Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Лактобактерии как представители нормальной микрофлоры человека и основа пробиотических препаратов (обзор данных литературы) 10
1.1. Значение и функции нормальной микрофлоры человека, роль лактобактерий
1.2. Пробиотики 19
1.3. Лактобактерий как основа пробиотиков 25
1.4. Технологические аспекты производства пробиотиков на основе лактобактерий 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
2.1, Материалы... 37
2.2. Методы 41
ГЛАВА 3. Сравнительное изучение биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий
3.1. Биологические свойства штаммов 50
3.1.1. Активность кислотообразования 50
3.1.2. Адгезивные свойства штаммов 53
3.1.3. Устойчивость лактобактерий к биологическим жидкостям 55
3.1.4. Антагонистическая активность штаммов 57
3.1.5. Антибиотикочувствительность штаммов лактобактерий... 59
3.2. Технологические свойства производственных штаммов 61
3.2.1. Накопление биомассы лактобактерий при глубинном культивировании 61
3.2.2. Устойчивость лактобактерий к лиофильному высушиванию и стабильность в процессе хранения сухой культуры 63
3.3. Выбор состава бактериальной композиции 66
ГЛАВА 4. Технология и методы контроля комплексного препарата «лактобактерий-билс сухой» 70
4.1. Разработка технологии комплексного препарата 70
4.1.1. Приготовление маточной культуры 72
4.1.2. Реакторное культивирование лактобактерий 73
4.1.3. Получение бактериальной суспензии 75
4.1.4. Лиофильное высушивание 75
4.2. Методы контроля специфической активности комплексного препарата 77
4.2.1. Определение количества жизнеспособных клеток в дозе препарата 78
4.2.2. Определение активности кислотообразования 80
ГЛАВА 5. Сравнительная оценка биологической активности препарата лактобактерин-билс и препаратов-аналогов 82
5.1. Активность кислотообразования препаратов 82
5.2. Адгезивные свойства препаратов 84
5.3. Антагонистическая активность препаратов 86
5.4. Устойчивость препаратов к воздействию биологических жидкостей 90
5.5. Антибиотикочувствительность препаратов 91
ГЛАВА 6. Разработка лекарственных форм пробиотиков на основе лактобактерий ... 94
6.1. Особенности получения сухой биомассы лактобактерий для изготовления порошков, капсул, мазей и суппозиториев
6.2. Особенности получения мягких лекарственных форм пробиотиков
6.2.1. Изучение влияния мазевых основ на стабильность бактериального компонента
6.2.2. Стабилизация бактериальной взвеси при изготовлении суппозиториев с лактобактериями
Заключение
Выводы 124
Список литературы 125
- Значение и функции нормальной микрофлоры человека, роль лактобактерий
- Антагонистическая активность штаммов
- Разработка технологии комплексного препарата
- Антагонистическая активность препаратов
Введение к работе
Актуальность.
Вследствие несбалансированного питания, дефицита витаминов, микроэлементов, приема антибактериальных препаратов, а также под действием все увеличивающегося загрязнения окружающей среды потенциально опасными для живых организмов химическими соединениями происходит разрушение эволюционно сложившихся естественных микробиоценозов человека. Поскольку частота распространения дисбактериоза пищеварительного тракта среди россиян по некоторым оценкам достигает 90 %, очевидно, насколько важны исследования, направленные на создание препаратов, восстанавливающих микроэкологический баланс в организме (51,162).
Важная роль в лечении и профилактике дисбактериозов отводится пробиотикам, содержащим представителей нормальной микрофлоры человека, в том числе лактобактерии (164). Последние широко представлены на слизистых открытых окружающей среде полостей организма и в значительной степени определяют функциональную активность микробиоценозов данных биотопов (163). Лактобактерии являются постоянным объектом исследований в микробной экологии человека. Практическое использование их положительных свойств иллюстрируется многолетним опытом изготовления и применения отечественных биопрепаратов (лактобактерии, ацилакт, аципол). Клинические исследования открывают новые стороны позитивного воздействия этих препаратов на физическое и психологическое состояние человека, что позволяет расширять сферу их применения (117,118).
Основными направлениями прикладных исследований в области лактосодержащих пробиотиков являются: разработка новых препаратов с повышенной биологической активностью, новых лекарственных форм и оптимизация технологического процесса.
Эффективность пробиотических препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в состав препаратов. Повышение и расширение спектра биологической активности лактосодержащих пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных бактериальных композиций, включающих совместимые и взаимодополняющие штаммы. Указанное направление исследований предполагает реализацию потенциала известных производственных штаммов лактобактерий: Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90T-C4, L. acidophilus К3Ш24, L. acidophilus ЮОаш, L. acidophilus NKj.
Расширение сфер применения пробиотиков (акушерство и гинекология, стоматология, дерматология и др.) определяет необходимость создания лекарственных форм, адекватных новым способам аппликации. Такие фармакопейные формы как суппозитории, мази, кремы, порошки, капсулы и таблетки с лактобактериями, востребованы на фармацевтическом рынке и позволяют улучшить потребительские свойства лактосодержащих пробиотиков, которые, как правило, традиционно выпускаются в виде сухой биомассы во флаконах (ампулах). Исследования, направленные на разработку и усовершенствование технологий указанных фармакопейных форм препаратов на основе живых лактобактерий, являются актуальными для производства пробиотиков.
Цель настоящего исследования — изучение и реализация биологического и технологического потенциала известных производственных штаммов лактобактерий при конструировании комплексного пробиотического препарата.
В соответствии с поставленной целью решались следующие основные задачи:
Провести сравнительное изучение биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий, используемых для изготовления отечественных лактосодержащих пробиотиков.
Сконструировать бактериальную композицию комплексного препарата с учетом совместимости и анализа совокупности биологических и технологических свойств производственных штаммов лактобактерий.
Разработать способ получения комплексного препарата и методы контроля его специфической активности.
Исследовать in vitro биологическую активность комплексного препарата в сравнении с аналогами.
Изучить возможность и особенности использования различных способов стабилизации бактериальных культур при изготовлении лекарственных форм лактосодержащих пробиотиков.
Научная новизна исследований
На основе сравнительной оценки биологических и технологических
свойств, а также с учетом совместимости производственных штаммов лактобактерий сконструирована бактериальная композиция и разработан способ получения комплексного пробиотика «Лактобактерин-БИЛС сухой», обладающего высокой биологической активностью.
Изучено влияние различных ксеропротекторов на биологические свойства лактобактерий и технологические параметры лиофилизированной биомассы. Разработан способ получения лиофилизированной биомассы лактобактерий, пригодной для изготовления различных лекарственных форм (порошки, капсулы, мази, суппозитории и т.д.) пробиотиков, с использованием ксеропротектора, содержащего аэросил.
В качестве альтернативы лиофилизации разработан способ стабилизации жидкой бактериальной культуры штамма L. plantarum 8Р-АЗ, обеспечивающий
длительное сохранение жизнеспособности клеток и пригодный для изготовления мягких лекарственных форм лактобактерина.
Практическая значимость Разработан состав и технология комплексного пробиотического препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» в виде сухой биомассы во флаконах. В рамках доклинической оценки биологической активности препарата выявлены его преимущества по сравнению с аналогами (лактобактерином, ацилактом). Определены методы контроля специфической активности, предусматривающие раздельный количественный учет колоний-образующих единиц каждого компонента бактериальной композиции.
Предложена технология получения сухой бактериальной массы с биологическими и технологическими свойствами, удовлетворяющими требованиям крупносерийного производства различных лекарственных форм лактосодержащих пробиотиков. Способ получения сухой бактериальной массы включен в технологию препарата «Лактобактерин порошок».
На основе разработанного способа стабилизации жидкой бактериальной культуры получен препарат «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», соответствующий требованиям Фармакопейной статьи. Указанная технология внедрена в производство. Также разработан состав и способ получения мази с лактобактериями - «Эмулакт», технология которой предусматривает использование разработанного способа стабилизации.
По результатам работы получены патенты на изобретения: 1. Патент № 2200566 на изобретение РФ «Способ получения лактобактерина», приоритет от 26.07.01 г.
2. Патент № 2183963 на изобретение РФ «Мазь «Эмулакт» для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных гинекологических заболеваний и дисбактериозов», приоритет от 10.08.99 г.
Результаты научной работы отражены в нормативной документации:
ФСП «Лактобактерин-БИЛС сухой».
ФСП «Лактобактерин, суппозитории вагинальные».
ФСП «Лактобактерин порошок».
Экспериментально-производственный регламент «Лактобактерин-БИЛС сухой».
Изменение №1 к регламенту производства «Лактобактерин в свечах».
Регламент производства «Лактобактерин порошок».
Инструкция по применению препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой».
Инструкция по применению препарата «Лактобактерин порошок».
Положения, выносимые на защиту
Биологическая активность разработанного нового комплексного препарата на основе лактобактерий (L. plantarum 8Р-АЗ, L. acidophilus К3Ш24) существенно превосходит таковую препаратов-аналогов (лактобактерина, ацилакта).
Для получения сухой биомассы лактобактерий, пригодной для изготовления различных лекарственных форм пробиотических препаратов, целесообразно использование ксеропротектора, содержащего сахарозу, обезжиренное молоко и аэросил.
При изготовлении мягких лекарственных форм лактобактерина целесообразно применение способа стабилизации бактериальной культуры, основанного на использовании стабилизирующей системы, включающей
поверхностно-активные вещества и вещества, входящие в состав мазевых или суппозиторных основ.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Уфа, 2000; Научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы», Пермь, 2000; Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003. Диссертационная работа апробирована на заседании Научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Полученные результаты исследования защищены 2 Патентами на изобретения РФ.
Объем и структура работы
Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы и 7 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 262 литературных источника, из них 172 отечественных и 90 зарубежных авторов.
Значение и функции нормальной микрофлоры человека, роль лактобактерий
Нормальная микрофлора человека — это совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих тот или иной биотоп макроорганизма (5,23,43,163,192,195,206). Она является естественным защитным фактором от патологических воздействий (15,32,39,163,167,212,224).
Видовой состав нормальной микрофлоры человека разнообразен и зависит от месторасположения биотопа. Численный состав нормальной микрофлоры у взрослого человека достигает 104-1015, что превышает общее число всех клеток тканей и органов макроорганизма. Наиболее сложные по составу микробиоценозы располагаются в толстой кишке, носоглотке и ротовой полости. В пищеварительном тракте человека обнаружено более 500 видов микроорганизмов. Микрофлору кишечника здорового человека составляют преобладающие в количественном отношении (более 90 %) анаэробные и микроаэрофильные грам положительные и грамотрицательные аспорогенные формы бактерий, среди которых большой интерес представляют бифидо- и лактобактерии (32,40,45,76,77,86,89,93,111,163,179,189,214,224,232,235,246).
Лактобактерии в желудке обнаруживаются в количестве 10 -10 КОЕ/мл, в тонкой кишке — до 103-104, в толстой (в зависимости от возраста) — 10б-10 , при этом они колонизируют равномерно всю толстую кишку, кроме прямой. Наиболее часто у человека встречаются L. acidophilus, L. salivarius, L, fermentum, L. casei, L. plantamm, и L. brevis, которые образуют всевозможные сочетания (86,88). Биотопы вульвы и вагины также преимущественно населяют лактобактерии, являясь основной индигенной флорой. Микрофлора урогенитального тракта женщин фертильного возраста на 90-98% представлена лактобациллами, их состав разнообразен и насчитывает около 10 преимущественно облигатно анаэробных видов. Главные их представители — L. acidophilus, L. fermentum и L plantarum (11,39,40,45,70,86,87,88,89,93, 163,173,195,205,224).
Нормальную микрофлору здоровых людей подразделяют на резидентную (постоянную, облигатную, индигенную, аутохтонную) и транзиторную (временную, факультативную, случайную, аллохтонную) (11,45,163,195,214). Резидентная флора является источником биологически активных соединений: летучих жирных кислот, витаминов (группы В, К и Bi2, никотиновой, фолиевой, аскорбиновой кислот и др.), гормонов, антибиотиков и т. д. (15,18,39,45,66,92,163,173). К транзиторной микрофлоре чаще всего относят неферментирующие грамотрицательные палочки, так как бактерии данной группы являются свободно живущими и легко попадающими в макроорганизм из окружающей среды. Многие из них - сапрофиты, некоторые относятся к возбудителям оппортунистических инфекций (29,35,39,43,45,93,163,178,179, 192,195).
Представители нормальной микрофлоры присутствуют в макроорганизме в виде фиксированных с помощью определенных рецепторов микроколоний, заключенных в биопленку. Биопленка покрывает кожу и слизистые открытых полостей человека, выполняя сложную роль регуляции взаимоотношений между макроорганизмом и окружающей средой (5,15,16,39,164,224,232, 235,242). Биопленку, по мнению Б.А. Шендерова (164), можно рассматривать как «первичную мишень приложения любого попадающего обычным (непарентерапьньш) путем соединения, как структуру, первой вовлекаемую в процессы распознавания, метаболизации, абсорбции и транслокации как полезных, так и потенциально вредных агентов». Только, после нарушения данного неспецифического барьера инициируется включение всех последующих неспецифических и специфических иммунных и биохимических механизмов защиты макроорганизма (25,39,92,150,175,192).
Нормальную микрофлору рассматривают как своеобразный экстракорпоральный орган, благодаря которому любой субстрат, попадающий в организм естественным путем, в результате микробной трансформации превращается в промежуточный или конечный продукт, необходимый для участия в важнейших для организма жизненных функциях: регуляции газового состава, метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот, рециркуляции стероидных соединений и других макромолекул, водно-солевом обмене и т.д. (15,32,66,173,216). Она также участвует в детоксикации экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов, в утилизации непереваренных пищевых веществ и инактивации биологически активных соединений, выделяющихся с пищеварительными соками (5,15,108,163). Так, благодаря способности лактобактерий продуцировать кислоту, они не только участвуют в поддержании кислой среды биотопов, но и принимают активное участие в расщеплении непереваренных остатков пищи, способствуя более полному всасыванию питательных веществ, оптимизируя процесс пищеварения как у взрослых, так и у грудных детей с еще несовершенной ферментной системой (40,85,163,191). Замечена роль лактобактерий в снижении уровня холестерина в крови, в предупреждении продукции канцерогенов и в разрушении щавелевой кислоты, что препятствует образованию в организме оксалатов (11,87,140,163).
Нормальная микрофлора обладает морфокинетическим действием, выполняет мутагенную (антимутагенную) функцию, служит источником энергии для клеток хозяина и поставщиком генетического материала, хранилищем плазмидных и хромосомных генов (173), играет важную иммуногенную роль, влияя на общий пул иммуноглобулинов в организме (15,90,92,149,163). И, наконец, она обеспечивает колонизационную резистентность, препятствуя росту и размножению патогенных и условно патогенных микроорганизмов (256,257).
Термин «колонизационная резистентность» (КР) был введен впервые в научную литературу Van der Waaij D. (257). Под КР подразумевают совокупность механизмов, придающих индивидуальную и анатомическую стабильность нормальной микрофлоре и обеспечивающих предотвращение заселения организма хозяина посторонними микроорганизмами. КР - это суммарный результат, обеспечиваемый колонизацией эпителиальной зоны микробиотой, ее бактериостатическими и антиадгезивными эффектами, способностью стимулировать местный иммунитет (23,39,83,88,108,161, 171,175,187,188,198,206,212,213,226,239,244,245,256).
Антагонистическая активность штаммов
Производственные штаммы лактобактерий (препараты) проверяли на устойчивость к воздействию желудочного сока и желчи медицинской консервированной. Лиофилизированный штамм (препарат) регидратировали с помощью 0,9 % раствора натрия хлорида, восстанавливая объем, из которого он был высушен (препарат разводили из расчета 1 мл на 1 дозу). 1 мл полученной взвеси добавляли к 9 мл биологической жидкости (контроль - 0,9 % раствор натрия хлорида), выдерживали в термостате при 37 С в течение двух часов, затем определяли количество жизнеспособных клеток.
Изучение адгезивной активности Адгезию бактериальных культур и препаратов изучали на модели эритроцитов человека 0 (I) группы Rh (+) по методике В.И. Брилис с соавт. (33). При изучении адгезивных свойств штаммов лактобациллы предварительно выращивали на среде МРС-1 в течение 1-2-х суток. Культуры дважды отмывали буферным 0,1М раствором натрия фосфата, приготовленного на изотоническом растворе натрия хлорида (рН 7,2—7,3), с помощью центрифугирования (1500 об/мин, 10 мин). Осадок ресуспендировали в буфере до концентрации 109 клеток/мл. Показатель адгезивности лактосодержащих препаратов определяли без предварительного культивирования и отмывания бактериальных клеток от защитной среды (107). Нативные эритроциты дважды отмывали указанным буферным раствором при помощи центрифугирования (300 об/мин) и готовили взвесь с концентрацией 100 млн/мл. Взвеси эритроцитов и бактериальных клеток смешивали в пробирках в равных объемах (по 0,5 мл). Пробирки помещали на шуттель-аппарат и термостатировали при 37 С в течение 30 мин. По окончании срока экспозиции готовили мазок-препарат, окраску препарата проводили по методу Грама. Средний показатель адгезии (СПА) определяли по среднему количеству микроорганизмов, прикрепившихся к поверхности одного эритроцита при подсчете не менее 50 эритроцитов. В одном поле зрения учитывали не более 5 эритроцитов. Адгезивность считали низкой при СПА меньше 2, средней -от 2 до 4, высокой - свыше 4. Определение антагонистической активности Определение антагонистической активности методом отсроченного антагонизма на плотной питательной среде (МРС-5) Для определения антагонистической активности лактобактерий применяли модифицированную методику А.А. Ленцнера (123). На плотную среду МРС-5, разлитую в чашки Петри по 15-20 мл, засевали культуру лактобактерий штрихом по диаметру чашки. Испытуемые культуры производственных штаммов инкубировали в эксикаторе со свечей при 37 С в течение 4 сут (L. plantarum 8Р-АЗ и L. fermentum 90Т-С4) и 6 суток ( L. acidophilus). По истечении срока инкубации штрихом в направлении от зоны роста штамма молочнокислых бактерий и перпендикулярно ей подсевали культуры тест-микробов. Чашки вновь помещали в термостат на 24 ч в аэробные условия. Контролем роста тест-штаммов служил их параллельный посев на чашки с той же средой без исследуемой культуры. Антагонистическую активность культуры оценивали по величине зоны отсутствия роста индикаторных культур. Определение а йти б иотико резистентности лактобактерий Определение чувствительности лактобактерий к антибиотикам проводили с помощью общепринятого метода диффузии в агар с использованием стандартного набора дисков и плотной питательной среды (17,139). На поверхность среды МРС-5 наносили культуру лактобактерий и накладывали диски с антибиотиками из расчета 5-6 на чашку Петри. Чашки термостатировали при температуре 37 С в анаэробных условиях. Учет результатов проводили через 72 ч, измеряя диаметр зон видимого отсутствия роста бактерий вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Определение технологических параметров порошков Определение сыпучести (текучести) Сыпучесть определяли на приборе ВП-12А (Россия) по скорости высыпания определенного количества материала из металлической воронки за определенный период времени. Показатель сыпучести рассчитывали по формуле: Vc=m/t, где: Vc -сыпучесть, г/сек, m - масса навески, г; t- продолжительность высыпания порошка, сек. Определение гигроскопичности Бюксы с пробами помещали в эксикатор (100% влажность) и периодически, с интервалом 2-5 ч, взвешивали на аналитических весах до постоянной массы, означающей достижение равновесия между водяным паром в окружающем воздухе и материалом. Далее вычисляли прирост поглощения влаги по формуле: П = (Ах-Ао)хЮ0%, где: П- прирост поглощения, %; Ах- масса навески после эксикатора, г; Ао- начальная масса навеска, г.
Результаты исследований обрабатывались с использованием компьютерных программ «Microsoft Excel for Windows 2000», «Statistica for Windows, v 5.0». Использовались методы вычисления средних величин и доверительного интервала. Оценка достоверности различий показателей проведена по t-критерию Стьюдента (146).
Разработка технологии комплексного препарата
Традиционно выпускаемые пробиотики в виде сухой биомассы во флаконах и ампулах не полностью отвечают современным требованиям рынка лекарственных средств. Необходимость расширения номенклатуры выпускаемых лекарственных форм известных и хорошо зарекомендовавших себя отечественных препаратов на основе лактобактерий связана с актуальностью повышения их потребительских свойств и конкурентоспособности с импортными аналогами. В процессе организации массового производства пробиотиков в виде порошков, мазей, суппозиториев, таблеток, капсул и др. возникает ряд технологических проблем, решение которых базируется на исследованиях и разработках в области микробиологии и биотехнологии.
Сухая биомасса лактобактерий отличается высокой гигроскопичностью и низким показателем сыпучести, что характерно для большинства лиофильно высушенных субстанций. Эти свойства сухой биомассы зависят от многих факторов и в значительной степени определяются видом и количеством ксеропротекторов. Традиционно применяемые защитные среды (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко) не позволяют получать сухую биомассу, пригодную в достаточной мере для изготовления порошков.
Задача данного этапа исследований сводилась к подбору такой защитной среды, которая обеспечивала бы защиту клеток при лиофильном высушивании, уменьшая при этом влагосорбционную активность сухой биомассы лактобактерий и улучшая ее сыпучесть при производстве порошков, капсул и т.д.
В составе ксеропротектора чаще всего используются высокомолекулярные структурообразующие вещества, такие как желатин, крахмал картофельный, Na-КМЦ, ПВП (58). Для изучения влияния этих веществ на свойства сухой биомассы нами были приготовлены на их основе различные варианты защитных сред и апробированы на модели штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus К3Ш24(табл. 6.1).
Бактериальную взвесь смешивали с растворами защитных сред, дополнительно в каждый вариант бактериальной суспензии вводили 20-25 % обезжиренного молока, которое также обладает защитным эффектом для бактериальных клеток. Полученные суспензии разливали в кассеты и подвергали лиофильному высушиванию по режиму лактобактерина сухого.
Сухую биомассу лактобактерий измельчали до размера частиц менее 0,5 мм. В полученных образцах определяли количество жизнеспособных клеток (табл. 6.2 и 6.3) и на модели штамма L. plantarum 8Р-АЗ - сыпучесть по массовой скорости истечения (табл. 6.2).
Сыпучесть является комплексным параметром, характеризующим способность материала высыпаться из емкости под силой собственной тяжести, образуя непрерывный устойчивый поток. На сыпучесть неуплотненных порошков влияют многочисленные факторы, характеризующие субстанцию: размер, форма и насыпная плотность частиц, влажность. Для оценки сыпучести использовали следующие градации: неудовлетворительная - если показатель составлял менее 3,0 г/сек, удовлетворительная - 3,0-6,6 г/сек, хорошая — свыше 6,6 г/сек (36).
При использовании в составе ксеропротектора различных структурообразующих компонентов не было выявлено существенных различий по выживаемости клеток в сухой биомассе. Рассмотренные виды ксеропротекторов в равной степени подходят для защиты клеток обоих штаммов. Было установлено, что защитная среда без структурообразующего компонента (вариант №5) также обеспечивает удовлетворительный протективный эффект.
При изучении сыпучести вариантов сухой биомассы штамма L. plantarum 8Р-АЗ уровню «удовлетворительная» не отвечал ни один образец. Однако, сухая биомасса, полученная с применением защитной среды без структурообразующего компонента (вариант №5), имела более высокую сыпучесть по сравнению с другими вариантами (табл. 6.2).
Для улучшения показателя сыпучести в бактериальную суспензию штамма L, plantarum 8Р-АЗ с защитной средой без структурообразующего компонента дополнительно вводили аэросил, т.к. это вещество отличается способностью связывать воду до 40 % относительно своей массы без потери сыпучести. Связывание воды происходит по механизму хемосорбции в результате присутствия на поверхности и частично внутри частиц силановых групп (Si-OH) и их взаимного связывания при помощи водородных мостиков, которые не позволяют влаге проникать к частицам биомассы (6).
Было проведено определение оптимальной концентрации аэросила, которая позволила бы получить достаточно сыпучую, неотсыревающую и неуплотняющуюся при хранении биомассу. Для этого были изготовлены образцы сухой биомассы лактобактерий штамма L. plantarum 8Р-АЗ с различными концентрациями аэросила. Сравнительный анализ их параметров позволил определить оптимальный диапазон содержания аэросила (6-12) %, который обеспечивает необходимые биологические и технологические свойства сухой биомассы (табл.6.4).
Содержание влаги в материале оказывает большое влияние на сыпучесть порошков. Повышенное влагосодержание снижает текучесть за счёт образования массивных адсорбционных слоев на частицах, повышает их адгезионные свойства друг к другу.
Образцы сухой биомассы с аэросилом обладают удовлетворительной сыпучестью и набирают меньше влаги в течение первых 3-х ч выдержки их в эксикаторе с влажностью воздуха 100 % (рис.6Л).
Антагонистическая активность препаратов
Следующий этап нашей работы включал разработку способа получения комплексного препарата «Лактобактерин-БИЛС сухой» на основе выбранной бактериальной композиции и методов его контроля. В ходе разработки технологии комплексного препарата, базирующейся на основе регламентированных способов получения лактобактерина и ацилакта, был унифицирован процесс приготовления маточных культур штаммов лактобактерий. Предложено использовать питательную среду МРС-1 для трех последовательных пассажей каждого штамма. В результате сравнительного анализа качественных показателей маточных культур, изготовленных по регламентированной и предложенной технологии, были получены сопоставимые результаты, достоверные отличия не наблюдались. Данный способ получения маточных культур позволяет упростить приемы работы, связанные с использованием различных питательных сред, а также исключить применение среды МРС-4, МРС-2 (L. plantarum 8Р-АЗ) и обезжиренного молока (L. acidophilus К3Ш24).
С целью оптимизации реакторного метода накопления биомассы лактобактерий был модифицирован регламентированный способ, включающий применение казеиново-дрожжевои среды, периодическое внесение углеводной добавки и коррекцию рН культуральной среды с помощью раствора аммиака. Модификация заключается в замене раствора глюкозы, стандартно применяемого в качестве углеводной добавки, на сахарозо-желати новый раствор -основной компонент протективной среды для лиофилизации.
Использование сахарозо-желатиновой среды в качестве углеводной добавки позволило унифицировать рабочие растворы (вещества) для культивирования и лиофилизации. Была изучена возможность совместного культивирования выбранных штаммов лактобактерий. Установлено, что, развиваясь в ассоциации, штамм L, plantarum 8Р-АЗ достигает уровня накопления биомассы, достоверно сопоставимого с монокультурой, при этом показатель выживаемости ацидофильных лактобактерий уступает монокультуре в среднем на один порядок. Поэтому в технологию препарата был включен метод раздельного культивирования штаммов. Исходя из содержания жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) в производственной культуре каждого штамма, было определено количественное соотношение бактериальных взвесей при получении суспензии комплексного препарата, оно составило: две части взвеси L. acidophilus К3Ш24И одну часть L. plantarum 8Р-АЗ. Для лиофилизации комплексного препарата был успешно апробирован режим замораживания и высушивания, используемый в производстве лактобактерина и ацилакта. При получении препарата в виде сухой биомассы во флаконах в качестве защитной среды для высушивания бактериальной суспензии была использована сахарозо-желатино-молочная среда, применяемая в производстве лактобактерина и ацилакта. Указанный способ получения комплексного препарата, включающий использование подобранной бактериальной композиции, признан изобретением. Стандартизация препарата включала скрининг различных применяемых методов контроля пробиотиков и выбор наиболее подходящих. Методы контроля, применяемые при стандартизации лактобактерина сухого (исключая определение количества жизнеспособных клеток в дозе препарата), достоверно оценивали свойства лактобактерина-БИЛС, поэтому и были включены в НТД на новый препарат. Раздельный количественный учет бактериальных составляющих препарата был предусмотрен на этапе конструирования композиции, в его основу были положены существенные видовые отличия штаммов по характеру роста на питательных средах и по ферментативной активности. Штамм L. plantarum 8Р-АЗ достоверно обнаруживается в композиции с помощью стандартных методов контроля на средах МРС-2 и МРС-4, предусмотренными ФС на препараты «Лактобактерин сухой» и «Лактобактерин, суппозитории вагинальные», присутствие штамма L. acidophilus К3Ш24 в данных условиях не обнаруживается и не влияет на результат анализа. Количество бактерий штамма L. acidophilus К3Ш24 в препарате можно определить методом, описанным в ФС на «Ацилакт сухой», по эффекту сквашивания обезжиренного молока. Присутствие штамма L. plantarum 8Р-АЗ на данной среде на результат анализа не влияет. Поскольку препарат лактобактерин-БИЛС включает штаммы, применяемые при изготовлении препаратов лактобактерин и ацилакт, технологии данных препаратов также идентичны, поэтому при исследовании биологической активности нового пробиотика данные препараты были использованы для сравнения. Проведено сравнительное изучение биологических свойств лактосодержащих препаратов: лактобактерина-БИЛС, лактобактерина и ацилакта. Установлено, что лактобактерин-БИЛС обладает более выраженной адгезией по сравнению с аналогами, что можно объяснить эффектом суммации адгезивных свойств клеток, а также, возможно, конкуренцией за рецепторы для адгезинов микробов. Исследования показали, что новый комплексный препарат обладает высокими антагонистическими свойствами по отношению к трем группам различных патогенных и условно патогенных микроорганизмов в тесте отсроченного антагонизма на плотной среде МРС-5. Лактобактерин-БИЛС давал более высокие зоны подавления роста тест-штаммов, достоверно отличающиеся от зон подавления препаратов сравнения (р 0,001). По активности кислотообразования на различных питательных средах исследуемый препарат не уступает своим аналогам, превосходит лактобактерин при инкубации в обезжиренном молоке. При изучении устойчивости препаратов к биологическим жидкостям (желчи, желудочному соку) было выявлено снижение (на один порядок) чувствительности к желудочному соку штамма L. acidophilus К3Ш24, входящего в состав комплексного препарата, по сравнению с монокультурой штамма. Это можно объяснить, вероятно, протективным действием культуральной жидкости штамма L. plantarum 8Р-АЗ.
