Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Применение фосфатрастворяющих микроорганизмов для разработки биоудобрений 11
1.1.1. Механизмы высвобождения фосфатов из нерастворимого минерального сырья под действием микроорганизмов. 12
1.1.2. Высвобождение фосфатов из различных фосфорных руд под действием микроорганизмов 14
1.1.3. Использование фосфатрастворяющих микроорганизмов для улучшения фосфорного питания растений 15
1.2. Использование микроорганизмов для борьбы с фузариозом колоса зерновых культур .
1.2.1. Вредоносность фузариоза колоса в зернопроизводстве 17
1.2.2. Преимущества использования для борьбы с фузариозами 22 микробиологических препаратов по сравнению с химическими 1.2.3. Микроорганизмы - антагонисты возбудителей фузариоза колоса 24
1.2.3.1. Микофильные грибы рода Trichoderma и их 26 антагонистические свойства. 1.2.3.2. Использование антагонистических свойств бактериальных штаммов для борьбы с фузариозом колоса 30
1.3. Поиск микроорганизмов-антагонистов патогенов растений, в том числе возбудителей фузариоза колоса, растворяющих фосфатные руды 31
Собственные исследования 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Штаммы микроорганизмов 35
2.2. Культивирование микроорганизмов 36
2.2.1. Приготовление биомассы штамма № 16 T. asperellum GJS 36 03-35
2.2.2. Приготовление биомассы штамма Pseudomonas sp. 181a 37
2.3. Определение фосфатрастворяющей активности штамма № 16 T. asperellum GJS 03-35 38
2.4. Газохроматографическое определение метаболитов, обусловливающих фосфатрастворяющую активность микроорганизма .
2.5. Характеристика использовавшихся фосфатных руд 40
2.6. Определение антагонистической активности микроорганизмов по отношению к возбудителям фузариозов 44
2.7. Определение фитотоксичности микроорганизмов 45
2.8. Оценка совместного действия штаммов № 16 Т. asperellum GJS 03-35 и Pseudomonas sp. 181а на проростки пшеницы 45
2.9. Оценка совместимости микроорганизмов с химическими пестицидами 48
2.10. Методика вегетационных испытаний совместного применения биопрепаратов на пшенице 49
2.10.1. Условия проведения вегетационного опыта 49
2.10.2. Методы оценки эффективности обработок 53
2.11. Методика деляночных полевых испытаний эксперимен тальных образцов биопрепаратов на пшенице 54
2.11.1. Постановка полевого опыта и методы испытаний 54
2.11.2. Агротехника и метеоусловия 56
2.12. Статистическая обработка данных 58
ГЛАВА 3. Основные результаты и их обсуждение 59
3.1. Изучение in vitro фосфатрастворяющих свойств микофильного гриба Trichoderma asperellum 59
3.1.1. Изучение механизма высвобождения фосфатов из нерастворимого минерального сырья под действием штамма № 16 Т. asperellum GJS 03- 35 60
3.1.2. Определение доступности фосфатных руд для штамма № 16 Т. asperellum GJS 03- 35 67
3.1.3. Заключение по разделу 3.1 74
3.2. Выбор фосфатрастворяющего штамма бактерий, совместимого со штаммом № 16 Г. asperellum GJS 03-35 75
3.2.1. Оценка антагонистических свойств фосфатрастворяющих бактерий 76
3.2.2. Выбор наиболее активных фосфатрастворяющих штаммов, совместимых с Т. asperellum и обладающих ростстимулирующим эффектом 80
3.2.3. Оценка совместного действия штаммов № 16 T. asperellum GJS 03-35 и Pseudomonas sp. 181a на проростки пшеницы 3.2.4. Заключение по разделу 3.2 87
3.3. Оценка в лабораторном эксперименте эффективности микроорганизмов при совместном применении с химическими пестицидами, используемыми при возделывании зерновых злаковых культур 88
3.3.1. Заключение по разделу 3.3 93
3.4. Определение в вегетационном эксперименте эффективности сочетанного использования исследуемых микроорганизмов с фосфатрастворяющими и антифузариозными свойствами для улучшения фосфорного питания и снижения содержания фузариотоксинов в урожае зерновых злаковых культур .
3.4.1. Влияние экспериментальных образцов биопрепаратов на морфометрические показатели растений пшеницы и содержание фосфора в зерне 95
3.4.2. Заключение по разделу 3.4 100
3.5. Оценка в опытно-производственных условиях комплекса микробиологических приемов, обеспечивающих защиту яровой пшеницы от фузариоза колоса и улучшение ее фосфорного питания 102
3.5.1. Влияние экспериментальных образцов биопрепаратов на морфометрические показатели растений пшеницы, количество и качество урожая в отсутствии инфицирования F. graminearum 103
3.5.2. Влияние экспериментальных образцов биопрепаратов на морфометрические показатели растений пшеницы и урожай при искусственном инфицировании F. graminearum 109
3.5.3. Заключение по разделу 3.5 111
Заключение 113
Выводы 118
Перечень сокращений, условных обозначений,
Символов, единиц и терминов Список использованных источников
- Высвобождение фосфатов из различных фосфорных руд под действием микроорганизмов
- Приготовление биомассы штамма Pseudomonas sp. 181a
- Изучение механизма высвобождения фосфатов из нерастворимого минерального сырья под действием штамма № 16 Т. asperellum GJS 03- 35
- Влияние экспериментальных образцов биопрепаратов на морфометрические показатели растений пшеницы и содержание фосфора в зерне
Введение к работе
Актуальность проблемы:
Продовольственная безопасность любого государства находится в прямой зависимости от количества и качества производимой сельхозпродукции. Данная работа направлена на решение двух острых проблем в зерновом производстве: повышения почвенного плодородия и получения качественной продукции, свободной от микотоксинов. Традиционное применение химических минеральных удобрений и пестицидов для решения этих проблем не всегда высокоэффективно и неэкологично.
Интенсивная эксплуатация сельскохозяйственных земель требует увеличения объема производства и применения минеральных удобрений, в том числе и фосфорных.
Фосфор, наряду с азотом и калием, является одним из основных макроэлементов питания растений, в том числе и зерновых культур. Высокие темпы исчерпания мировых запасов фосфорного сырья, дороговизна производства и транспортных расходов, нарушение экологии - далеко не весь перечень существующих проблем в этой отрасли (Heffer, Prudhomme, 2006). При этом не весь вносимый с химическими удобрениями фосфор усваивается растениями. Значительная часть фосфора связывается почвенно-поглощающим комплексом и переходит в недоступную для растений форму, а также вымывается из корнеобитаемого слоя (Sample et al., 1980). Увеличение норм внесения минеральных удобрений приводит к росту материальных затрат, нарушает экосистему почв и водоемов, а также баланс питания растений, тогда как недостаток этого элемента не только снижает урожайность, но и ухудшает товарные качества зернопродукции (Murrell, Fixen, 2006). Недостаточность и несбалансированность применения химических минеральных удобрений, наряду с другими факторами, приводят к снижению иммунитета растений к фитопатогенам, в том числе к возбудителям фузариоза зерновых культур (Соколов, Коломбет, 2007).
В последнее время одной из острейших проблем в странах с развитым зерновым производством является проблема фузариоза колоса (ФК), вызываемого грибами рода Fusarium. В зависимости от погодных условий прямые потери товарного зерна от фузариоза могут составлять от 20% до 50% (Новожилов, Левитин, 1990; Соколов, 1992). Однако наибольшей опасностью фузариозов является загрязнение зерна и сопутствующей продукции высокостабильными фузариотоксинами, такими как дезоксиниваленол (ДОН) и его производные. В случае поражения зерновых культур ФК фузариотоксины обнаруживаются не только в зерне, но и в муке, крупах, хлебобулочных и макаронных изделиях, пиве, квасе и т.д. (Miller et al., 2003). Применение химических фунгицидов для борьбы с ФК имеет ряд особенностей. Снижение норм расхода химических фунгицидов приводит к уменьшению эффективности и возникновению устойчивых популяций фитопатогенов, а увеличение норм расхода - к ухудшению экологической обстановки и опасности загрязнения продукции зернопроизводства остаточным количеством фунгицидов. Возбудители ФК быстро приспосабливаются к современным фунгицидам и отвечают многократным увеличением накопления фузариотоксинов в зернопродукции (Монастырский, 1995; Гагкаева и др., 2011). При этом имеются сведения, что применение микробиологических фунгицидов вместо химических позволяет не только защитить урожай, но и значительно снизить содержание микотоксинов (Stockwell et al., 1997, 2000; Коломбет, 2006).
Таким образом, взаимосвязанность проблем несбалансированного минерального питания и защиты от фузариозов зерновых культур заставляет искать новые экологически безопасные пути в качестве альтернативы применению современным агрохимикатам и пестицидам. В настоящее время накоплен значительный опыт применения микробиологических методов для борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных культур и улучшения почвенного плодородия. Однако возможность совместного применения, а также комплексные свойства микроорганизмов изучены недостаточно. При этом существующий потенциал эффективных и экологичных методов полностью не задействован.
Известно, что существуют микроорганизмы - антагонисты возбудителей фузариоза колоса, которые способны высвобождать доступные злаковым культурам фосфаты из фосфатных руд (Рой и др., 2004; Bano, Musarrat, 2004.). В то же время, некоторые микроорганизмы, способные к высвобождению фосфатов, проявляют антагонистические свойства к различным фитопатогенам. Например, грибы рода Trichoderma упоминаются в литературе не только как биоагенты для борьбы с болезнями растений, но и как микроорганизмы, способные высвобождать фосфаты из нерастворимого фосфатного сырья (Altomare et al., 1999; Yadav et al, 2011; Mahamuni et al., 2012).
Предлагаемые исследования позволят изучить возможность комплексного использования микроорганизмов и их свойств в качестве альтернативы применению минеральных фосфорных удобрений и химических фунгицидов.
Цель исследования - изучить и оценить эффективность комплексного использования микроорганизмов в качестве альтернативы фосфорным удобрениям и химическим фунгицидам для повышения экологической безопасности при защите зерновых культур от фузариоза колоса и оптимизации их минерального питания.
Задачи исследования:
1. Изучить in vitro фосфатрастворяющие свойства микофильного гриба Trichoderma asperellum.
2. Выбрать наиболее активные фосфатрастворяющие бактериальные штаммы, совместимые с T. asperellum.
3. Определить в лабораторном эксперименте возможность совместимости Т. asperellum и фосфатрастворяющих бактериальных микроорганизмов с пестицидами, применяемыми при возделывании зерновых культур.
4. Определить в вегетационном эксперименте эффективность сочетанного использования фосфатрастворяющих и антифузариозных свойств исследованных микроорганизмов, перспективных для улучшения фосфорного питания и снижения содержания фузариотоксинов в урожае зерновых злаковых культур.
5. Оценить в опытно-производственных условиях комплекс микробиологических приемов, обеспечивающих защиту яровой пшеницы от фузариоза колоса и улучшение фосфорного питания.
Научная новизна
Доказано наличие фосфатрастворяющих свойств у микофильного гриба T. asperellum.
Показано, что для штамма №16 T. asperellum GJS 03-35 одним из основных механизмов мобилизации фосфора из нерастворимого минерального сырья является продукция органических кислот.
Показана эффективность сочетанного использования микроорганизмов, обладающих фосфатрастворяющими и антифитопатогенными свойствами на пшенице.
Показана возможность совместимости исследованных микроорганизмов с пестицидами, применяемыми при выращивании зерновых культур.
Практическая значимость и внедрение результатов
Два фосфатрастворяющих бактериальных штамма с фунгицидными свойствами депонированы в коллекцию ГНЦ ПМБ («ГКПМ-Оболенск») и защищены патентами на изобретение РФ: №№ 2451068 и 2451069.
Показана возможность совместного использования микроорганизмов в качестве альтернативы минеральным фосфорным удобрениям и химическим фунгицидам для борьбы с фузариозом колоса.
Полученные результаты исследования послужат основой для разработки новых комплексных микробиологических почвоудобрительных и фунгицидных препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
-
Микофильный гриб T. аsperellum обладает способностью к высвобождению растворимых фосфатов из различных типов минерального фосфорного сырья.
-
Одним из основных механизмов высвобождения фосфора из минерального сырья под действием штамма № 16 T. asperellum GJS 03-35 является продукция им органических кислот.
-
Совместное применение микофильного гриба T. аsperellum и бактериального штамма Pseudomonas sp. 181а улучшает фосфорное питание и повышает эффективность защиты от фузариоза колоса пшеницы.
-
Возможно совместное применение штаммов № 16 T. asperellum GJS 03-35 и Pseudomonas sp. 181а с химическими пестицидами.
Работа выполнена в отделе биологических технологий ФБУН ГНЦПМБ в рамках отраслевой программы 2006-2010 гг. «Разработка микробных препаратов для решения задач экологической и продовольственной безопасности», а также двух международных проектов МНТЦ: №2336п «Разработка технологии производства и применения микробиологической субстанции, на основе которой возможно создание препарата для защиты пшеницы и других зерновых культур от фузариоза колоса» (2003-2005гг.) и №3107 «Прямая микробиологическая мобилизация фосфатов из фосфатного сырья: использование для сельского хозяйства и нужд промышленности» (2006-2008гг).
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором. Экспериментальные результаты, представленные в отдельных главах, получены совместно с сотрудниками ФБУН ГНЦ ПМБ: д.б.н. Коломбет Л.В., к.б.н. Дунайцевым И.А., к.х.н. Жиглецовой С.К., к.х.н. Ариповским А.В., Клыковой, М.В., Кондрашенко Т.Н., Бойко А.С., Аитовым, Р.С., Торгониной И.В., Лариной Н.С., сотрудницей ГНУ Рязанского НИИСХ к.с.-х.н. Антошиной О.А.
Апробация работы. Результаты работы доложены на двух Научно-практических школах-конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», Оболенск, 2008 и 2011 гг., на 21-ом Международном симпозиуме “Ecology and Safety” 8-12 июня 2012 г. в Болгарии и на 3-м Съезде микологов 10-12 октября 2012 г в Москве.
Тема диссертации была утверждена на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ 19 марта 2009 г., протокол Ученого совета № 2 (приказ № 51 от 03.04.2009 г.), с изменениями, утвержденными Ученым советом 27 ноября 2013 г., протокол № 10.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах из перечня ВАК, 3 статьи в других рецензируемых журналах, 2 патента РФ и 6 тезисов в материалах конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов, результатов и обсуждений, заключения, выводов и списка литературы, включающего 80 работ отечественных и 158 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 27 таблицами.
Высвобождение фосфатов из различных фосфорных руд под действием микроорганизмов
Продукция различных органических кислот ФР микроорганизмами подробно представлена в литературе. В их числе наиболее часто упоминается глюконовая кислота. Она секретируется в качестве основной органической кислоты такими ФРМ, как Pseudomonas sp. [152], Erwinia herbicola [130] Pseudomonas cepacia [200] и Burkholderia cepacia [128]. Второй по частоте упоминания органической кислотой, идентифицированной в культуральной жидкости штаммов, обладающих ФР способностью, является 2-кетоглюконовая кислота, которая присутствовала у Rhizobium leguminosarum [137], Rhizobium meliloti [137], Enterobacter intermedium [151], Bacillus firmus [91] и других не идентифицированных почвенных изолятов [115]. Некоторые штаммы продуцируют смеси глюконовой, 2-кетоглюконовой и даже 2,5-дикетоглюконовой кислот [130].
Другие органические кислоты, такие как лимонная, гликолевая, щавелевая, малоновая и яблочная, были также идентифицированы у различных ФРМ [91; 82]. Также было обнаружено, что штаммы Bacillus liqueniformis и Bacillus amyloli-quefaciens продуцировали смеси молочной, изовалериановой, изомасляной и уксусной кислот [200].
Имеется прямое экспериментальное доказательство определяющей роли органических кислот в растворении минеральных фосфатов. В [137] показано, что органические кислоты, выделенные из КЖ Rhizobium leguminosarum, переводили в раствор количество фосфора почти эквивалентное количеству, которое высвобождалось в нативной КЖ. Помимо этого, обработка фильтратов КЖ нескольких штаммов Rhizobium пепсином или удаление белков осаждением ацетоном не затрагивало способности высвобождения фосфата, доказывая, что последнее не является ферментативным процессом. В то же время, нейтрализация с помощью NaOH разрушала ФР способность [137]. Основываясь на этих результатах, после клонирования генов, обеспечивающих растворение минеральных фосфатов, [129; 130] предположил, что прямое окисление глюкозы в глюконовую кислоту и часто далее в 2-кетоглюконовую кислоту формирует у некоторых грамм-отрицательных бактерий метаболические основы фенотипа, растворяющего минеральные фосфаты.
Другие механизмы растворения минеральных фосфатов микроорганизмами, кроме образования органических кислот, были предложены из-за отсутствия линейной корреляции между pH и количеством перешедшего в раствор фосфата [221; 88; 153]. Среди таких механизмов - продукция хелатирующих веществ микроорганизмами [215; 115], выделение ионов водорода, компенсирующее поглощение катионов [152], и в наибольшей степени ионов аммония [153], образование неорганических кислот, таких как серная [215], азотная и угольная [200]. Однако эффективность образования неорганических кислот подвергается сомнению, и их вклад в высвобождение фосфатов в почве не представляется значительным [200].
Фосфатные руды применялись и применяются в качестве фосфорных удобрений, но их эффективность низка, особенно в нейтральных и щелочных почвах [80; 77; 145]. Добавление вместе с рудами органических субстратов, с помощью которых может быть активизирована почвенная микрофлора, облегчает растворение фосфоритов [94].
По литературным данным доступность фосфатных руд воздействию микроорганизмов значительно варьирует в зависимости от вида микроорганизма и типа руды. Например, степень высвобождения фосфатов из обработанного концентрата фосфоритной руды под действием штамма Erwinia corotovora достигала 50 % [3], а под воздействием некоторых грибных штаммов, полностью растворявших три-кальций фосфат, вообще не было отмечено высвобождения фосфата из руды [43].
Хотя в литературе отмечена различная доступность фосфатных руд воздействию микробов, систематические исследования высвобождения фосфатов микроорганизмами из различных рудных материалов в литературе до недавнего времени отсутствовали. Как правило, исследовали доступность одной-двух руд [93;
3; 94]. Почти 30 лет назад было показано, что наиболее устойчив кристаллический апатит [43]. Так, под действием Chromobacterium denitrificans из апатитового порошка высвобождалось фосфора в раствор 0,8 мг/л, а из вятского фосфорита в тех же условиях высвобождалось фосфора 300 мг/л. Одной группой авторов в одних и тех же условиях исследовалось, как правило, не более четырех руд [197; 198]. Только в [13] была исследована доступность всех основных типов фосфатных руд для различных микроорганизмов. Показано, что на доступность воздействию микроорганизмов кроме структуры влияет состав руды. Фосфатные руды различались по доступности для одного микроорганизма более чем в 5 раз. В [197] продемонстрировано, что под влиянием руды даже может изменяться механизм высвобождения фосфатов.
Многократно показано, что руды, содержащие фосфаты железа и алюминия менее подвержены воздействию микробов, чем содержащие фосфаты кальция [3; 43; 152; 112]. Особенно отмечалось влияние тяжелых металлов, входящих в состав руд. Например, указывалось, что цинк ингибировал потребление иона К+ и выделение иона Н+, а также рост грибов [123]. В других работах было показано, что органические кислоты, участвующие в процессе высвобождения фосфатов из руд, могут использоваться микроорганизмами для детоксикации тяжелых металлов путем образования комплексов [163]. Следовательно, присутствие токсических металлов может значительно уменьшать фосфатрастворяющую способность микроорганизмов. Поэтому при разработке препаратов на основе ФРМ необходимо тщательное исследование фосфатных руд, которые предполагается использовать с ними.
Приготовление биомассы штамма Pseudomonas sp. 181a
Приготовление биомассы штамма Pseudomonas sp. 181а Для выращивания культуры Pseudomonas sp. во встряхиваемых колбах объемом 750 мл в каждую колбу вносили по 100 мл минеральной питательной среды следующего состава (г/л): сахароза - 10,0; хлорид аммония - 2,0; MgS04-7H20 -0,6; фосфат натрия двузамещенный - 4,0; фосфат калия однозамещенный - 2,0; раствор микроэлементов - 0,3 мл; вода водопроводная до 1 л. Состав раствора микроэлементов (%): FeSO47H20 - 0,01; CuS045H20 - 0,1; MnS04x2H20 - 0,1; ZnS04x7H20 - 0,01. Для засева колб использовали бактериальную суспензию из расчета 1 косяк на 5 колб. Культивирование проводили в течение 18 час при температуре (29±1) С и скорости вращения качалки 220-240 об/мин. В результате получали КЖ с содержанием клеток 1-5хЮ9 КОЕ/мл.
Для культивирования штамма Pseudomonas sp. 181а в ферментере New Brunsweek Microferm с рабочим объемом до 10 л использовали ту же минеральную питательную среду, которая применялась при выращивании в колбах, и посевной материал для ферментера получали во встряхиваемых колбах, как описано выше. Процесс выращивания культуры в ферментере вели при соблюдении следующих условий: -температура культивирования (29±1) С; - непрерывная работа мешалки при скорости вращения 200-900 об/мин в зависимости от показателя рО2 (не ниже 15 %); - давление воздуха в ферментере 0,04-0,05 МПа; - удельный расход воздуха в минуту 1,0-1,5 л/л среды.
Экспермиментальные образцы препарата на основе Pseudomonas sp.181а готовили путем смешивания полученной в ферментере КЖ с защитной средой, содержащей 2% полиглюкина и 7% лактозы, и высушивания на лиофилизаторе Virtis BT-4k (США). В результате получали сухой порошок с содержанием клеток 1-8х109 КОЕ /г.
Оценку фосфатрастворяющих (ФР) свойств штамма № 16 Т. asperellum GJS 03-35 проводили с помощью двух общепринятых методов: по образованию зоны просветления вокруг колоний на агаре, содержащем нерастворимый фосфат, и по накоплению фосфата в растворе при культивировании гриба в жидкой среде, содержащей нерастворимый фосфат, в качестве которого использовали трикальций фосфат - Са3(Р04)2 (ТКФ).
При определении ФР свойств на плотной среде суточную культуру Т. asperellum наносили в виде капли на поверхность селективной среды следующего состава, г/л: аммоний хлористый (NH4CI) - 1,0; магний сернокислый (MgS047H20) - 0,6; глюкоза - 10,0; трикальций фосфат (Са3(РО4)2 - 6,0; микроэлементы - 20 мл/л; агар-агар - 30,0; рН 6,8. Чашки инкубировали при температуре 28 С. Через 2-5 суток определяли диаметр наблюдавшейся зоны просветления на агаре. Поскольку грибные культуры быстро разрастаются по поверхности агара, для определения образованных зон просветления использовали полиэтиленовую пленку, вырезанную по форме чашки и с отверстиями диаметром 10 мм. Пленку обрабатывали 70 %-ым этиловым спиртом, промывали стерильной дистиллированной водой и накладывали на чашку с агаром. В вырезанные в пленке отверстия на поверхность агара наносили 50 мкл культуры гриба. Чашки выдерживали в термостате при температуре 28 С. Диаметр зон просветления определяли через 7 суток.
Для определения фосфатрастворяющей активности (ФРА) в жидкой среде культуру тестируемого гриба вносили в стерильную минеральную среду следующего состава, г/л: аммоний хлористый - 1,6; MgS047Н2О - 0,2; трикальций фосфат - 9,0 или фосфатная руда с тем же содержанием фосфора; глюкоза - 10,0, 20,0 или 30,0; микроэлементы - 20 мл/л. Состав раствора микроэлементов, %: сульфат железа (FeS047H20) - 0,01; сульфат меди (CuS045H20) - 0,1; сульфат марганца (MnSO4x2H20) -0,01. Посевная доза во всех случаях составляла 0,5 мл жидкой культуры гриба, выращенной во встряхиваемой колбе, как указано в разделе 2.2.1.
Инкубирование вели в колбах вместимостью 750 мл с объемом среды 100 мл на качалке New Brunswick при скорости вращения 160-180 об/мин при температуре 28 С в течение 6 суток, отбирая пробы объемом 1,5-2 мл для измерений рН и содержания фосфатов. рН измеряли на рН-метре ThermOrion 710.
Перед определением количества фосфора в растворе пробу центрифугировали на микрофуге Eppendorf Minispin в течение 4 мин при скорости вращения 10000 об/мин. В полученном супернатанте количество растворенного фосфора определяли с помощью одностадийного метода по интенсивности окраски его молибденового комплекса с твином 80 при длине волны 350 нм [54]. Измерение фосфора в растворе проводили в трех повторностях. Каждый опыт повторяли дважды.
Изучение механизма высвобождения фосфатов из нерастворимого минерального сырья под действием штамма № 16 Т. asperellum GJS 03- 35
Из литературы известно, что основным механизмом, с помощью которого микроорганизмы переводят в раствор фосфаты, является образование различных органических кислот из углеводного субстрата [215; 43; 91]. Наиболее распространенным процессом, как для бактерий, так и для грибов, является образование глюконовой и кетоглюконовой кислот из глюкозы с помощью фермента глюкозо-дегидрогеназы [119]. Некоторые бактерии почти стехиометрически окисляют глюкозу последовательно до соответствующих кислот [130] по
Однако в нашем случае по данным газовой хроматографии в среде с исходным содержанием глюкозы 10 г/л никаких органических кислот не обнаружили, а при исходном содержании глюкозы 20 и 30 г/л обнаруживали только кетоглюко-новую кислоту в очень небольших количествах (рис. 8 а,б).
Максимальное количество кетоглюконовой кислоты обнаружили при исходном содержании глюкозы в среде 30 г/л на третьи и шестые сутки опыта, что составило 0,2 г/л или 0,94 мМоль/л. При этом содержание растворенного фосфора составляло 600-790 мкг/мл (рис. 6), или 19,3-25,5 мМоль/л. Но по уравнению (4) 0,943 мМоль/л кетоглюконовой кислоты может обеспечить растворение только 0,47 мМоль/л фосфора, что примерно в 50 раз меньше количества фосфора, перешедшего в раствор. Таким образом, находившаяся в растворе органическая кислота не могла обеспечить зафиксированное в опыте высвобождение фосфора. Тем более, что при исходном содержании глюкозы в среде 10 г/л никаких органических кислот вообще не обнаружили.
К сожалению, до настоящего времени в доступной мировой литературе не встречались исследования влияния вида и концентрации источников углерода и энергии на мобилизацию фосфора из нерастворимого сырья под действием грибов рода Trichoderma. Более того, удалось найти только 5 работ, в которых исследовали способность грибов рода Trichoderma высвобождать фосфор из ТКФ в жидкой среде [219; 82; 158; 236; 172]. Во всех пяти работах в среде использовали глюкозу в концентрации 10-13 г/л и только аммонийный азот. Во всех этих работах отмечали снижение рН. Однако специальные исследования по поиску органических кислот проводили только для штамма T. isridae (такой вид указан в этой статье) [82]. Было обнаружено 9 органических кислот (глюконовая, уксусная, лимонная, молочная и др.), причем уже суммы глюконовой и уксусной кислот (3,5 мМоль/л) было достаточно для мобилизации обнаруженного в растворе фосфора (1,29 мМоль/л).
Полное отсутствие образования органических кислот при снижении рН в процессе высвобождения фосфора из нерастворимых минеральных фосфатов впервые было зафиксировано Illmer & Schinner в 1995 г. при изучении мобилизации фосфора из гидроксиапатита и брушита под действием Penicillium aurantio-griseum и Pseudomonas sp. [153]. Для объяснения этого явления было выдвинуто предположение, что в отсутствии продукции органических кислот высвобождение фосфора может быть обусловлено выбросом протонов, сопровождающим дыхание или ассимиляцию NH4+. Все эксперименты в этой работе проводили в среде, содержащей одновременно глюкозу, сахарозу и нитрат аммония. Хотя в этой работе не исследовали полную замену аммония на нитрат, ясно, что такая замена могла бы подтвердить влияние ассимиляции NH4+ на мобилизацию фосфора под действием микроорганизмов.
Действительно, в нашем случае при использовании сред, содержащих нитрат натрия (совместно с сахарозой) вместо хлорида аммония (совместно с глюкозой) не наблюдали ни снижения рН, ни растворения фосфата (рис. 6 и 7). Исходное содержание хлорида аммония в средах с глюкозой составляло 0,16 %, т.е. около 30 мМоль/л. Следовательно, при поглощении всего аммония могло образоваться эквивалентное количество соляной кислоты. 30 мМоль/л этой кислоты может перевести в раствор только 15 мМоль/л фосфора (или 465 мкг/мл) по уравнению, ана 65 логичному уравнениям 3 и 4. Однако при исходном содержании глюкозы 30 г/л в раствор максимально переходило почти в 2 раза большее количество фосфора (рис. 6). Таким образом, даже полная ассимиляция аммония не могла полностью обеспечить наблюдаемое растворение фосфора при исходной концентрации глюкозы 20 и 30 г/л.
Выброс протонов при дыхании бактерий также не мог полностью обеспечить процесс солюбилизации фосфатов, хотя мог играть определенную роль на ранних стадиях процесса [157]. Повышенная концентрация фосфора в растворе может быть объяснена образованием пересыщенных растворов фосфатов, в том числе, гидрофосфата кальция, который в отличие от дигидрофосфата кальция растворим слабо. На возможность образования пересыщенных растворов фосфатов указывалось и в [153]. В этой же работе авторы отмечали, что из-за возможности процессов переосаждения в растворах фосфатов процесс мобилизации фосфора плохо предсказуем.
Влияние экспериментальных образцов биопрепаратов на морфометрические показатели растений пшеницы и содержание фосфора в зерне
В результате проведенных исследований впервые изучены фосфатрастворяющие свойства штамма № 16 T. asperellum GJS 03-35 с использованием как модельного ТКФ, так и фосфатных руд различной структуры и состава. Показано, что, как и в случае других микроорганизмов, на мобилизацию им фосфора оказывают влияние не только природа источника углерода и энергии и источника азота, но также и фосфора.
Процесс высвобождения фосфора из минерального сырья под действием штамма № 16 T. asperellum GJS 03-35 имеет сложный механизм, обусловленный как участием органических кислот (глюконой и кетоглюконовой), так и выбросом протонов при поглощении клетками иона аммония. Однако полностью природа механизма до конца не выяснена так же, как и для многих других микроорганизмов, для которых не наблюдается соответствия уровня продукции кислот и количества растворенного фосфора [88; 153; 200].
Как и другие микроорганизмы, штамм № 16 T. asperellum GJS 03-35 значительно лучше растворяет модельное сырье – ТКФ, содержащее такое же количество фосфора, что и исследованные руды. Для различных руд наблюдали различный качественный и количественный состав кислот. Концентрация фосфора в растворе в случае ТКФ при 20 г/л глюкозы достигала 590 мкг/мл. Максимальные значения концентраций растворенного фосфора для рудного сырья под действием штамм № 16 T. asperellum GJS 03-35 в тех же условиях составляли 0,2 - 107 мкг/мл. Для сравнения, в таких условиях наиболее активные из известных в мировой практике бактериальные штаммы при растворении ТКФ высвобождали более 1600 мкг/мл фосфора, а для руд – более 500 мкг/мл [13]. Таким образом, штамм № 16 T. asperellum GJS 03-35 проявлял более низкие ФР свойства, чем наиболее активные из известных до сих пор микроорганизмов. В то же время по сравнению с другими грибами рода Trichoderma исследуемый штамм № 16 T. asperellum GJS 03-35 проявляет довольно высокую ФР активность при сходных условиях. В литературе описан только один штамм T. harzianum, имеющий более высокую ФР способность, чем штамм № 16 T. asperellum GJS 03-35.
Наиболее важным в проведенных исследованиях является доказательство возможности высвобождения растворимого фосфора под действием штамма № 16 T. asperellum GJS 03-35 из всех типов исследованных руд (океанические шельфо-вые, желваковые, апатитовые, ракушечные, остаточные метасоматические). Поэтому применение штамма № 16 T. asperellum GJS 03-35 совместно с доступными рудами может быть перспективно для улучшения фосфорного питания растений.
С целью создания эффективной смеси микроорганизмов с повышенной фос-фатрастворяющей и антифитопатогенной активностью проведен поиск совместимых со штаммом № 16 T. asperellum GJS 03-35 бактерий, обладающих высокими фосфатрастворяющими свойствами. Поскольку штамм № 16 T. asperellum GJS 03-35 обладает «двойными» свойствами - высокой антагонистической активностью и средними фосфатрастворяющими свойствами, то проводили поиск совместимого с ним бактериального штамма с высокими фосфатрастворяющими свойствами, обладающий также антагонистической активностью к фитопатогенам.
Всего проверено 116 активных бактериальных ФРМ на трех видах фитопато-генов. Обнаружено 43 микроорганизма в разной степени проявляющих антагонистическую активность по отношению к исследовавшимся патогенам растений, из них 21 изолят активен против всех трех патогенов. Из 21 ФРМ 10 штаммов полностью подавлялись штаммом № 16 T. asperellum GJS 03-35, 4 штамма наоборот, угнетали или подавляли рост T. asperellum, а 7 ФРМ - не оказывали значительного угнетающего действия на гриб и не подавлялись им. Из последних семи штаммов в качестве перспективного ФРМ для использования в смеси с № 16 T. asperellum GJS 03-35 выбрали штамм Pseudomonas sp. 181а, обладающий наибольшими ро-стстимулирующими свойствами для проростков пшеницы.
В рулонном опыте на проростках пшеницы показано, что совместная обработка двумя штаммами № 16 T. asperellum GJS 03-35 и Pseudomonas sp. 181а достоверно не обладает ингибирующим эффектом и может стимулировать рост растений в отличие от химического протравителя.
Поскольку комплексный препарат на основе смеси T. asperellum с бактериальным штаммом может применяться как на стадии обработки семян, так и при цветении колосьев, исследовали совместимость штаммов № 16 T. asp erellum GJS 03-35 и Pseudomonas sp. 181а с протравителями семян, фунгицидами, гербицидами и инсектицидами. Большинство исследованных пестицидов подавляли или замедляли рост T. asperellum. Штамм Pseudomonas sp. 181а показал хорошую совместимость со всеми исследовавшимися химическими пестицидами. Проведенные исследования для комплексного биопрепарата показали, что могут быть подобраны совместимые с ним протравители семян, гербициды и инсектициды. Совместное применение комплексного биопрепарата на основе изучаемых биоаге-нов с химическими протравителями может повысить эффективность последних. Это дает возможность включения разрабатываемых комплексных биопрепаратов в систему интегрированной защиты пшеницы от вредителей и болезней.
В вегетационном эксперименте на яровой пшенице сорта Иволга подтверждено, что T. asperellum является эффективным средством для борьбы с ФК пшеницы. Экспериментальный образец препарата на основе штамма Pseudomonas sp.181а при предпосевной обработке также снижал интенсивность заболевания и повышал урожай, но его эффективность была ниже, чем у штамма № 16 T. asperellum GJS 03-35. Совместная предпосевная обработка биопрепаратами, как при наличии инфицирования, так и при его отсутствии, показала аддитивный эффект по сухому весу растений и массе зерна с колоса по сравнению с применением препаратов по отдельности. Так, при наличии инфицирования F. graminearum прибавка урожая от применения только T. аsperellum составляла 10-13 %, от применения одного штамма Pseudomonas sp. 181а – 6-11 %, а от совместной предпосевной обработки биоагентами – 15,5-24,5 %.
