении на сепсис. Вместе с тем, ряд исследователей отмечают низкий процент высеваемости гемокультур при использовании сред лабораторного приготовления (В.Д.Бадиков, Л.Е.Журавлева, В.Н.Болехан, 1998; П.В.Кулагин, Р.П.Савченко, В.С.Иванова, 2001). В связи с этим, разработка коммерческих готовых к употреблению сред для выделения гемокультуры является актуальной задачей.
В последние десятилетия особое внимание клиницистов обращено на роль условно патогенных микроорганизмов в полиорганной патологии человека, требующих значительного увеличения ассортимента селективных питательных сред (В.М.Бондаренко, 2007). Возросли случаи пищевых отравлений, вызываемых Bacillus cereus (Д.Диксон, 1983; Ф.С.Флуер, 2007; Kramer J.M., Gilbert R.J., 1989). При выделении B. cereus из клинического материала и контаминированных пищевых продуктов возникают трудности, связанные с наличием в образцах разнообразных микробов-ассоциантов (Р.С.Джалилова, 1987). Поэтому для выделения B.cereus из материалов, содержащих смешанную микрофлору, требуются высокоселективные среды.
Приведенные данные свидетельствуют о необходимости изыскания новых источников сырья, разработок новых питательных основ и сред, и в первую очередь, таких, как ферментативный пептон, электролит-дефицитная питательная основа, соевый гидролизат, среды для выделения возбудителей при токсико-септическом состоянии, уроинфекции, селекции различных видов энтеробактерий и бацилл.
Цель работы. Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования технологий получения микробиологических питательных основ и сред.
Задачи исследования:
1. В результате исследований выявить альтернативные источники белкового сырья для производства питательных сред.
2. Экспериментально обосновать и разработать промышленную технологию получения ферментативного пептона из рыбного сырья, изучить физико-химические и биологические свойства препарата.
3. Создать промышленную технологию получения электролит-дефицитной питательной основы, с использованием которой сконструировать питательные среды: для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче; для выделения и дифференциации E. coli O157:H7; для выделения и дифференциации энтеробактерий, а также изучить из физико-химические и биологические свойства.
4. Разработать технологию получения ферментативного гидролизата сои, изучить физико-химические и биологические свойства препарата.
5. Изыскать новые технологические решения получения желточной эмульсии, готовой к употреблению, с длительным сроком хранения и экстракта кормовых дрожжей с высокой степенью прозрачности.
6. Экспериментально обосновать состав и разработать сухую селективную среду для бактериологического анализа мочи, а также питательную среду для определения антибактериальных субстанций в моче. Изучить физико-химические и биологические показатели созданных сред.
7. Разработать комплекс питательных сред для накопления, выделения и субкультивирования гемокультур, изучить физико-химические и биологические характеристики сконструированных сред.
8. Разработать новую селективную питательную среду для выделения B. cereus, изучить физико-химические и биологические свойства препарата.
Научная новизна. В экспериментальных исследованиях выявлены альтернативные источники белкового сырья для получения питательных сред, позволяющие полноценно заменить каспийскую кильку на другие источники белкового сырья без изменения конечных характеристик получаемых основ и стадий технологического процесса.
Впервые экспериментально обоснована и разработана технология получения сухого ферментативного пептона из рыбного сырья, который по физико-химическим и биологическим показателям не уступает аналогичным препаратам ведущих зарубежных фирм, но превосходит пептон производства Семипалатинского мясокомбината и фирмы HiMedia.
Разработана технология получения электролит-дефицитной питательной основы из рыбного сырья. Показана способность данной основы подавлять роение протеев и одновременно способствовать росту других патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
Разработана технология получения сухой питательной основы из отходов производства мяса криля. Питательный агар, приготовленный на данной основе, полностью соответствовал требованиям Фармакопейной статьи предприятия на питательный агар - ФСП № 42-0504-5807-04.
Изучены закономерности и определены оптимальные технологические параметры процессов получения гидролизата сои. Среды на основе этого гидролизата обладали высокой чувствительностью, способны выявить рост микроорганизмов при минимальной посевной дозе, что указывает на его высокие ростовые свойства.
Усовершенствована технология получения ЭКД, обладающего ростстимулирующей активностью в отношении тест-штаммов ауксотрофных по витаминам группы В, а также полной прозрачностью и высокой фильтруемостью.
Разработана технология получения желточной эмульсии для определения лецитиназной активности микроорганизмов в готовом к употреблению виде с длительным сроком хранения.
Научно обосновано новое направление в разработке отечественных сред на электролит-дефицитной питательной основе. На этом субстрате разработаны новые питательные среды: электролит-дефицитный питательный агар для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче, питательная среда для выделения и дифференциации E. coli O157:H7 и электролит-дефицитный агар с эозин-метиленовым синим для выделения и дифференциации энтеробактерий. Экспериментально показаны преимущества электролит-дефицитных сред, которые заключались в способности подавлять роение протеев и одновременно поддерживать рост выделяемых микроорганизмов.
Разработана сухая селективная среда для выделения и предварительной идентификации микроорганизмов в моче. В экспериментах установлено, что созданная среда совместно с неселективной средой при посеве мочи позволяет ускорить идентификацию микроорганизмов.
Разработана новая питательная среда для определения антибактериаль-ных субстанций в моче, обладающая высокой чувствительностью и способностью выявлять в моче низкие концентрации антибактериальных препаратов.
Разработан комплекс питательных сред для накопления, выделения и субкультивирования гемокультур. Показано преимущество разработанных сред по чувствительности и эффективности накопления основных возбудителей гемоинфекций, что способствует выделению гемокультуры при низкой напряженности бактериемии.
Разработана селективная среда для выделения B. cereus в чистой культуре из клинического материала и пищевых продуктов.
Основные положения научной новизны исследований подтверждены 15 патентами и авторскими свидетельствами.
Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику. Предложены альтернативные источники рыбного сырья, позволяющие расширить сырьевую базу для производства питательных сред.
В промышленное производство внедрены новые технологии получения белковых основ и питательных сред, повышающие эффективность производства и расширяющие номенклатуру питательных сред.
Новые питательные среды, позволяют улучшить бактериологическую диагностику инфекционных заболеваний.
По результатам выполненных исследований утверждены НД:
ФСП 42-0504-3426-04, ПР №58944705-03-06. Питательная среда для выделения и дифференциации E.coli O157:H7 и других энтеробактерий по признаку ферментации сорбита, сухая (ЭДКС-агар);
ФСП 42-0504-3162-04, ПР №58944705-02-06. Питательная среда для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче электролит-дефицитная сухая (ЭДПА);
ФСП 42-504-3427-04, ПР №58944705-01-06. Питательная среда для выделения и дифференциации энтеробактерий селективная, сухая (типа Макконки агара);
Промышленный регламент на производство питательного бульона для культивирования микроорганизмов (СПБ) №1681-05;
Регламент производства №148-88 – Питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой;
Регламент производства №1937-00, ФСП 42-3441-97, изменение 1. Экстракт кормовых дрожжей для микробиологических питательных сред, сухой.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Выявлены альтернативные источники белкового сырья для производства питательных сред, позволяющие осуществить замену одних видов сырья другими без изменений конечных характеристик препаратов и условий проведения стадий технологического процесса.
2. Экспериментально обоснована и разработана технология получения сухого ферментативного пептона из рыбного сырья.
3. Разработана сухая электролит-дефицитная питательная основа и научно обоснована целесообразность ее использования в составе сред для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче, для выделения и дифференциации различных видов энтеробактерий, включая энтерогеморрагические E.coli O157:H7 .
4. Сконструированы сухие питательные среды для бактериологического анализа мочи – селективная среда для выделения и дифференциации энтеробактерий и среда для определения антибактериальных субстанций в моче.
5. Экспериментально обоснованы и разработаны питательные среды для накопления и выделения гемокультур.
6. Создана селективная среда для выделения B.cereus.
Апробация материалов диссертации. Основные результаты проведенных исследований доложены на:
VII съезде – Всесоюзном совещании «Биологически активные вещества гидробионтов – новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты». Владивосток. – 1992 г; Всероссийском обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., – 1997 г; Международной научной конференции «Разработка и производство диагностических питательных сред и микротест-систем», Махачкала, – 1998г; VI-Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». М., – 1999 г; 3-й Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем; Махачкала, – 2001 г; VIII Съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., – 2002 г; 4-й Международной научно-практической конференции «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем, Махачкала, – 2003 г; Научно-практической конференции «Новые технологии в медицине», Махачкала, – 2003 г; Всероссийской научной конференции посвященной 105-летию Пермского НПО «Биомед», Пермь, – 2003 г; Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы», институт им. Л. Пастера Санкт-Петербург, – 2003 г; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применение иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, – 2004 г; III Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова. М., – 2005 г; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология». М., – 2006г; I Всероссийской конференции: «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты», Пущино, - 2007 г. Диссертация апробирована 05.10.07 г. на конференции в НПО «Питательные среды».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 47 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 271 странице и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 205 источников, и приложения. Материалы исследований иллюстрированы 52 таблицами и 8 рисунками.
