Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1. Физико-географическая характеристика мест исследования 11
1.1.1. Краткое описание Астраханской области 11
1.1.2. Краткое описание республики Татарстан 13
1.2. Применение системного анализа к информационным технологиям управления качеством воды 15
1.3. Анализ химических мутагенов водной среды, опасных для человека 29
Глава II. Материал и методы 34
2.1. Метод «Мёллер-5» - метод учета частоты рецессивных летальных мутаций, сцепленных с половой Х-хромосомой 35
2.2. Метод «ЯМР-релаксации» 49
2.3. Метод биометрической обработки на основе моделирования 58
Глава III. Результаты и обсуждения. Анализ исходной экспериментальной информации о времени релаксации спин-спинового и спин-решеточного взаимодействия электронов проб-образцов факторов окружающей природной среды 78
Глава IV. Результаты экспериментального моделирования прямой и обратной калибровочной зависимости между средними значениями времени релаксации взаимодействия электронов проб-образцов водной среды и уровнем мутагенной активности их загрязнений 107
Глава V. Анализ перспектив внедрения инструментального физико-химического метода экспресс-диагностики качества факторов окружающей природной среды 119
5.1. Сравнительная экономическая оценка двух методов («Мёллер-5» и «ЯМР-релаксации») определения уровня мутагенной активности за грязнений проб-образцов водной среды 120
5.2. Эколого-экономическое обоснование целесообразности практического внедрения информационных основ («биочипов») функциональной термодинамической методологии экспресс-диагностики качества на базе приборов, работающих по принципу импульсного, когерентного ЯМР-спектрометра 137
5.3. Современные информационные технологии, как основа Инновационно- образовательной программы, основанной на применении современных физико-химических и молекулярно-генетических приборов исследования 145
Заключение 157
Выводы 158
Научно-практические рекомендации 160
Список литературы 161
- Физико-географическая характеристика мест исследования
- Метод «Мёллер-5» - метод учета частоты рецессивных летальных мутаций, сцепленных с половой Х-хромосомой
- Результаты и обсуждения. Анализ исходной экспериментальной информации о времени релаксации спин-спинового и спин-решеточного взаимодействия электронов проб-образцов факторов окружающей природной среды
Введение к работе
На рубеже двух тысячелетий сложившаяся тяжелая эколого-генетическая
обстановка, угнетающая здоровье населения городов является первоочередным вопросом, требующая немедленного решения.
Одним из основных направлений государственной политики в области экологической безопасности является получение достоверной информации о состоянии окружающей среды и совершенствование информационной системы управления природоохранной деятельности и охраны здоровья людей.
К настоящему времени только в водной среде выявилось более 5 млн. химических веществ, большинство из которых обладает мутагенным, канцерогенным и тератогенным эффектом. Более 150 тыс. из них это высокомолекулярные (60 000 и более D) поллютанты, вызывающие образование антител («причина») и необратимое нарушение процессов иммунитета («следствие»). При этом одним из основных механизмов защиты факторов окружающей природной среды и живых форм от загрязнений в настоящее время и ближайшее будущее является их ПДК (предельно допустимая концентрация). На данный момент она разработана только для 1 600 химических веществ и это без учета синергизма.
Всё это свидетельствует о катастрофическом положении в экологии, медицине, пищевой биотехнологии, а также биотехнологии в целом требует скорейшего разрешения проблем защиты факторов окружающей природной среды, особенно тех, которые связаны со здоровьем людей, от отрицательных не только антропогенных, но и тропогенных, т.е. биотических и абиотических воздействий (Семенов и др., 1999, 2001; Лукьяненко и др., 2000, 2002; И.Л. Ахиянц, 2003; М.А. Александрова, 2004; Якубов и др., 1999, 2004, 2005).
Без скорейшей разработки и практического внедрения более совершенных, научно-обоснованных основ информационных технологий экспресс-методов диагностики качества факторов окружающей природной среды, поставить более тщательный и прочный заслон росту загрязнений водной среды, напитков, продуктов питания и другой исходной продукции (товаров) химиче-
скими веществами-мутагенами крайне маловероятно и практически бесперспективно.
Целью нашей работы является разработка информационных основ функциональной, термодинамической методологии экспресс-диагностики качества факторов окружающей природной среды на нанотехнологическом уровне (уровне взаимодействия электронов) проб-образцов водной среды за счет моделирования прямой и обратной зависимости между временем релаксации спин-спинового (Т2) и спин-решеточного (Tj) взаимодействия электронов (сек"1) и уровнем мутагенной активности загрязнений (%), определенного методом «Мёллер-5». Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи: 1. Экспериментально установить время релаксации спин-спинового (Т2), спин-решеточного (Ті) и их средних значений [(Т2+Т])/2] взаимодействия электронов проб-образцов дистиллированной, природной (р. Волга, р. Казанка), водопроводной (г. Астрахань, г. Казань) воды, «чистой» и с добавлением серы («А» - образец серы с газоконденсатного комплекса (условно чистая), «В» - образец серы, со станции Астрахань-И). 2. Проанализировать в экспериментальных условиях с помощью метода «ЯМР-релаксации» и метода «Мёллер-5» прямую и обратную калибровочную зависимость между временем релаксации Т2 и Tj (сек ) взаимодействия электронов проб-образцов воды и уровнем мутагенной активности загрязнений (%) данных проб-образцов. 3.Рассчитать экономическую эффективность практического внедрения молекулярно-генетического метода экспресс-диагностики качества водной среды на базе применения стационарного автоматизированного прибора «ЯМР-релаксации», сконструированного в Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина. 4. Обосновать эколого-генетическую целесообразность скорейшего внедрения в практику экологии, медицины, рДНК-биотехнологий, нефтегазового комплекса и т.д. функциональной, термодинамической методо-
логии экспресс-диагностики качества на молекулярно-генетическом уровне на базе применения трех разновидностей приборов, позволяющих фиксировать время релаксации спин-спинового, спин-эхо, спин-решеточного взаимодействия электронов проб-образцов. Данные приборы работают по принципу импульсного когерентного ЯМР-спектрометра:
a. Специально сконструированного стационарного прибора в лабо
ратории «Ядерно-магнитного резонанса» Казанского государст
венного университета им. В.И. Ульянова-Ленина;
b. Стационарного, автоматизированного, серийного прибора ЯМР-
релаксометра Minispec mq фирмы «Bruker Optic GmbH» (Германия);
c. Портативных переносных приборов «ЯМР-релаксации», рабо
тающих с учетом спин-эха электронов проб-образцов воды, при
анализе их на выявление времени релаксации спин-спинового
взаимодействия электронов.
5.Результаты экспериментальной оценки эффективности внедрения накопителя (активированный уголь), в качестве методического приема сбора исходного материала для измерения времени релаксации взаимодействия электронов проб-образцов (сек"1) и уровнем мутагенной активности загрязнений данных исходных проб-образцов (%).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Установить экспериментально-опытным путем средние значения времени релаксации спин-спинового (Тг) и спин-решеточного (Ті) взаимодействия электронов проб-образцов водной среды: дистиллированной, а также природной и водопроводной из гг. Астрахани и Казани, в которых содержались образцы серы (1:100) из двух мест отбора: «А» - Аксарайск и «В» - Астрахань-П по формуле: [(Т2+Ті)/2], (сек"1) или (мсек'1). Проанализировать результаты анализа средних значений времени релаксации электронов проб-
образцов трех марок пива «Красный Восток», «Балтика №3» и «Толстяк» с различными сроками хранения: 1 и 4 дня.
Промоделировать результаты экспериментальных данных прямой и обратной зависимости между временем релаксации взаимодействия электронов, полученных с помощью стандартизированного стационарного прибора ЯМР-релаксации, сконструированного в Казанском государственном университете и уровнем мутагенной активности (%) проанализированных проб-образцов, полученных с помощью метода «Мёллер-5» (метод учета частоты рецессивных летальных мутаций, сцепленных с половой Х-хромосомой).
Дать сравнительную экономическую оценку двух методов (прямого -«Мёллер-5» и косвенного - «ЯМР-релаксации») определение уровня мутагенной активности загрязнений факторов окружающей природной среды.
Обосновать эколого-экономическую целесообразность скорейшего внедрения информационных основ функциональной, термодинамической методологии экспресс-диагностики качества с использованием приборов, работающих по принципу импульсного когерентного ЯМР-спектрометра.
Рассмотреть возможность использования информационной технологии функциональной, термодинамической методологии экспресс-диагностики качества как основы Инновационно-Образовательной Программы, разработанной в АГТУ, в основе которой лежит применение современных физико-химических и молекулярно-генетических приборов исследования (в частности ЯМР-релаксометр Миниспек эм-кью).
Новизна проведенных исследований связана еще и с тем, что нами впервые разработан и применен скрининг метод выявления загрязняющих веществ проб-образцов, содержащих загрязняющие вещества, обладающих эффектами мутагенеза, канцерогенеза и тератогенеза трех порогов-уровней, основанный на показателях времени релаксации продольного (Т2) и поперечного (Ті) взаимодействия электронов, имеющие три уровня воздействия:
1) условно допустимый, 2) условно обратимый, 3) необратимый. Данные разработки способствуют установлению надежного заслона против отрицательных антропогенных воздействий на окружающую природную среду, а, следовательно, и на среду обитания человека.
Теоретическая ценность работы связана с тем, что разработан показатель функционального подхода к решению проблемы экспресс-диагностики эколого-генетической оценке в конкретно заданном регионе-водоеме и т.д. и качества продукции на молекулярно-генетическом уровне, уровне взаимодействия электронов (протонов) активного растворителя всего живого - воды.
Практическая ценность. Данная работа позволила выявить и научно-практически обосновать не только три порога мутагенности, канцерогенно-сти и тератогенности, но и средний показатель времени релаксации взаимодействия электронов проб-образцов, как спин-спинового, так и спин-решеточного взаимодействия, который не должен быть ниже 2,0 сек"1.
С помощью специально сконструированного прибора «ЯМР-релаксации», работающего по принципу импульсного когерентного ЯМР-спектрометра, впервые нами выявлены показатели порогового времени релаксации взаимодействия электронов (протонов) проб-образцов воды. Это:
I. Мутагенность:
2,5+2,0, сек"1, - первый порог (условно допустимый);
2,0+1,5, сек"1, - второй порог (условно обратимый);
1,0+0,5, сек"1, - третий порог (необратимый); И. Канцерогенность:
1,5+1,0, сек'1, - первый порог (условно допустимый);
0,9+0,7, сек'1, - второй порог (условно обратимый);
0,7+0,5, сек"1, - третий порог (необратимый); III. Тератогенность:
1) 1,3+1,0, сек"1, - первый порог (условно допустимый);
0,95-^0,70, сек"1, - второй порог (условно обратимый);
0,3-Ю,4, сек"1, - третий порог (необратимый);
При этом третий порог, как и первые два, связан с нарушением процессов жизнедеятельности имеющих необратимый характер, ведущий к летальному исходу.
Физико-географическая характеристика мест исследования
Астраханская область расположена на крайнем юго-востоке европейской
части России, в Прикаспийской низменности, вдоль р. Волга и занимает территорию в 44 тыс. кв. км. Область является приграничным регионом: общая протяженность сухопутной границы составляет 1 810,2 км, в том числе протяженность морской береговой линии - 298 км.
На востоке Астраханская область граничит с Казахстаном, на севере и северо-западе - с Волгоградской областью, на западе - с Калмыцкой Республикой (Хальмг Тангч), на юге и юго-востоке омывается водами Каспийского моря. Площадь области равна 44,1 тыс. квадратных километров.
Площадь региона - 44,1 тыс. км2. Водой занято 10% территории. Общее количество рек в дельте Волги превышает 900. Протяженность Волги в пределах области составляет свыше 400 км. На территории региона также имеется более 700 соляных озер и 1 300 солончаков. Климат области континентальным, несмотря на близость моря, средняя температура 9,5С, максимальная 42С, минимальная -30С. Около 70% территории региона занимают пустыни и опус-тыненные степи, разделенные широкой полосой лугов и кустарников.
Регион разделен на 11 административных районов. В области насчитывается 6 городов (Астрахань, Ахтубинск, Знаменск, Камызяк, Нариманов, Хара-бали), 12 поселков городского типа и более 400 сел. Административным центром является г. Астрахань.
Транспортные магистрали в области представлены железными и автодорогами, водным и воздушным пространством. Сеть железных дорог составляет свыше 600 км, автодорог - 3 тыс. км, водных путей - до 1,5 тыс. км. Порт Оля превращен в международный морской порт.
Основу экономики края составляют: добыча полезных ископаемых (газ, нефть, сера, соль и др.), рыбная промышленность и соответственно судостроение и судоремонт, сельское хозяйство (овощеводство, садоводство и бахчеводство). Есть ряд предприятий химической промышленности, машиностроения, легкой промышленности, стройиндустрии.
Астраханская область входит в состав Южного федерального округа и относится к Поволжскому экономическому району.
Расположение Астраханской области на перекрестке торговых путей создало в регионе хорошо развитую транспортную инфраструктуру. Астраханская область является стратегически важным транспортным узлом, где пересекаются Каспийские морские и Волжские речные пути с железнодорожными и автомобильными трассами России. Астраханский транспортный узел расположен на кратчайшем пути, связывающем Европу через Россию со странами Западной и Средней Азии, Индией и Пакистаном, странами Индийского океана.
Астраханская часть Приволжской железной дороги связывает Астрахань с другими областными центрами России и Северным Кавказом. Большое значение в транспортной инфраструктуре при этом имеют автомобильные трассы -Астрахань - Москва, Астрахань - Элиста, Астрахань - Махачкала и Астрахань -Красный Яр - Атырау.
Татарстан расположен в центре Российской Федерации на Восточноевропейской равнине, в месте слияния двух крупнейших рек - Волги и Камы. Казань находится на расстоянии 797 км к востоку от Москвы.
Общая площадь республики составляет 67 836,2 кв.км. Протяженность территории - 290 километров с севера на юг и 460 километров с запада на восток. Границ с иностранными государствами Татарстан не имеет.
Территория республики представляет собой равнину в лесной и лесостепной зоне с небольшими возвышенностями на правобережье Волги и юго-востоке республики. 90% территории лежит на высоте не более 200 м над уровнем моря.
Более 16% территории республики покрыто лесами, состоящими из деревьев преимущественно лиственных пород (дуб, липа, береза, осина), хвойные породы представлены сосной и елью. Местная фауна представлена 430 видами позвоночных животных и сотнями видов различных беспозвоночных.
Климат - умеренно-континентальный. Иногда случаются засухи. Средняя температура января (самый холодный месяц) -14С, июля (самый теплый месяц) +19С. Среднее количество осадков от 460 до 520 мм. Вегетационный период составляет около 170 суток.
Почвы отличаются большим разнообразием - от серых лесных и подзолистых на севере и западе до различных видов черноземов на юге республики (32% площади).
Метод «Мёллер-5» - метод учета частоты рецессивных летальных мутаций, сцепленных с половой Х-хромосомой
Материалом для данной работы служили пробы воды (природной и водопроводной) из разных мест отбора, в частности вода водопроводная и природная (р. Волга) г. Астрахань, вода водопроводная и природная (р. Казанка) г. Казань (табл. 1).
Всего было проанализировано 5520 проб-образцов. Примечание: - в общее число проанализированных проб-образцов входят образцы, с помощью которых были построены прямые и обратные калибровочные модели зависимости между временем релаксации взаимодействия электронов проб-образцов (мсек ) и уровнем мутагенной активности их загрязнений (%). - здесь приводятся результаты сравнительного ретроспективного анализа проб-образцов воды, используемой в биотехнологическом процессе производства пива двух марок пива: «Красный Восток» (г. Казань) и «Балтика №3» (г. Санкт-Петербург).
В качестве критерия мутагенного действия загрязнений водных объектов выбрано изменение частоты рецессивных, сцепленных с половой (X) хромосомой, летальных мутаций, возникающих при воздействии загрязнений факторов среды на самцов дикого типа (Normal).
Метод учета этого типа мутаций был разработан основоположником радиационной генетики Г. Меллером (1927), синтезировавшим линию СЕВ (Bredges, Brehme, 1944). В последнее время для тех же целей широко используется другая, созданная Г. Меллером линия, называемая в мировой литературе Меллер-5, синонимы М-5, Base, ywa (Lindsley, Ytrell, 1967). Самцы и самки последней flHHHHecTep-(ywa) несут Х-хромосому (половую хромосому In (I) SCsllSC sysc sc3"). Эта хромосома содержит две инверсии - In (I) SC SC H In (1)S, а также маркирована мутантными генами: scute - (SC, в данном случае дупликация этого участка SCsl,SCsr), white - apricot (wa) и yellow (у). Инверсия In (1) SCsllSCsr, захватывает почти всю хромосому. Левый ее разрыв расположен дистально, а правый - крайне проксимально, рядом с центромерой. Инверсия In (1) S, захватывает среднюю треть Х-хромосомы, лежит внутри первой большой инверсии. Благодаря наличию инверсий, кроссинговер между этой хромосомой и хромосомой с обычной последовательностью генов практически полностью подавлен. Рецессивная мутация SC приводит к отсутствию щетинок на скутелломе; Wa - рецессивный ген, обуславливающий абрикосовую окраску глаз; рецессивный ген Y - обуславливает в гетерозиготе (Y/+) дикий тип (цвет) тела и в гомозиготе (Y/Y), и в геми-зиготе (-/У) желтый цвет тела.
Когда линия Меллер-5 используется для обнаружения рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций, часто говорят о применении метода Мёллер-5. Говорят также о самках и самцах Мёллер подразумевая, что соответствующие самцы в гомозиготе, а самки в гомозиготе несут Х-хромосому Мёллер-5 mniyw3.
Опытные самцы нормальной линии дрозофилы скрещиваются с самками М-5. В первом поколении получается самок (Y/+), несущих в гетерозиготе X-хромосому М-5 и обработанную Х-хромосому самца, и самцов, несущих хромосому М-5 в гемизиготе.
Поскольку кроссинговер между опытной нормальной хромосомой и хромосомой М-5 заперт, то рецессивная леталь (если она возникла) не может переместиться из опытной хромосомы в хромосому М-5. Это позволяет вывести опытную хромосому в гемизиготное состояние.
Для этого самок F] скрещиваем с самцами М-5. Это могут быть самцы Fb но лучше взять самцов, хромосомы которых не были подвергнуты воздействию загрязнений, из линии М-5, постоянно разводимой в лаборатории. Дело в том, что самцы Fi несут один набор опытных аутосом и опытную Х-хромосому. Если эти хромосомы содержат перестройки или обработка загрязнениями привела к потере Х-хромосомы или ее части, то выход потомства в F2 будет резко снижен или самцы полностью стерильны. Кроме того, нельзя исключить, что проявление рецессивных сцепленных с полом леталей в F2 может оказаться несколько иным на фоне обработки аутосом и Y-хромосомы. Однако, при постановке наших экспериментов в рамках установления уровня мутагенной активности загрязнения водных объектов мы предпочитали, все-таки, брать самцов М-5 из \, чтобы избежать отбор неоплодотворенных самок в F2 и не увеличивать количество скрещиваний Р.
Поскольку речь идет о тестировании в F2 вполне определенной обработанной Х-хромосомы, которую несет данная самка, в пробирку F2 помещаем одну самку. Самцов лучше взять несколько (2-3), чтобы гарантировать оплодотворение. Если обработанная Х-хромосома у данной самки не несет рецессивную сцепленную с полем летальную мутацию, то во втором поколении появятся самки ywa и у\И+, а также самцы ywa и самки фенотипически нормальные, несущие в гемизиготе обратную Х-хромосому. Если обратная X-хромосома у данной самки содержит рецессивную сцепленную с полом летальную мутации, то во втором поколении нормальные самцы не появятся, так как в гемизиготе появится эффект рецессивной сцепленной с полом летали.
Результаты и обсуждения. Анализ исходной экспериментальной информации о времени релаксации спин-спинового и спин-решеточного взаимодействия электронов проб-образцов факторов окружающей природной среды
В данной главе рассмотрены вопросы сравнительного анализа мутагенной активности загрязнений факторов окружающей природной среды, таких, как пробы-образцы водной среды: природная вода р. Волга (г. Астрахань) и р. Казанка (г. Казнь); водопроводная вода (г. Астрахань, г. Казань); пробы воды с добавлением серы и без. Это было необходимо для экспериментального выявления мутагенного эффекта влияния серы из различных источников ее первоначального получения.
Данные пробы были исследованы косвенным методом «ЯМР-релаксации (регистрация времени релаксации спин-спинового Тг и спин-решеточного Ті взаимодействия электронов проб-образцов воды с добавлением серы и без из двух мест их получения: «А» - пос. Аксарайск, «В» - сера, собранная вдоль ж/д полотна станции Астрахань-П), и прямым методом «Мёлер-5» (метод учета частоты рецессивных летальных мутаций, сцепленных с половой X-хромосомой эукариот).
Результаты изучения мутагенной активности загрязнений проб-образцов водной среды с серой и без как прямым, так и косвенным методом отражены в разделе 3.1.
Экспериментальные данные изучения мутагенной активности загрязнений проб-образцов пива трех марок: «Красный Восток», «Балтика №3» и «Толстяк», в зависимости от срока их хранения приведены в разделе 3.2.
Одним из аспектов экспериментального изучения мутагенной активности проб-образцов водной среды как прямым («Мёллер-5», %), так и косвенным («ЯМР-релаксации», сек"1) методами служило не только выявление разницы между пробами природной и водопроводной воды (в зависимости от мест отбора - г. Астрахань, г. Казань) но и изучение мутагенного эффекта серы при его наличии в различных пробах-образцах воды как серой «А», так и с серой «В».
Крайне интересным вопросом при данном анализе экспериментальных данных главы 3 (раздел 3.2) служил факт не только выявления достоверной разницы по уровню значений времени релаксации спин-спинового и спин-решеточного взаимодействия электронов проб-образцов пива трех марок, но и факт влияния срока хранения (1 и 3 дня после открытия) на показатели значений времени релаксации.
Все эти трехкратные серии имели трехкратную повторность. Всего было обработано и проанализировано около 2 тыс. проб-образцов окружающей природной среды (см. гл. 2 «Материал и методы»). Таким образом, при экспериментальном изучении данных проб-образцов, приведенных в таблице 1, в период с 2003 по 2006 гг было обработано и изучено 21-3-30=1890 проб-образцов.
Таблица 2 Исходные экспериментальные данные анализа времени релаксации взаимодействия электронов проб-образцов методом «ЯМР-релаксации», полученные на стационарном приборе ЯМР-релаксации (Казанский государственный университет, лаборатория «ЯМР», (зав. лабораторией д.х.н., профессор Захаров А.В. и зам. зав. лабораторией, к.х.н., доцент Штырлин В.Г.)
Закон РФ об охране окружающей природной среды гласит, что все охраняемые законом объекты земной природы подразделяются на три категории: интегрированные, дифференцированные, особо охраняемые. К интегрированным относится окружающая природная среда, к дифференцированным - отдельные природные объекты - земля, недра, воды, леса, иная растительность, атмосферный воздух, животный мир, генетический фонд, природные ландшафты, остальные объекты - особо охраняемые.
Понятие «окружающая природная среда» складывается из понятий природы и окружающей человека среды. Под «природой» действующее законодательство (национальное и международное) все больше «понимает» природную среду в узком смысле этого слова, как объективную реальность, существующую независимо от сознания человека, как следствие эволюционального развития материального мира и состоящую из естественных экологических систем. В данном понимании это естественная среда обитания человека, мало тронутая или практически не измененная хозяйственной деятельностью человека.
Под окружающей человека средой понимается та часть естественной среды, которая преобразована в процессе антропогенной деятельности человека, состоящая в органическом единстве естественных, модифицированных, трансформированных экологических систем. Вместе с природой и окружающей средой окружающая природная среда является земной природой, внутри которой проживает и действует человек.
Для внешних и внутренних границ охраняемой государством окружающей природной среды характерны два признака: возможность антропогенной деятельности влиять на состояние окружающей природной среды и здоровье человека; объективная способность правого вмешательства в природоохраняемые процессы.
