Введение к работе
з
Актуальность темы. Долгое время единственными непатогенными для растений микроорганизмами, способными обитать внутри растительных тканей, считались клубеньковые бактерии и эндомикоризные грибы. Многочисленные доказательства способности других видов бактерий заселять внутренние растительные ткани, не вызывая какие-либо симптомы у растений (Sturz, Nowak, 2000; Bacon, Hinton, 2002; Antoun, Prevost, 2005; Wu et al, 2009), изменили традиционное мнение о стерильности последних, что позволило сформировать представление о растениях, как сложных микроэкосистемах, являющихся местом обитания различных эндофитных микроорганизмов, как паразитов, так и мутуалистов. Последние привлекают особое внимание исследователей, и именно их, как правило, называют эндофитами, исключая паразитов и комменсалов (Antoun, Prevost, 2005; Hardoim et al., 2008). Научный интерес представляют механизмы взаимодействия растений с их эндофитами. Одновременно изучение эндофитов интересно и практикам, так как такие микроорганизмы, как стимуляторы роста или защитные агенты, открывают новые возможности для создания безопасных биопрепаратов. Недостаточные сведения о свойствах эндофитных бактерий и их взаимоотношениях с хозяевами не позволяет успешно создавать на их основе новые более эффективные биофунгициды, что подтверждается использованием в растениеводстве России пока лишь одного препарата «Фитоспорин-М» на основе эндофитного штамма Bacillus subtilis 26Д (Государственный каталог пестицидов..., 2010). При этом многие авторы относят эндофитов к более перспективным бактериям по сравнению с обитателями ризосферы, поскольку первые лучше защищены от неблагоприятного воздействия многих средовых факторов (Менликиев и др., 1996; Недорезков, 2003; Мубинов, 2007). Бациллам, как потенциальной основе биофунгицидов, посвящено значительное число работ (Смирнов и др., 1982; Недорезков, 2003 Мелентьев, 2007; Choudhary, Johri, 2009; Perez-Garcia et al., 2010). Однако в большинстве из них эти бактерии рассматривают, в основном, как антагонистов для биоконтроля фитопатогенов,
4 в то время как другим механизмам стимуляции роста, устойчивости и продуктивности растений, особенно эндофитными представителями рода Bacillus, на наш взгляд, уделяется недостаточное внимание.
Цель работы - выявить комплекс биологической активности эндофитных штаммов Bacillus subtilis, позволяющий использовать бактерии в качестве основы новых полифункциональных препаратов для растениеводства.
Задачи работы. 1) Провести сравнительные исследования культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств, определить генетическую гетерогенность новых эндофитных штаммов В. subtilis, выделенных из растений яровой пшеницы. 2) Определить эндофитность одного из перспективных штаммов - В. subtilis 11ВМ с помощью рекомбинантного штамма В. subtilis llBMg^?. 3) Выявить участие фитогормонов в механизмах регуляции роста растений эндофитными представителями В. subtilis. 4) Изучить способность штаммов переводить труднорастворимые фосфаты в подвижные формы и определить некоторые её механизмы. 5) Охарактеризовать взаимоотношения исследуемых штаммов В. subtilis с фитопатогенными грибами, а также азотфиксирующими бактериями. 6) Оценить безопасность и технологичность штамма В. subtilis 11ВМ как перспективной основы для разработки полифункционального биофунгицида.
Научная новизна. Дана подробная сравнительная характеристика
культурально-морфологических, физиолого-биохимических свойств
семнадцати новых эндофитных штаммов В. subtilis, выделенных из растений мягкой яровой пшеницы, показана их генетическая гетерогенность. Впервые показано, что вовлечение фитогормонов - как активаторов (ИУК и цитокинины), так ингибиторов роста (АБК) во взаимоотношения эндофитных штаммов В. subtilis с растениями может быть одним из общих механизмов проявления этими бактериями рострегулирующей активности по отношению к хозяину. Выявлен один из механизмов повышения содержания ИУК в корнях растений под влиянием эндофитных представителей В. subtilis, включающий снижение активности ИУК-оксидазы. Впервые показано, что стимуляция роста
5 растений эндофитными штаммами В. subtilis может быть опосредована их способностью переводить труднорастворимые фосфаты в подвижные формы за счет продукции бактериями органических кислот, спектр которых зависит от биологических особенностей штамма. Показано, что при наличии у изученных штаммов бактерий общего свойства проявлять антагонизм к фитопатогенным грибам рода Fusarium, эти штаммы различаются по способности угнетать рост хозяйственно полезных азотфиксирующих бактерий. Установлено, что отличительным признаком новых штаммов бацилл от депонированных (В. subtilis 26Д, 24D, 11В, Ml) является преимущественное ингибирование роста Azospirillum brasilense и A. lipoferum. Показано, что бактерии Azotobacter vinelandii отличаются от других изученных представителей азотфиксаторов устойчивостью к действию антибиотиков всех исследованных штаммов бацилл.
Практическая значимость. Подробно охарактеризованная коллекция из 17 эндофитных штаммов В. subtilis представляет практическую ценность, как для выявления новых свойств этих бактерий, так и разработок биопрепаратов для сельского хозяйства. Штамм бактерий В. subtilis 11ВМ, трансформированный плазмидой pRL-GFP765 может быть использован для изучения механизмов взаимоотношений растений и эндофитов. Показано, что выявление фосфат-мобилизующей активности бактерий и её регистрируемый уровень зависят от консистенции среды, на которой культивируются микроорганизмы, также как и спектр продуцируемых ими органических кислот. Для повышения надежности оценки рострегулирующей активности эндофитных бактерий предложена методика, в которой тест-объекты получают из растений, инокулированных эндофитами. В коллекции ВНИИСХМ депонирован штамм В. subtilis 11ВМ (№519) перспективный в качестве основы нового полифункционального биофунгицида.
Связь работы с научными программами. Исследования по теме диссертации поддержаны грантами РФФИ №05-04-08156-офиа, №05-04-97935-рагидельа, №11-04-97044-р_поволжье_а, Фонда содействию развитию МПНТС №4822р/7290 («СТАРТ-07»), №5490р/7971 («У.М.Н.И.К.»). Часть
6 работы выполнена в рамках заказа Минсельхоза России в соответствии с планом НИР Башкирского ГАУ за счет средств федерального бюджета по теме «Разработка полифункциональных биофунгицидов для растениеводства» (№ госрегистрации 01200853490).
Основные положения, выносимые на защиту. 1. 17 новых эндофитных штаммов отличаются друг от друга по ряду свойств и относятся к виду В. subtilis. 2. Штамм В. subtilis ПВМ способен проникать во внутренние растительные ткани, не проявляя патогенности по отношению к растению-хозяину. 3. Стимуляция роста растений пшеницы эндофитными штаммами В. subtilis опосредована комплексом их биологической активности: способностью проявлять фитогормон-подобные свойства по отношению к растениям, изменять баланс фитормонов в растительных тканях, переводить труднорастворимые фосфаты в подвижную форму, ингибировать рост фитопатогенных грибов, повышать устойчивость растений к действию фитотоксинов, избирательно подавлять рост азотфиксирующих бактерий. 4. Штамм В. subtilis ПВМ (ВНИИСХМ №519) безопасен для животных, технологичен и может быть использован в качестве основы полифункционального биофунгицида.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на: IV Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2008); V международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); XII съезде общества микробиологов Украины им. СМ. Виноградского (Ужгород, 2009); II Всероссийской школе-конференции молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание
