Введение к работе
Актуальность проблемы. В современных условиях на фоне успешной борьбы с инфекционными заболеваниями значимость микробного фактора в патологии человека не только не снижается, но и проявляет тенденцию к росту (Черкасский Б.Л., 1995; Покровский В.И., 2000; Онищенко Г.Г., 2002). На передний план выдвигаются новые, относительно недавно открытые, малоизученные инфекции. К ним относится и листериоз, частота осложнений и высокий процент летальных исходов, при котором общеизвестны. Наибольшую опасность заболевание представляет для беременных женщин, новорожденных, лиц с пониженной иммунологической реактивностью, а также больных, подвергающихся гемодиализу и химиотерапии (Черкасский Б.Л., 1995; Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А., 2002; Зайцева Е.А., Сомов Г.П., 2006; Зайцева Е.А., 2009; Arum K.Bhunia, 2008).
Медицинские проблемы листериоза определяются возрастающей ролью листерий в перинатальной и неонатальной патологии. Снижение уровня клеточного иммунитета во время беременности, особенно в поздние сроки, обусловливает повышение восприимчивости к листериозу у беременных, вызывая выкидыши, мертворождение, пороки развития плода и т.д. Достоверных сведений об истинной распространенности листериозной инфекции среди беременных и новорожденных в России нет, а число выявленных случаев невелико. Однако согласно данным ряда исследователей несмотря на своевременную антибиотикотерапию, смертность при перинатальном и неонатальном листериозе достигает 30-50%, в том числе при внутрибольничных вспышках в роддомах (Тартаковский И.С., 2002; Зайцева Е.А., 2009; Kaufman S.H.E., 1993; Lorber B., 1997; Arum K.Bhunia, 2008).
Рост этиологической значимости листерий в структуре инфекционной патологии человека диктует необходимость совершенствования качества диагностики, профилактики и санитарно-эпидемиологического надзора за листериозной инфекцией. В тоже время проблема требует усовершенствования существующих и создания новых, применяемых для этих целей иммунобиологических препаратов, необходимых для реализации современных схем выделения и идентификации L. monocytogenes в соответствии с международными стандартами (Тартаковский И.С., 2002; Омарова С.М., 2007).
Создание комплекса иммунобиологических препаратов значительно улучшит диагностику и профилактику листериоза, а включение в нормативные документы Минздрава и использование сухих селективных питательных сред отечественного производства взамен дорогостоящих сред зарубежных фирм значительно расширит возможности практической бактериологии по диагностике листериозной инфекции.
В настоящее время в связи с развитием молекулярно-генетических методов диагностики (ПЦР, ЛЦР и др.) становится целесообразным обследование беременных женщин наряду с известными инфекциями и на листериоз, особенно для женщин с отягощенным акушерским анамнезом.
Однако надежным «золотым стандартом» при диагностике инфекционных заболеваний остается классический бактериологический метод с выделением чистой культуры и идентификацией возбудителя. Применение селективных питательных сред и тест-систем позволят решать сложные задачи микробиологической диагностики, профилактики и контроля за санитарно-эпидемиологическим состоянием в стране по листериозу. Задачи пополнения номенклатуры питательных сред для бактериологической службы страны качественными отечественными диагностическими препаратами и внедрение их в медицинскую практику, не теряют значимости и в настоящее время.
Принимая во внимание указанное выше, остается актуальным создание стандартных отечественных высокочувствительных селективных питательных сред для выделения листерий, применение которых позволит получать стабильные воспроизводимые результаты исследований и с высокой степенью надежности повысит качество микробиологического мониторинга за листериозной инфекцией в России.
Цель. Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования селективных питательных сред для диагностики листериоза.
Задачи исследований.
1. В эксперименте изучить характеристики различных отечественных белковых гидролизатов и определить возможность их использования в качестве основ при разработке селективных питательных сред для выделения листерий.
2. Экспериментально обосновать разработку рецептуры питательной среды для селективного выделения листерий с учетом их биологических особенностей.
3. Изучить влияние стимуляторов роста на биологические показатели питательной среды для селективного выделения листерий.
4. Модифицировать среду Оксфорд-агар для первичной изоляции листерий из патологического материала различного происхождения. Определить физико-химические и биологические показатели среды, гарантирующие качество препарата.
5. Апробировать разработанные препараты в эксперименте и на клиническом материале. Изучить влияние составов созданных сред для селективного выделения на стабильность сохранения основных биологических свойств бактерий рода Listeria.
6. Определить диагностическую эффективность разработанных сред и целесообразность их применения при бактериологическом исследовании клинического материала от беременных и новорожденных. Предложить схему бактериологической диагностики листериозной инфекции с использованием новых препаратов.
Научная новизна. Научно и экспериментально обоснованы составы новых отечественных сухих питательных сред для селективного выделения листерий. Впервые на основании сравнительной оценки культуральных, физико-химических свойств и аминокислотного состава предложена комбинированная белковая основа – панкреатический рыбный гидролизат с пептоном ферментативным. Экспериментально доказана возможность и экономическая целесообразность использования питательной основы при создании сред для выделения листерий. Установлена и обоснована питательная ценность комбинированной основы и парааминобензойной кислоты, обеспечивающих высокие показатели чувствительности разработанных сред и скорости роста культуры при минимальных количествах Listeria spp. в исследуемом материале.
Разработаны и экспериментально обоснованы требования к основным показателям качества питательных сред при их серийном выпуске, доказана высокая диагностическая эффективность разработанных препаратов и отработаны методы их контроля. Установлена стабильность физико-химических и биологических свойств разработанных сред в процессе хранения, определены требования к чувствительности, ингибирующим и дифференцирующим свойствам на расширенном наборе музейных штаммов и свежевыделенных культур.
На основании экспериментальных данных о физико-химических и биологических свойствах разработанной и усовершенствованной питательных сред для селективного выделения разработана технология производства препаратов в промышленных условиях.
Теоретическая и практическая значимость. Разработаны и внедрены на предприятии НПО «Питательные среды» отечественные диагностические препараты для селективного выделения листерий из патологического материала и продуктов питания.
На основании экспериментальных данных разработана промышленная технология получения препаратов в производственных условиях. По результатам исследований составлена нормативно-техническая документация (НТД): технические условия (ТУ), регламенты производства (РП), инструкции по применению, на основе которых будет осуществляться промышленный выпуск разработанных препаратов.
Разработанные питательные среды для селективного выделения листерий апробированы в специализированных лабораториях: научно-консультативной лаборатории «Клинической микробиологии», лаборатории Перинатального центра и Муниципального родильного дома № 1, а также в бактериологической лаборатории РЦИБ г. Махачкала (Акты внедрения МЗ РД № 10-319 и № 10-320 от 17.09.10). Внедрение разработанных селективных питательных сред целевого назначения существенно пополнит спектр диагностических препаратов для практического здравоохранения и лабораторной службы страны.
По результатам проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Усовершенствование методов микробиологической диагностики листериозной инфекции». Материалы диссертации используются преподавателями в лекциях и на практических занятиях для студентов, аспирантов, ординаторов, врачей-бактериологов и слушателей курсов повышения квалификации Дагестанской государственной медицинской академии.
На защиту выносятся:
1. Сухая питательная среда для селективного выделения листерий на комбинированной основе из панкреатического рыбного гидролизата и пептона ферментативного, обеспечивающая высокие ростовые свойства и диагностическую эффективность препарата. Разработанная питательная среда по биологическим показателям не уступает зарубежным аналогам.
2. Состав модифицированной питательной среды (типа Оксфорд-агар) для изоляции листерий из клинического материала различного происхождения, обеспечивающая полноценный рост и биохимические реакции возбудителя листериоза, а также стабильность основных свойств среды и выделенной культуры.
3. Результаты изучения биологических показателей разработанного и усовершенствованного препаратов. Определение диагностической ценности разработанных сред.
4. Существует зависимость между частотой выделения возбудителя из патологического материала, чувствительностью используемой питательной среды и выбранным методом для диагностики листериоза.
Апробация материалов диссертации. Материалы по теме диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» Санкт-Петербург, 2008 г.; IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2008 г.; 2-й Всероссийской Научно – практической конференции «Антибиотикорезистентность и антимикробная химиотерапия», Махачкала, 2008 г.; на XV, XVI и XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2009-2010 гг.
Публикации. Основные положения диссертации отражены в 19 печатных работах, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах, содержит 76 отечественных и 136 иностранных источника, иллюстрирована 44 таблицами, 10 рисунками и состоит из введения, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений и приложения.
