Введение к работе
, актуальность проблемы
Прогресс в изучении биологии микроорганизмов в значительной мере связан с развитием генетических и молекулярно-биологических исследований. Результаты их в последние годы на моделях возбудителей инфекционных заболеваний существенно расширили наше представление о роли отдельных детерминант, имеющих отношение к реализации патогенности, их первичной структуре и генетической организации, механизмах патогенеза и формирования антибиотикоустойчивости микроорганизмов, что имеет основополагающее значение для разработки эффективных средств профилактики, лечения и диагностики инфекций.
В перечне опасных инфекционных заболеваний мелиоидоз и сап всегда занимали место экзотических инфекций с ограниченным ареалом распространения (Илюхин, 1985, Беляков и др., 1990; Beeching et al., 2000). В России, как и в других странах СНГ, не было зарегистрировано до сих пор ни одного достоверного случая мелиоидоза, но существуют эндемичные очаги в странах Восточной, Средней и Юго-Восточной Азии (Иран, Индия, Турция, Вьетнам, Таиланд, Сингапур, Китай и др.), с которыми они имеют обширные экономических и культурные контакты (Dodin, Galimand, 1986; Galimand, Dodin, 1982; Kanai, Deysirilert, 1988; Yap, 1991; Li et al., 1994; Suputtamongkol et al., 1994; Lim, 2004; Rolim et al., 2004)
В 70-х годах прошлого века произошло существенное изменение точки зрения на географию и эпидемиологию этой инфекции (Dodin, Ferry, 1974; Pourtaghva et al., 1975; Dodin, Galimand, 1976). Заболевание мелиоидо-зом людей и животных и выделение культур Burkholderia pseudomallei из внешней среды в Австралии, Франции, Италии, странах Центральной и Южной Америки показали всю серьезность проблемы его диагностики и лечения при почти непредсказуемых последствиях завоза возбудителя в страны с умеренным климатом (Ashdown, 1979; Galimand, 1982; Bremmelgaard et al., 1982; Беляков и др., 1990; Dance, 2004). Повышенное внимание мировой медицинской общественности к проблеме мелиоидоза подчеркивается проведением с интервалом в 3 года международных конгрессов в Бангкоке (1998), Перте (2001) и Сингапуре (2004).
Burkholderia mallei вызывает тяжелое инфекционное заболевание у человека и широкого круга животных. "В отличие от мелиоидоза нозоареал сапа существенно сузился и прежде широко распространенный во Франции, Германии и России, в дальнейшем был практически ликвидирован. Но в некоторых из стран, в частности, Турции, Иране, Монголии и Италии, продолжает регистрироваться (Илюхин, 1985, Мельников, 1987). Заболеваемость сапом людей отмечается редко. Большие эпидемии не наблюдаются.
Учитывая высокую инфекциозность возбудителей мелиоидоза и сапа при аэрогенном заражении, формировайМ'Шжельгх Форм инфекций, трудности их диагностики и высокую летальнос^ц^де^е^хчита&ся с мнением
\. о» sofW^/-'
отечественных и зарубежных специалистов, рассматривающих возможность применения B.pseudomallei и В.mallei в качестве биологического оружия и потенциальных агентов биотерроризма категории В (Тихонов, Липницкий, 2000; Christopher et al., 1997; Dance, 2000; Rotz et al, 2002). He являясь для России эндемичными, мелиоидоз и сап включены постановлением Правительства РФ в «Перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих».
К буркхольдериям, имеющим медицинское значение, относят также B.cepacia и B.thailandensis - бактерии, генетически и фенотипически близкие к возбудителям сапа и мелиоидоза. B.cepacia может вызывать оппортунистические заболевания у больных с иммунодефицитными состояниями, осложнять тяжелые инфекционные процессы у человека и формировать внутри-больничные инфекции (Илюхин, 1985, Govan et al., 1996; Holmes et al., 1998). Сведения о выделении B.thailandensis от больных людей отсутствуют. Однако культуры B.thailandensis, выявленные во внешней среде эндемичных территорий, практически неотличимы от возбудителя мелиоидоза при использовании стандартных микробиологических схем и иммунологических тестов, что может приводить к ложноположительной диагностике.
Возбудители мелиоидоза и сапа достаточно долго оставались в числе сравнительно малоизученных. Методические приемы работы с нуклеиновым материалом, как хромосомным, так и внехромосомным, разработаны не были. Публикации, непосредственно относящиеся к генетике возбудителей сапа и мелиоидоза, касаются, прежде всего, работ по получению у обоих видов маркированных штаммов, а также изучению генетической трансформации и коньюгации (Ряпис, 1979; Шиповская, 1983; Абаев и др., 1992; Меринова, Сеймова, 1992; Меринова, 1997). Рядом авторов показана возможность конь-югационного переноса в клетки возбудителей сапа и мелиоидоза RP4 и некоторых других плазмид Р-1 группы несовместимости (Агеева, Меринова, 1986; Анищенко, Меринова 1992). В последние годы появились первые публикации о клонировании генетического материала возбудителя мелиоидоза (Абаев и др., 1997; Cheung et al., 2002; Chin et al., 2004). Однако системы клонирования на представителях патогенных буркхольдерий и возможность использования для этих целей известных векторных молекул только апробируются. Исследования собственных плазмид возбудителя мелиоидоза были начаты в Волгоградском НИПЧИ (Петере, 1982). Единичные публикации появившиеся позже о выявлении или невыявлении плазмидных репликонов у возбудителя мелиоидоза, не давали представления о закономерностях их распространения и функциональной значимости.
Молекулярно-генетические методы, влючающие гибридизацию нуклеиновых кислот, плазмидный анализ, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), секвенирование геномов и др., находят все большее применение для анализа микроорганизмов и разработки современных средств их идентификации (Блохина и др., 1992; Антонов, 1995; Rosselo-Mora, 2001). ДНК-ДНК гибридизация, сводящаяся к определению сходства нуклеотидных последова-
тельностей, по-прежнему считается одним из наиболее результативных как в решении спорных вопросов систематики, так и при установлении таксономического положения трудно идентифицируемых обычными методами штаммов. Существенный прорыв в изучении буркхольдерий намечается в связи с секвенированием их геномов (Jenks, 1998; Chong et al., 2004; Shazleen et al., 2004). Проведенные исследования показали наличие у возбудителей мелиоидоза и сапа двух хромосом с существенным функциональным разделением генов между ними. Анализ нуклеотидных последовательностей буркхольдерий выявил множество гомологичных участков у B.pseudomallei и В.mallei, отсутствующих у B.thailandensis (Nierman et al., 2004; Holden et al., 2004). Сравнительное исследование вирулентных и авирулентных культур позволило определить набор генов, потенциально имеющих отношение к вирулентности, что открывает новые перспективы в изучении и понимании генетических механизмов реализации патогенности возбудителей мелиоидоза и сапа.
Рассматривая современные методы идентификации буркхольдерий, следует прежде всего отметить ПЦР, применение которой открывает новые возможности для установления эпидемиологических связей, прогнозирования эпидемической ситуации при изменении свойств циркулирующих штаммов (Гинзбург, Романова, 1998). Но, поскольку в большинстве работ по разработке ПЦР-систем для исследования различных клинических образцов при диагностике мелиоидоза и сапа отмечается низкая эффективность существующих амплификационных тест-систем (Bauernfeind et al., 1998; Haase et al., 1998; Kunakorn et al., 2000; Dance et al., 2004), очевидна актуальность их дальнейшего совершенствования и развития, тем более что до настоящего времени место ПЦР - анализа в общей схеме диагностики и индикации патогенных буркхольдерий не определено.
На основании изложенного, представляется необходимым проведение научных исследований, направленных на изучение геномной организации возбудителей данных инфекций, включая анализ внехромосомных реплико-нов, выявление детерминант, ответственных за реализацию патогенности, поиск видоспецифических последовательностей и разработку современных генотипических методов идентификации.
Настоящая диссертация содержит обобщенные материалы научно-исследовательских работ, выполненных в лаборатории молекулярной биологии Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в этих направлениях.
Цель работы заключалась в молекулярно-генетическом исследова-ниии B.pseudomallei и близкородственных видов с использованием гибриди-зационного, плазмидного, рестрикционного анализа, клонирования генетических детерминант и в разработке основ генетических методов идентификации патогенных буркхольдерий.
Задачи исследования:
1. Изучить уровень внутривидовой и межвидовой гомологии ДНК
буркхольдерий и оценить значение гибридизационного анализа в качестве
таксономического критерия.
-
Сконструировать многофункциональные плазмидные векторы, способные реплицироваться в клетках B.pseudomallei, В mallei, E.coli, B.subtilis, оценить их стабильность в этих видах микроорганизмов в зависимости от условий селекции.
-
Получить геномные библиотеки B.pseudomallei на основе плаз-мидных векторов и провести анализ рекомбинантных клонов E.coli с целью выявления генетических детерминант, имеющих отношение к реализации некоторых биологических свойств возбудителя мелиоидоза.
-
Осуществить поиск оптимальных методов плазмидного скрининга штаммов B.pseudomallei. Изучить плазмидный спектр штаммов возбудителя мелиодоза с оценкой стабильности наследования плазмид и возможности их использования в качестве маркеров для внутривидового типирования.
-
Разработать технику препаративного выделения плазмидных ДНК B.pseudomallei, провести гибридизационный, рестрикционный анализ и физическое картирование внехросомных репликонов микроорганизма.
6. Изучить возможность экспрессии критических плазмид
B.pseudomallei в близкородственных видах буркхольдерий: провести мобили
зацию плазмидных репликонов и охарактеризовать стабильность и феноти-
пические проявления их в рекомбинантных штаммах.
-
Осуществить клонирование фрагментов критических плазмид возбудителя мелиоидоза и провести анализ продуктов экспрессии в клетках E.coli с целью выявления генетических детерминант, имеющих функциональное значение.
-
Оценить эффективность метода генетической трансформации для идентификации патогенных буркхольдерий и значение анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) для внутривидовой дифференциации.
-
Разработать методические подходы к генодиагностике буркхольдерий с использованием ДНК-зондов на основе фрагментов криптических плазмид возбудителя мелиоидоза и полимеразной цепной реакции на основе последовательностей гена 23S рРНК.
Научная новизна:
Проведено молекулярно-генетическое изучение В pseudomallei и других представителей Burkholderia и разработаны подходы к идентификации патогенных буркхольдерий с использованием генотипических методов. На основании гибридизационного анализа установлен высокий уровень ДНК-гомологии B.pseudomallei, В.mallei и В thailandensis как свидетельство их таксономической близости. Филогенетическое родство данных видов под-
тверждается идентичностью их рекомбинационных систем, выявленной во взаимной генетической трансформации.
Впервые проведено изучение внехромосомных репликонов B.pseudomallei. Выделены и охарактеризованы четыре типа криптических плазмид возбудителя мелиоидоза, отличающихся размерами и профилями рестрикции. Плазмиды стабильно наследуются в клетках микроорганизма в процессе хранения и пассирования штаммов in vitro и in vivo, что открывает перспективы использования плазмидного анализа для внутривидового типи-рования культур.
Впервые показано, что плазмидные репликоны одного типа, выделенные из штаммов B.pseudomallei различного географического происхождения, имеют идентичные рестрикционные профили. Все типы плазмид обладают выраженной взаимной гомологией и гомологией с ДНК близкородственных буркхольдерий В.mallei и B.thailandensis, проявляя себя в реакциях гибридизации как хромосомная ДНК B.pseudomallei, что позволяет рассматривать их в качестве резидентных плазмид возбудителя мелиоидоза.
Впервые осуществлено физическое картирование плазмид возбудителя мелиоидоза рРМ1 и рСМ2. Путем маркирования и клонирования между 10-й и 12-й координатами физической карты криптической плазмиды рРМ1 локализована область начала репликации и впервые показана возможность функционирования огі-региона плазмиды возбудителя мелиоидоза в штаммах Exoli.
Впервые идентифицирована детерминанта криптической плазмиды рРМ1, локализованная между 12-й и 0-й координатами физической карты, ответственная за изменение белкового состава наружной мембраны, развитие множественной антибиотикорезистентности и формирование у рекомбинант-ного штамма E.coli капсулоподобной структуры. Установлено, что белки наружной мембраны рекомбинантных клонов, специфически взаимодействующие с иммуноглобулинами поликлональной сыворотки к клеткам B.pseudomallei, способны к ассоциации в высокомолекулярные формы.
Впервые в составе криптической плазмиды рСМ2 идентифицирован Hind III - фрагмент размером 2,471 т.п.н., детерминирующий в рекомбинант-ном штамме E.coli синтез белка с молекулярной массой -100 кДа, специфически взаимодействующий с иммуноглобулинами B.pseudomallei. Секвениро-вание и анализ с использованием программы BLAST показали наличие гомологии данного фрагмента с представленными в GenBank нуклеотидными последовательностями плазмидных репликонов pSB102 (AJ304453.1) и pIP02T (AJ297913.2), детерминирующими синтез TraS (САС79161.1) и TraR (САС82765.1) белков, соответственно.
При анализе геномной библиотеки B.pseudomallei, полученной на векторе pBR325, отобраны клоны, обладающие в клетках рекомбинантных штаммов E.coli внеклеточной протеазной и гемолитической активностями, а также внеклеточной продукцией мелиоидозных антигенов, выявляемых в реакциях иммунопреципитации и иммуноэлектрофореза фильтратов бульон-
ных культур рекомбинантных штаммов с очищенными IgG и поливалентной мелиоидозной сывороткой. С использованием мультиплексной ПЦР показано наличие в рекомбинантных штаммах дополнительного ампликона размером 375 п.н., что свидетельствует о структурной перестройки их геномов.
С помощью мобилизующей плазмиды RPl::TnlO впервые осуществлена передача криптических плазмид В pseudomallei рСМ2 и рСМЗ в штамм В. mallei Ц4, определены плазмидные профили и изучены отдельные феноти-пические свойства полученных культур. Показано опосредованное влияние криптических плазмид возбудителя мелиоидоза на вирулентность трансконьюгантов.
В репликоне рРМІ в пределах сайтов Pst I (5.4) - Bam HI (9.3) ее физической карты идентифицирован участок, обеспечивающий гомологичную ДНК-ДНК гибридизацию с геномами буркхольдерий. Находящийся в пределах данного участка Sal GI-фрагмент размером 0.4 т.п.н., испытанный в качестве ДНК-зонда и обнаруживший гомологию только с ДНК близкородственных микроорганизмов B.pseudomallei, В.mallei и В. cepacia, был проклониро-ван в составе фагового вектора М13тр18.
Практическая ценность:
Предложены методы скрининга штаммов B.pseudomallei на наличие внехромосомных репликонов и препаративного выделения плазмид возбудителя мелиоидоза, включенные в методические рекомендации «Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза», утвержденные 1 ноября 1994г. зам. председателя Госкомсанэпиднадзора России Онищенко Г.Г. и подтвержденные патентом на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам №2218401 от 10.12.2003 г.
Предложен метод идентификации бактериальных и морфологически измененных форм патогенных буркхольдерий, вошедший в практические руководства «Мелиоидоз. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998), «Сап. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998) и подтвержденный авторским свидетельством Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий № 1190638 от 16.07.82г.
Сконструирован ряд многофункциональных плазмидных векторов, способных реплицироваться в B.pseudomallei, В.mallei, E.coli, В subtil is, охарактеризована их стабильность в клетках указанных видов микроорганизмов в различных селективных условиях. Практическая значимость векторов подтверждена авторскими свидетельствами Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий № 298237 от 3.07.89 г и № 322767 от 2.01.91 г.
Разработана технология мобилизации мелиоидозных плазмид в В mallei и получен набор рекомбинантных штаммов возбудителя сапа, содержащих критические плазмиды рСМ2 и рСМЗ B.pseudomallei, предназначенных для изучения генетических детерминант и функциональной роли данных плазмид (Методические рекомендации «Применение мобилизации для пере-
дачи критических плазмид B.pseudomallei в гетерологичные виды», утвержденные директором Волгоградского научно - исследовательского противочумного института Тихоновым Н.Г. 20 апреля 1998 г.).
Отработаны системы клонирования и методы детекции генетических детерминант возбудителя мелиоидоза в кишечной палочке. Полученные рекомбинантные штаммы E.coli, экспрессируюшие отдельных хромосомные и плазмидные признаки B.pseudomallei, депонированы в государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб», а также поддерживаются в коллекционном центре живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.
На основе фрагмента плазмидной ДНК возбудителя мелиоидоза рРМ1 сконструирован рекомбинантный фаг М13РМ, являющийся продуцентом группоспецифического ДНК-зонда для идентификации буркхольдерий путем введении метки техникой достройки секвенационного праймера. Разработанный метод вошел в методические рекомендации: «Лабораторная диагностика, лечение и профилактика сапа», утвержденные 16 марта 1995 г. зам. председателя Госкомсанэпиднадзора России Онищенко Г.Г.; «Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза», утвержденные 23 сентября 1994 г. зам. председателя Госкомсанэпиднадзора России Онищенко Г.Г., а также в практические руководства «Мелиоидоз. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998), «Сап. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998).
Разработаны методические подходы к ПЦР-диганостике буркхольдерий, вошедшие в «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму» (Волгоград, 2004). Путем анализа гена 23 S рРНК проведены первичные исследования по поиску видо- и группоспецифических праймеров для выявления патогенных буркхольдерий.
Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета, а также на курсах профессиональной переподготовки «Диагностика особо опасных инфекций, индикация возбудителей особо опасных инфекций, санитарная охрана территории и противоэпидемическая защита населения», «Особо опасные инфекции для лаборантов противочумной системы Министерства здравоохранения РФ»; на курсах повышения квалификации «Противодействие биотерроризму» и «Клиническая микробиология», проводимых в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте.
Положения, выносимые на защиту
-
На основании современных молекулярно-генетических технологий, включающих гибридизационный, плазмидный, рестрикционный анализы, клонирование генетических детерминант, разработаны методические подходы к изучению геномов возбудителя мелиоидоза и родственных ему буркхольдерий В. mallei и B.thailandensis и созданию средств их идентификации и типирования.
-
Штаммы возбудителя мелиоидоза содержат четыре вида плазмид, отличающихся размерами и рестрикциоными профилями, стабильно наследующихся в процессе хранения и пассирования культур in vitro и in vivo. Данные внехромосомные репликоны можно считать резидентными для возбудителя мелиоидоза на основании идентичности профилей рестрикции плазмид одного размера, выделенных из штаммов В pseudomallei отдаленных географических регионов, отсутствия ДНК-гибридизации с гетерологичными видами микроорганизмов, выраженной гомологии всех внехромосомных репли-конов между собой, а также с ДНК В.pseudomallei и ДНК родственных буркхольдерий (при отсутствии в них плазмид).
3. Огі-регион плазмиды рРМ1 возбудителя мелиоидоза способен
функционировать в клетках кишечной палочки. Клонированная в E.coli по
следовательность ДНК плазмиды рРМ1, локализованная в пределах 12 и О
координат её физической карты, детерминирует в штаммах кишечной палоч
ки множественную резистентность к антибиотикам, формирование капсуло-
подобной структуры и синтез дополнительных белков наружной мембраны,
специфически взаимодействующих с мелиоидозной сывороткой.
-
Hind III - фрагмент, размером 2,471 т.п.н., плазмиды рСМ2 возбудителя мелиоидоза детерминирует в рекомбинантном штамме E.coli синтез белка с молекулярной массой -100 кДа, специфически взаимодействующего с иммуноглобулинами B.pseudomallei. Данный фрагмент обладает гомологией с представленными в GenBank нуклеотидными последовательностями плаз-мидных репликонов pSB102 и р1Р02Т, ответственными за синтез TraS и TraR белков.
-
Критические плазмидные репликоны рСМ2 и рСМЗ B.pseudomallei мобилизуются в штаммы близкородственного вида В.mallei коньюгатив-ными плазмидами Р1 группы несовместимости, стабильно наследуются в трансконъюгантах, как правило,-вместе с мобилизующими плазмидами, образуя в ряде случаев делеционные варианты и оказывая опосредованное влияние на вирулентность рекомбинантных штаммов возбудителя сапа.
-
Клонированные последовательности хромосомной ДНК B.pseudomallei обеспечивают рекомбинантным штаммам Е coli внеклеточную проте-азную и гемолитическую активности, а также внеклеточную продукцию ме-лиоидозных антигенов, выявляемую в реакциях иммунопреципитации, имму-ноэлектрофореза фильтратов бульонных культур рекомбинантных штаммов с очищенными IgG и поливалентной мелиоидозной сывороткой. Мультиплекс-
ная ПЦР обнаруживает в рекомбинантных штаммах дополнительный ампли-кон размером 375 п.н.
-
B.pseudomallei обладает высокой степенью ДНК-гомологии, а также сходством рекомбинационных систем с В mallei и В thailandensis. Феномен генетической трансформации, основанный на природной трансформабельно-сти возбудителя мелиоидоза, является эффективным методом идентификации B.pseudomallei, в том числе, в случаях латентного течения мелиоидозной инфекции, а также близкородственных буркхольдерий.
-
Фрагмент плазмиды рРМ1 возбудителя мелиоидоза, находящийся в пределах сайтов Pst I (5.4) - Bam HI (9.3) ее физической карты, обладает, гомологией с геномами буркхольдерий, выявляемой в ДНК-ДНК гибридизации. Рекомбинантный фаг М13РМ, содержащий Sal GI-фрагмент гомологичного участка криптической плазмиды, является продуцентом группоспецифиче-ского ДНК-зонда для идентификации буркхольдерий.
Апробация работы
Диссертация выполнена на основе 13 государственных плановых тем, в 9 из которых соискатель являлся научным руководителем. Основные результаты диссертации изложены в 45 опубликованных работах, в том числе в двух патентах, трех авторских свидетельствах, четырех коллективных монографиях и практическом пособии по подготовке врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. Материалы диссертации были представлены на 1-ой Всесоюзной конференции «Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология» (Москва, 1982), Российской научной конференции «Генетика и биохимия вирулентности особо опасных инфекций» (Волгоград, 1992), Российской научной конференции «Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней» (Ставрополь, 1993), 7-ом международном конгрессе «Бактериология и прикладная микробиология» (Прага, 1994), международном симпозиуме «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 1995), международной научной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова (Харьков, 1995), научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997), научно-практической конференции «Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории стран СНГ» (Саратов, 1998), научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария.» (Киров, 1998), научной конференции, посвященной 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии» (Оболенск, 1999), 1-й научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000), VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), научно-практическом симпозиуме в рамках международной конференции «Геномика, протеомика и
биоинформатика для медицины» (Москва, 2002), IV всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002), IV межгосударственной научно-практической конференции государств стран СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003). XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), на итоговых ежегодных научных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена в форме монографии на 279 листах машинописного текста, состоит из введения и 5 глав, включающих описание литературных данных и результаты собственных исследований, заключения и выводов. Работа содержит литературные ссылки и иллюстрации в виде 22 таблиц и 90 рисунков. Указатель литературы включает 312 источников.
