Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Сибирская язва: современные аспекты микробиологии, эпидемиологии и лабораторной диагностики (обзор литературы) 10
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы 30
2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу 30
2.2. Питательные среды 31
2.3. Аппаратное оснащение исследований 31
2.4. Тесты для идентификации штаммов В. anthracis 32
2.5. Получение и характеристика антигенных комплексов микроорганизмов 34
2.6. Физико-химические методы 35
2.7. Методы контроля антигенов и сывороток 35
2.8. Выделение иммуноглобулинов 35
2.9. Получение и контроль иммунофлуоресцирующих конъюгатов 36
2.10. Сублимация биологического материала 37
2.11. Характеристика лабораторных животных, использованных в опытах 37
2.12. Методы математической и статистической обработки результатов 38
Глава 3. Микробиологические аспекты по лучения специфических антигенов В. anthracis и сибиреязвенных антисывороток 39
3.1. Изучение фенотипических свойств сибиреязвенного микроба и близкородственных бацилл, взятых для исследования 39
3.2. Изучение ростовых свойств питательных сред различного состава и условий культивирования для накопления биомассы разных биологических форм сибиреязвенного микроба 46
3.3. Выделение специфических антигенов сибиреязвенного микроба 52
3.4. Получение споровых, капсульных-соматических и соматических сибиреязвенных гипериммунных сывороток 59
Глава 4. Получение иммуноглобулинов флуоресцирующих для идентификации сибиреязвенного микроба 70
4.1. Получение иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных антиспоровых, капсульно-соматических, соматических флуоресцирующих, изучение их диагностической ценности 72
4.2. Стабилизация свойств иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных методом сублимации 87
Глава 5. Получение сибиреязвенного аллергена (антраксина) для кожно аллергической пробы 94
Заключение 104
Выводы 119
Список литературы 121
Приложения 147
- Сибирская язва: современные аспекты микробиологии, эпидемиологии и лабораторной диагностики (обзор литературы)
- Выделение специфических антигенов сибиреязвенного микроба
- Получение иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных антиспоровых, капсульно-соматических, соматических флуоресцирующих, изучение их диагностической ценности
- Получение сибиреязвенного аллергена (антраксина) для кожно аллергической пробы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сибирская язва (антракс) — уникальная инфекционная болезнь животных и человека. Однажды возникнув в какой-либо местности, она может укореняться, сохраняя на многие десятилетия угрозу повторных вспышек.
По данным ВОЗ, сибирская язва продолжает регистрироваться среди животных в 158 странах мира и составляет 100-120 тысяч случаев в год. На территории России за период с 1900 года зарегистрировано более 35 тысяч, стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов и более 70 тысяч вспышек инфекции. Прогноз по этой инфекции в России на ближайшие годы остается неблагоприятным (Онищенко Г.Г., 2002; Онищенко Г.Г., Верещагин А.И., 2005).
Возбудитель сибирской язвы способен проникать в организм человека и животных через повреждения кожных покровов, кишечный тракт и дыхательные пути, вызывая развитие кожной и висцеральной формы заболевания, которое в большинстве случаев заканчивается летально вследствие развития сепсиса. Сам. возбудитель этого заболевания обладает способностью образовывать споры, высоко устойчивые к неблагоприятным факторам внешней среды, что обусловливает его длительное сохранение в анабиотическом состоянии в природе. Эта особенность споровой формы палочки антракса способствует созданию долговременных стационарно неблагополучных пунктов, что приводит к,постоянной угрозе заражения людей и развитию эпизоотии.
Несмотря на значительное количество методов лабораторной диагностики сибирской язвы, среди ускоренных и экспресс-методов люминесцентная микроскопия занимает ведущее место. Кроме того, это - самый быстрый и надежный метод исследования, позволяющий в течение 3-5 часов дать ускоренный ответ на наличие в исследуемом материале сибиреязвенного микроба. Основную роль для ранней и ретроспективной диагностики сибирской язвы и выявления иммунологической поствакцинальной или постинфекционной перестройки организма играет кожно-аллергическая проба с сибиреязвенным аллергеном (Онищенко ГГ.».Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др., 1999; Буярова СВ., Хаертынов К.С., Галиуллин А.К. и др., 2000). На сегодняшний день лабораторные службы не обеспечены сертифицированными препаратами для диагностики сибирской язвы (Куличенко А.Н., Еременко Е.И., Цыганкова О.И., 2008). Поэтому исследования в этом направлении остаются весьма актуальными.
Цель исследования: разработка иммунобиологических препаратов для идентификации Bacillus anthracis и диагностики сибирской язвы.
Основные задачи исследования:
-
Изучить штаммы микроорганизмов, взятые для исследования, по основным идентификационным тестам.
-
Изучить ростовые свойства питательных сред различного состава и условия культивирования для накопления микробной массы В. anthracis (споровой, капсульной и соматической форм).
-
Выделить специфические антигены из различных биологических форм сибиреязвенного микроба (споровой, капсульной и вегетативной).
-
Получить споровые, калсульно-соматические и соматические сибиреязвенные антисыворотки.
-
Получить иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические, споровые, капсульно-соматические флуоресцирующие, провести лабораторные испытания иа гомологичных и гетерологичньгх штаммах микроорганизмов.
-
Модифицировать способ изготовления сибиреязвенного антигена (ан-траксина) для кожно-аллергической пробы.
Научная новизна работы. Разработан научно-методический подход к выделению специфических антигенов В. anthracis, находящегося в споровой и вегетативной формах, а также его капсульного вещества.
Получены споровые, капсульно-соматические, соматические высокоактивные кроличьи антисыворотки на основе оптимальной комбинации различных специфичных антигенов сибиреязвенного микроба и иммунокорректоров с различным механизмом действия.
Для повышения специфичности сибиреязвенных сывороток применен регенерируемый аффинный сорбент с магнитными свойствами, позволяющий ускорить и упростить процесс сорбции неспецифических антител.
Практическая значимость работы. Разработанные методические приемы по накоплению биомассы сибиреязвенного микроба, извлечению из нее специфических антигенов, получению высокоактивных иммунных сывороток, выделению из них иммуноглобулинов, оптимизация параметров конъюгации IgG и флуорохрома позволили получить сибиреязвенные флуоресцирующие споровые, соматические, капсульяо-соматические иммуноглобулины для идентификации сибиреязвенного микроба.
Модификация технологии производства аллергена сибиреязвенного (ан-траксина) позволила'снизить потери конечного продукта, увеличить срок годности с двух до трех лет и сохранить все его свойства.
Материалы научных разработок легли в основу 2 нормативных документов, утвержденных на федеральном уровне: регламент производства № 1458-04 «Аллерген сибиреязвенный жидкий для внутрикожной пробы (антраксин)» и фармакопейная статья предприятия 42-0397782706 «Аллерген сибиреязвенный жидкий для внутрикожной пробы (антраксин), раствор для внутрикожного введения».
Одобрена Ученым советом СтавНИПЧИ и утверждена директором института НД: пусковой регламент, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные капсульно-соматические люминесцирующие сухие (протокол № 3іот 30.03.2007 г.); пусковой регламент, технические условия, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические адсорбированные флуоресцирующие сухие (протокол № 7 от 31.10.2008 г.); пусковой регламент, технические условия, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные споровые адсорбированные флуоресцирующие сухие (протокол № 9 от 26.12.2008 г.).
Положения, выносимые на защиту:
-
Определены микробиологические и биотехнологические приемы и условия,
-
обеспечивающие получение высокоспецифичных антигенов сибиреязвенного микроба, находящегося в трех биологических формах: споровой, инкапсулированной, бескапсульной (вегетативной).
-
Разработанные схемы иммунизации кроликов-продуцентов (дозы антигенов, временные интервалы, способы и кратность их введения, комбинации иммунокорректоров с различным механизмом действия) позволяют получать высокоактивные, специфичные сибиреязвенные споровые, кап-сульные и капсульно-соматические гипериммунные антисыворотки практически у 100 % животных.
-
Модификация основных этапов изготовления аллергена-антраксина (экстракция, очистка) и разработанный ускоренный режим его лиофилизации с защитной средой высушивания сокращают время производства и потери продукта, увеличивают срок годности препарата до трех лет при сохранении всех его свойств.
-
Разработанные иммунобиологические препараты (флуоресцирующие иммуноглобулины и аллерген-антраксин) отвечают требованиям, предъявляемым к индикационным препаратам, и демонстрируют высокую эффективность при диагностике сибирской язвы и идентификации различных биологических форм В. anthracis (споровой, инкапсулированной, вегетативной).
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на VI Межгосударственной научно-практической конференции Государств-участников СНГ (Волгоград, 13-14 сентября, 2005); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества Независимых Государств» (Оболенск, 3-5 октября, 2006); Втором съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 15-17 ноября, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 21-22 ноября, 2006), Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине основания Военно-медицинской академии «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 17-18 апреля, 2008); расширенной научной конференции лабораторий и отделов СтавНИПЧИ Роспотребнадзора (Ставрополь, 2009).
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 13 опубликованных научных работах, в том числе 1 работа - в периодических изданиях из перечня рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы,' приложений. Работа изложена на 163 страницах, содержит 13 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 217 источников, из них 156 отечественных и 61 зарубежный.
Сибирская язва: современные аспекты микробиологии, эпидемиологии и лабораторной диагностики (обзор литературы)
Согласно определителю бактерий Берги (Краткий определитель бактерий Берги, 1980), сибиреязвенный микроб Bacillus anthracis относится-к семейству Bacillacea, роду Bacillus. Многие представители рода Bacillus могут вызывать, различные патологические процессы в организме человека и животных. Ряд авторов (Азизбекян P.P., Белых Р.А., 1981) выделяли в роду Bacillus группу САМ (Cereus —Anthracis - Mycoides). В настоящее время возбудитель сибирской язвы относится к группе Bacillus cereus, объединяющую близкородственные видьь Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides и Bacillus weichenste-phanensis. Более того, многие данные генетического- анализа позволяют прийти к заключению о принадлежности перечисленных бацилл к одному, виду. Об этом может свидетельствовать почти стопроцентная гибридизаци-онная гомология их хромосомных ДНК, результаты многолокусного элек-трофоретического анализа фрагментов, сравнительное определение последовательностей нуклеотидов.9 генов из пяти штаммов,Я cereus, В , anthracis и В. thuringiensis и то обстоятельство, что генетические дистанции между несколькими штаммами В. cereus оказались большими, чем между В. cereus и В. anthracis, а также между В. cereus и В. thuringiensis (Kolsto А.В., Helgason R, Caugant D.A. et al., 1999). Эти бациллы связывает происхождение от общего предшественника, общие морфологические, культуральные и физиологические свойства (Африкян Э.К., 1973; Завирюха А. И., Степанюк О. П., 1978; Brown E.R., Moody M.D., 1958). Ввиду этого, дифференциальная диагностика их бывает непростой.
В ходе инфекционного процесса в организме восприимчивого хозяина возбудитель сибирской язвы синтезирует капсулу и экзотоксин, которые являются-факторами вирулентности (Езепчук Ю.В. 1968; Гинсбург Н.Н., 1975; Езепчук Ю.И., Вымев В., Сиромашкова М. и др., 1978; Thome СВ., Belton F.C., 1957; Thome СВ., 1960). Феномен капсуло- и токсинообразования у вирулентных штаммов удается воспроизвести in vitro (Бургасов П.Н., Черкасский Б.Л., Марчук Л.М. и др., 1970; Ivanovisc G. 1937; Meynell Е., Meynell G.C., 1964). Факторы вирулентности детерминируются плазмидами токсинообразования pXOl и капсулообразования рХ02 (Mikesell P., Ivins Р.Е., Ri-strophJ.D. et al., 1983; Green B.D:, Battisti L., Koehler T.M. et al., 1985; Uchi-da I., Sekizaki Т., Hashimoto K. et al., 1985).
Возбудитель сибирской язвы - В. anthracis представляет собой относительно крупную палочку, длиной 3-8 (иногда до 10) мкм, шириной 1-1,5 мкм. Встречается в 2 формах - бациллярной (вегетативной) и споровой. Обладает способностью образовывать капсулу, покрывающую как отдельные особи, так и несколько микробных клеток одновременно.
Вне организма человека и животного сибиреязвенный микроб может u образовывать споры, обладающие феноменальной устойчивостью к воздей ствию различных физико-химических факторов. В споровой форме сибире язвенный микроб способен сохраняться десятилетиями в объектах внешней среды и особенно в почве. Благоприятными условиями для пребывания воз будителя сибирской язвы в почве являются - высокая ее порозность, хоро- шая воздухопроницаемость, достаточная влагоемкость. Оптимальными усло виями для сохранения и вегетации возбудителя сибирской язвы в почве яв ляются: среднемесячная температура воздуха — 17-26 С, относительная влажность - 40-80 %, рН - 6,5-7,5, содержание гумуса - 4-8 %. В этих усло виях захоронение трупов больных животных потенциально опасны в течение длительного времени. Так, при анализе 1171 пробы почвы скотомогильников 30-50 летней давности в 19 случаях удавалось выделить культуры сибиреяз венного микроба, сохранившие способность к споро- и капсулообразованию, антигенные, биохимические и вирулентные свойства (Онищенко Г.Г., Ва сильев Н.Т., Литусов Н.В. и соавт., 1999).
Устойчивость возбудителя сибирской язвы в почве обусловила появление понятия «стационарно неблагополучный по сибирской язве пункт», ко 12 торым обозначают отдельные населенные пункты, отдельные участки пастбищ, выгонов, скотопрогонных трасс, где возникали случаи заболевания животных или людей сибирской язвой независимо от срока давности их регистрации (Черкасский Б.Л., 2002).. Наличие стационарно неблагополучных пунктов способствует возникновению потенциально опасных по сибирской язве территорий, что приводит к развитию эпизоотических и эпидемических вспышек этого заболевания (Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др., 1999).
Сибирская язва относится к зооантропонозам - инфекционным заболеваниям, общим для животных и человека. Основным источником заражения человека являются больные сельскохозяйственные животные. Наиболее восприимчивыми к сибирской язве являются мелкий (овцы, козы) и крупный рогатый скот, верблюды, лошади, ослы, олени и травоядные дикие животные. Менее восприимчивы свиньи. Собаки, кошки и дикие хищные животные за-; болевают сибирской язвой весьма редко. Хищные птицы, оставаясь здоровыми, способны передавать возбудитель сибирской язвы. Из лабораторных жи-, вотных весьма чувствительны к сибирской язве белые мыши, морские свинки, кролики, сирийские зототистые хомячки, обезьяны (Маринин Л.И., Дят-ловИ.А., Мокриевич А.Н. и др., 2009).
Больные сибирской язвой животные заразны в течение всего периода болезни, выделяя-возбудителя во1 внешнюю среду с мочой, калом, кровянистым экскретом легких, слюной и т. п. После их гибели заразными являются все органы и ткани, Вгтом числе шкура, шерсть, кости и др. Невскрытый труп павшего животного заразен в течение 7 суток (Бургасов П.Н., 1970).
Сибиреязвенная инфекция протекает тяжело и скоротечно, нередко заканчиваясь летально, особенно при висцеральной (генерализованной) форме. Летальность при висцеральной форме составляет 85-100 %. Даже при неос-ложненной кожной форме заболевания отмечены смертельные случаи (Макаров Н.И., Скляров В.Я. и др., 1963). Для развития заболевания достаточно проникновения в организм незначительного количества вегетативных клеток или спор сибиреязвенного микроба. Передача возбудителя сибирской язвы от больных животных человеку происходит в следующих условиях:
- уход за больными животными, при котором открытые части тела человека соприкасаются с заразными выделениями животных, а также с предметами, загрязненными-этими выделениями;
- ветеринарная помощь больным и вскрытие трупов павших от сибирской язвы животных, когда руки соприкасаются с такими выделениями;
- убой агонизирующих животных, снятие шкуры, разделка туши;
- обработка сырья, полученного от больных сибирской язвой животных, и использование такого сырья (шкуры, кожа, шерсть, пушнина, кости и др-);
- кулинарная обработка и употребление в пищу мяса и мясопродуктов от больных животных;
- перенос возбудителя инфекции кровососущими насекомыми от больных животных человеку.
По данным ВОЗ, сибирская язва продолжает регистрироваться среди людей и животных в 158 странах мира. Заболеваемость сибирской язвой в мире составляет 100-120 тыс. случаев в год (Бургасов П.Н., Рожков Г.И., 1984).
Сибирская язва встречалась во многих регионах бывшего СССР. В последнее десятилетие существования СССР (1980-1990 гг.) ежегодно регистрировалось в среднем около 450 случаев сибирской язвы среди животных и около 230 случаев среди людей, летальность составляла около 2,5 %. После распада СССР изменились социально-экономические, санитарно-гигиенические условия жизни, медицинское и ветеринарное обеспечение в большинстве стран СНГ, в том числе и в России. Наличие десятков и сотен стационарно неблагополучных пунктов и почвенных очагов практически; на каждой, административной территории определяют сибирскую язву как серьезную социально-экономическую проблему (Буравцева Н.П., Еременко Е.И., Абгарян А.Г. и др., 1999). Прогноз по этой инфекции в России на ближайшие годы остается крайне неблагоприятным. Основными причинами, обуславливающими заболеваемость сибирской язвой людей и сельскохозяйственных животных, являются неудовлетворительное ветеринарно-санитарное- состояние скотомогильников, неполный учет сельскохозяйственных животных и их охват вакцинацией, малая изученность распространения сибирской язвы в прошлом, в результате чего многие неблагополучные пункты остаются невыявленными. В то время как для правильного планирования противосибиреязвенных мероприятий необходимо иметь сведения-о территориальном распространении сибирской язвы за длительный период времени (Онищенко Г.Г., 2002).
В последнее время проводятся разносторонние исследования по картографированию и созданию атласов-кадастров-стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов во многих регионах нашей страны, в частности, в Южном Федеральном Округе (Буравцева Н.П., Абгарян А.Г, Бутаев Т.М., и др., 2002).
Общая обстановка посибирской язве в мире-за последние 30 лет мало в чем изменилась.с точки.зрения географии этой болезни. Типичные проявления сибирской язвы последних лет в развитых странах представлены отдельными случаями заболеваний людей в результате инфицирования-при контакте с импортированным сырьем или продукцией животноводства. Число-подобных случаев может увеличиваться в связи с расширением,импорта из неблагополучных по сибирской язве стран.
Выделение специфических антигенов сибиреязвенного микроба
В организме человека и животных, а также при определенных условиях культивирования вокруг клеточной оболочки вегетативных клеток вирулентных штаммов В. anthracis образуется капсула. Эти структуры в живой бактериальной клетке находятся в постоянном функциональном взаимодействии. Однако наряду с этим, каждой из них присущи специфические, морфологические, химические и функциональные особенности, позволяющие дифференцировать их в антигенном отношении.
Первым антигеном, выделенным из вегетативных клеток сибиреязвенного микроба, был полисахаридный антигенный комплекс. Последний связан с телом клетки, поэтому его считают соматическим (Бабич М.А., Плотников В.А., 1952; Езепчук Ю.В., 1968; Barber G., Zilistian Е., Nafta I., 1957; Barber G., Petrovic A.L., Zilistian E. et al., 1957). Полисахариды сибиреязвенного микроба имеют существенные различия в биохимической структуре с полисахаридами бацилл близкородственных видов (Ziperle G.F., Ezzell J.W., Doyle R.J. 1984). Еще G. Ivanovics, J. Folder (1958), L. Mester, E. Moclar, G. Ivanovics (1962), которые первыми обнаружили наличие полисахаридов в клеточной стенке сибиреязвенного микроба, полагали, что некоторые из них являются видоспецифическими и могут иметь важное значение для дифференциации возбудителя сибирской язвы от близкородственных сапрофитов. Выделенные и очищенные специфические соматические антигены В. anthracis открывают новые перспективы в конструировании диагностических препаратов, поскольку эти антигены устойчивы в окружающей среде и обладают выраженной иммуногенной активностью при гипериммунизации ими животных (Кузьмин Н.А. 1971; Ezzell J.W., Abshire T.J., Litte J.F. et al., 1990; Ekurinite F.S., Singh I., Tayler K.A., 1991).
Структуру клеточной стенки возбудителя сибирской язвы образуют также соединения белковой природы. С помощью иммунохимических методов в дезинтегрированных вегетативных клетках В. anthracis выявлено более 20 белковых антигенов (Митин С.С., 1981; Никитин А.В., 1981; Лопаткин О.Н.,. Кронгауз И.В ., 1985). Белковые соматические антигены обладают намного более выраженными иммунологическими свойствами, чем полисаха-ридные, и при иммунизации ими животных-продуцентов получают высокоактивные иммунные сыворотки, на основе которых разработаны высокочувствительные тест-системы для индикации и идентификации сибиреязвенного микроба, а также диагностики заболевания (Ezzell J.W., Abshire T.G., 1988; Phillips А.Р., Ezzell J.W., 1989). Специфический соматический белковый антиген был выделен из культурального фильтрата1 вегетативных клеток В. anthracis Sterne 34F2 (Абалакин В.А., Сергеева-Л.В!, Черкасский Б.Л., 1989). Авторы характеризовали его как структурный антиген клеточной поверхности возбудителя сибирской язвы, а его обнаружение в культуральном фильтрате объяснили лизисом клеток и высвобождением антигена в культураль-ную среду.
Споровая поверхность возбудителя сибирской язвьг содержит не менее пяти видоспецифических сибиреязвенных антигенов. Их изоляция сопряжена со-значительными трудностями ввиду плохой растворимости, экстрактивно-сти и больших потерь в процессе очистки. При этом отмечается выраженная-гетерологичностЬ) споровых сибиреязвенных антигенов, а также структурная и антигенная общность с аналогичными компонентами близкородственных спорообразующих микроорганизмов. (Кузьмин Н.А., 1968; Лопаткин О.Н., Кронгауз И.В., 1986; Fluck R., Bohm R., Strauch D., 1977; Quinn S.P., Turnbull P.S.B., Melling I., 1990; Farchaus J.W., Ribot W.J., Downs M.B., 1995). Капсула В. anthracis имеет слоистую структуру. Ее мембраноподобный внешний слой состоит из полипептида и нейтральных мукополисахаридов. В среднем слое капсулы обнаружен комплекс, состоящий из полипептида и полисахарида, внутренний слой содержит кислые мукополисахариды (Бурденко Т.А., Маслин Г.М., 1974; Goodmen J.W., Nitecki D.E., 1966; Vancurik J., Schneiderka P., 1971). По химической природе капсульное вещество сибиреязвенного микроба представляет собой монотонный полипептид Д-глутами-новой кислоты. Молекула пептида имеет форму неразветвленной нити, что позволяет отнести его к линейным полимерам. Каждая пептидная цепь состоит из 50-100 аминокислотных оснований. По химической и конформаци-онной структуре, молекулярному весу, степени фагоцитарной- активности и антигенному строению капсульное вещество вирулентных и авирулентных штаммов сибиреязвенных бацилл практически идентично (Лопаткин О.Н., Буравцева Н.П., Фунтикова Т.Н. и др., 1978; Лопаткин О.Н., Буравцева Н.П., Фунтикова Т.Н. и др., 1979; Goodmen J.W., Nitecki D.E., 1966 и др.).
Выделение антигенов микроорганизмов,в большинстве случаев осуществляется после их перевода в растворимое состояние. Для этого применяют экстракцию трихлоруксусной кислотой, фенолом, солевыми растворами, эфиром, хлороформом, петролейным эфиром, с помощью кислотного и щелочного гидролиза. Получаемые при этом экстракты имеют различные физико-химические свойства и спектр антигенов. Кроме того, многими исследователями для извлечения антигенных компонентов из микробной клетки использовались различные методы ее разрушения: химический, физический, механический (Вейнблат В.И., Вельская Н.А., Митина B.C., 1971; Станиславский Е.С., 1971; Гуревич Г.А., Кудрявцев А.А., Фихте Б.А., 1972; Васильев Н.В., Луцюк Н.Б., Палий Г.К. и др., 1984; Афанасьев Е.Н., 2000; Kabat Е.А., Mayer М.М., 1968).
В основе широко используемых физических методов дезинтеграции лежит один и тот же универсальный механизм высокоградиентных течений жидкости. Под воздействием ультразвуковых волн, прежде всего, наступает разрушение структуры клетки микробов, а изменения химических веществ, находящихся в них, происходит гораздо медленнее, что обеспечивает возможность получения различных активных комплексов, близких к нативным. Применяя ультразвуковые колебания различной частоты, интенсивности и варьируя длительностью воздействия на микробные клетки, можно получать эффект от слабовыраженных изменений в биологических свойствах до селективного и полного разрушения микробных клеток (Жданова Л.Г., Перс И.Ф., 1961; Шин H.F., Ременцова М.М. и др., 1973).
Для более полного извлечения водорастворимых антигенных компонентов сибиреязвенного микроба (споровой и вегетативной форм) мы взяли за основу методику получения таких антигенов возбудителей особо опасных инфекций; использованную Е.Н. Афанасьевым (1984), И.С. Тюменцевой (1996), в-которой объединены два метода: водно-солевая экстракция и ультразвуковая дезинтеграция. В силу того, что споры В. anthracis оказались довольно устойчивы к воздействию УЗ-дезинтеграции, для разрушения спор мы предварительно проводили экструзию на Х-прессе — пятикратное продав-ливание через фильеры замороженной при минус (45+5) С биомассы. Кроме этого, при получении III фракции соматического и спорового антигена мы вдвое увеличили концентрацию раствора натрия хлорида, в который дополнительно добавили 1 % раствор тритона Х-100, который является лучшим реагентом, позволяющим максимально увеличить число, а также выход растворимых компонентов мембран, выделяемых в неденатурируемых условиях.
Автоклавированные при 2 атм 1,5 часа биомассы споровой и вегетативной форм сибиреязвенного микроба В. anthracis Sterne 34F2 (см. гл. 3) экстрагировали 2,5 % раствором натрия хлорида 24 часа при постоянном перемешивании: После чего центрифугировали при 6000 об/мин (45+5) мин и температуре (6+2) С, супернатанты отбирали (Аг I фракция), а осадок клеток суспендировали в 2,5 % растворе натрия хлорида и дезинтегрировали. УЗ-дезинтеграцию проводили на аппарате УЗДН-2Т при 44 кГц в течение 20 мин. После чего центрифугировали при 6000 об/мин, супернатант (Аг. II фракция) соединяли с первой фракцией. Детриты суспендировали в 5% растворе натрия хлорида с добавлением тритона Х-100, экстрагировали в течение 24 часов при постоянном перемешивании. Затем центрифугировали при 15000 об/мин (45+5) мин и температуре (6+2) С, получая супернатант (Аг III фракция), который соединяли с предыдущими двумя. Диализировали против дистиллированной воды, разливали в ампулы ШПВ-6 и лиофилизировали. Детрит суспендировали в дистиллированной воде и также лиофилизировали. Все манипуляции по изоляции антигенов проводили на холоду при 4 С. Процедура выделения водорастворимых антигенных комплексов сибиреязвенного микроба схематично представлена на рисунке 2.
Очищенное капсульное вещество получали последовательными манипуляциями, представленными на рисунке 3. В основу методики положен способ, изложенный О.Н. Лопаткиным, Н.П. Буравцевой, Т.Н. Фунтиковой и др. (1979), в нашей модификации, заключающейся в увеличении концентрации натрия хлорида в- экстрагирующем растворе до 3 %, в преципитирующем растворе (NH SOi до 60 %, сокращении срока диализа на 24 часа и введении этапа1 ультрафильтрации на сефадексе G-100 на конечном этапе.
Выращенную на сывороточно-бикарбонатном агаре Хоттингера в атмосфере 50 % углекислоты капсульную форму В. anthracis 71/12 смывали 3 % раствором натрия хлорида, добавляли 10 % раствор формалина и мелкие стеклянные бусы. Встряхивали на шюттеле (6,5+0,5) час, после чего оставляли на (21+3) часа на холоду. Затем центрифугированием при 6000 об/мин (45+5) мин и температуре (6+2) С, отделяли супернатант и добавляли соль (NH4)2S04 до 60% насыщения. Формирование осадка проводили в течение (21+3) часа на холоду.
Получение иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных антиспоровых, капсульно-соматических, соматических флуоресцирующих, изучение их диагностической ценности
При определении специфичности полученных гипериммунных сибиреязвенных сывороток на 46 штаммах-сапрофитах (В. cereus, В. subtilis, Bacillus, spp., В. thiiringiensis, В. megateriiim) в НРИФ наблюдалось свечение на 2-3 креста.у 5-ти штаммов , cereus (10,8 %), 2-х - В. megaterium (4 3 %) и 2-х - В: subtilis (4,3 %). Вследствие чего возникала необходимость в сорбции неспецифических антител.
Истощение антител при использовании в качестве адсорбентов микробных клеток широко применялось.в сывороточном производстве (КарповСП., Прегер С.М1, Синельников Г.Е. и др. 1976; Смирнов В.В., Чаплинский В Я.,, Андреева З.М., 1980). Однако, как показала практика, сорбция корпускулярными антигенами существенно понижает специфические титры антител, зачастую, приводя к полной непригодности сырья. При сорбции сывороток с использованием твердофазных полиакриламидных сорбентов на основе водорастворимых антигенов из гетерологичных штаммов не происходило попадания в.сыворотки антигенного материала, и в них отсутствовал комплекс «антиген-антитело», мешающий в дальнейшем созданию диагностических систем. Такая иммуносорбция приводила к повышению специфичности сывороток. Титры антител снижались незначительно (в 1,5-2 раза) и конечный продукт оставался качественным сырьем для дальнейшей работы. (Лопаткин О.Н., Кронгауз И:ВЬ 1983; Тюменцева И.С., 1996; Афанасьев Е.Н., 2000).
Так как технология приготовления полиакриламидных сорбентов включает использование высокотоксичных импортных реактивов и трудоёмка, для иммуносорбции неспецифических антител из сибиреязвенных сывороток мы применили алюмосиликатный антигенный магноиммуносорбент, предложенный И.В. Жарниковой (2004).
Кремнезем-алюмосиликат является мелкодисперсным наполнителем, представляющим собой комплексные анионы алюминия и кремния с избыточным отрицательным зарядом, который компенсирован щелочноземельными металлами. Носитель обладает повышенными адгезионными свойствами по сравнению с полиакриламидами, что позволяет смешивать его с магнитным порошком без предварительной подготовки последнего. Процесс получения магносорбента заключался в следующем: к алюмосиликатному наполнителю добавляли 3 % водный раствор полиглюкина.(декстрана) и магнитный порошок (Fe203) (соотношение компонентов синтеза 2:2:1, соответственно Fe203, декстран, алюмосиликат). Перемешивали и проводили геле-образование при температуре (22+4) С 2 часа, рН гелеобразования - 7,0. Полученный сорбент высушивали при температуре 100-110 С в течение 30 мин, измельчали и методом рассева выделяли фракции с размером частиц 80-120 микрон.
Для химического активирования поверхности магносорбента производили модифицирование твердофазного носителя, для чего к 1 г полученного алюмосиликатного магносорбента приливали 7,5 0,1 М ФСБ и 0,5 мл вторичного алкилсульфата натрия. Это поверхностно-активное вещество (ПАВ) образует на поверхности частиц сорбента мономолекулярный адсорбционный слой, препятствующий сближению частиц, их агрегированию и образованию пространственных структур. Для придания- магносорбенту аффинных свойств на его поверхность иммобилизировали белковые лиганды - водорастворимые антигены, полученные из гетерологичных штаммов микроорганизмов - В. cereus 250, В. cereus 104, В. cereus 111, В. cereus 8, В. megaterium 5. Концентрацию белка в антигенах доводили до 1,5 мг/мл, используя 0,1 М раствор ФСБ. К 1 г сорбента добавляли 15 мг белка, смешивая названные антигены в равных пропорциях. Смесь инкубировали в течение 2 часов при (22+4) С, периодически помешивая, затем трижды отмывали 0,1 М раствором ФСБ от несвязавшихся компонентов.
Иммунособцию проводили дважды, соединяя 10 мл иммунной сыворотки с 1 г магноиммуносорбента. Смесь инкубировали при 37 С в течение 6 часов или при температуре 4 С - 16 часов на шуттель-аппарате. После инкубации, используя постоянный магнит для фиксации МИС, сыворотку сливали. Сорбент регенерировали ЗМ раствором калия роданистого и отмывали 0,1М фосфатно-солевым буфером рН (7,3+0,1). Такой сорбент после процедур регенерации можно использовать до 10-15 раз. Магнитные свойства им-муносорбента позволили упростить процесс отделения его от жидкой фазы в магнитном поле и исключить процесс длительного центрифугирования. При сорбции иммунных сывороток использование данного иммуносорбента позволило не только освободить их от неспецифических антител на одном этапе, но и сохранить первоначальную активность нативных сывороток.
Способы выделения иммуноглобулинов из иммунных сывороток отличаются большим разнообразием и эффективностью.
Для сравнительного изучения мы избрали три метода выделения IgG: сульфатом аммония, каприловой кислотой и полиэтиленгликолем (Горобец Е.А., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С. и др., 2006).
Выделение иммуноглобулинов сульфатом аммония проводили следующим образом: к сыворотке добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивали 30 мин, инкубировали 12 час при температуре 4-6 С, центрифугировали при 4000 об/мин в течение 40 мин, суперна-тант удаляли, а осадок ресуспендировали в дистиллированной воде и добавляли равный объем раствора сульфата аммония. Процедуру осаждения проводили дважды. Последний осадок растворяли в первоначальном объеме дистиллированной воды и диализировали (рисунок 8).
Осаждение иммуноглобулинов октановой (каприловой) кислотой проводили следующим образом: к 40 мл сыворотки добавляли 64 мл 0,06 М раствора ацетатного буфера и 2,8 мл кислоты, интенсивно перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 мин. После центрифугирования при 4000 об/мин в течение 40 мин супернатант фильтровали через бумажный фильтр, осадок удаляли, а супернатант, представляющий собой иммуноглобулины, помещали на диализ против 0,1 М раствора фосфатно-солевого буфера, предварительно доведя рН до 7,2 (рисунок 9).
При преципитации ПЭГ-6000 (рисунок 10) смешивали равные количества иммунной сыворотки и 20 % раствора полиэтиленгликоля, рН 7,0. Раствор ПЭГ добавляли постепенно, перемешивая смесь на магнитной мешалке в течение 30 мин при температуре (22+4) С. Для формирования осадка оставляли смесь при 4 С на 18 час, затем центрифугировали при 4000 об/мин в течение 45 мин. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в дистиллированной воде рН 7,0 в объеме исходной сыворотки. Вновь добавляли равный объем 20 % ПЭГ и повторяли вышеописанную процедуру. После центрифугирования супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 0,1 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,2 до исходного объема сыворотки. В полученный раствор вносили хлоформ до конечной концентрации 1 % к общему объему, герметически закрывали и помещали на шуттель на 24 часа. После центрифугирования при 4000 об/мин осадок удаляли, а супернатант, содержащий глобулины, фильтровали через бумажный фильтр.
Иммуноглобулины, выделенные разными способами, оценивали по количественному содержанию белка в растворе, чистоте иммуноглобулиновой фракции в электрофорезе в агарозном геле, специфической активности в РИД и НРИФ(таблица 8).
Ставя перед собой задачу получения сибиреязвенных иммуноглобулинов для реакции иммунофлуоресценции, нам было необходимо подобрать оптимальные условия конъюгации иммуноглобулинов с флуоресцеин-5-изо-тиоцианатом: количество флуорохрома, значения рН и температуры реакцон-ной смеси, времени конъюгации, влияние молярных отношений Мф/Мб на серологическую активность конъюгатов), а также изучить физико-химические свойства, чувствительность и специфичность конъюгатов.
Конъюгацию IgG с ФИТЦ проводили по методу A. Storz (1987). Для метки ФИТЦ использовали иммуноглобулины с концентрацией белка 10 мг/мл. Краситель добавляли медленно к раствору белка при постоянном помешивании. Присоединение ФИТЦ к белку всегда происходит в щелочной среде. По данным литературы (Лопаткин О.Н., Фунтикова Т.Н., Буравцева Н.П. и др., 1983; Тюменцева И.С., 1996), наилучшими условиями являются показатели рН 8,5-9,0. Используя 0,1 М фосфатный буферный раствор, нами изучены значения рН 8,5; 9,0; 9,5 и две нагрузки красителя: 20 мг и 25 мг на 1 г белка. Время контакта красителя с белком в наших экспериментах составляло 1; 2; 4; 12 часов. Температурный режим конъюгации (4+1) С, (20+1) С и (37+1) С. Конъюгацию иммуноглобулинов проводили при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Конъюгаты освобождали от несвязав-шегося флуорохрома гель-фильтрацией на колонках с сефадексом G-50 или G-25 с последующим элюированием конъюгата 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 8,5; 9,0; 9,5 соответственно рН конъюгации). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм (область максимального поглощения для белка) и 495 нм (область максимального по: глощения для ФИТЦ).
Получение сибиреязвенного аллергена (антраксина) для кожно аллергической пробы
В комплексе мероприятий по борьбе с сибиреязвенной инфекцией важное место занимает своевременная диагностика заболевания у людей и животных. Основную роль для ранней и ретроспективной, диагностики сибирской язвы и выявления иммунологической поствакцинальной или постинфекционной перестройки организма играет кожно-аллегическая проба с сибиреязвенным аллергеном, отличающаяся простотой постановки и доступностью для любых лечебно-профилактических учреждений и в полевых условиях.
Проба с антраксином проводится, для диагностики сибирской язвы, в том числе и. ретроспективной (без ограничения! возраста), а так же для определения иммунологической перестройки организма у вакцинированных лиц в возрасте 14 лет и старше (Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н!В. и со-авт., 1999).
Диагностический, аллергический препарат (антраксин) был разработан в-1937 г. А. Петровыми Е. Киселевым для проведения1 сугубо лабораторных работ. Это был нативный,сибиреязвенный аллерген, получаемый из отечной жидкости морских свинок и кроликов,,инокулированных вакцинными штаммами СТИ-1 и второй вакциной Ценковского (Шляхов Э:Н., 1965). Дальнейшие совместные изыскания, проведенные З.Ні Шляховым и С.А. Шварцем, показали возможность получения более активного препарата сибиреязвенного аллергена, названного «химическим» (бестканевым) антраксином-(Шляхов Э.Н., Шварц С.А., 1970).
Производство антраксина было развернуто во ВНИИЭМ Молдавской Республики. В связи с распадом СССР с 1991 г. поставки препарата в Россию были прекращены. В связи с этим возникла необходимость организации производства антраксина для обеспечения практического здравоохранения России. С 1994 г. в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте началось освоение производственного выпуска сибиреязвенного аллергена и составление нормативной документации. В этой работе активное участие принимали доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Н.П. Буравцева, кандидат биологических наук Т.Н. Фунтико-ва, доктор медицинских наук, профессор И.С. Тюменцева, доктор медицинских наук, профессор Е.Н. Афанасьев. Впервые регламент № 399-97 на аллерген сибиреязвенный жидкий для внутрикожной пробы (антраксин) был утвержден ГИСК им. Тарасевича в 1997 г., а фармакопейная статья (ФС 42-3878-99) была утверждена в 1999 г. С этого момента в СтавНИПЧИ налажен коммерческий выпуск антраксина. По истечении срока действия НД и с учетом изменившихся требований к ее оформлению были составлены и утверждены новый регламент производства (РП № 1458-04) и фармакопейная статья предприятия (ФСП 42-0397782706), одним из разработчиков которых являлась автор настоящих исследований.
Основные этапы получения антраксина можно изложить следующим образом. Обеззараженную автоклавированием при температуре 120 С в течение 30 минут биомассу вегетативных клеток В. anthracis СТИ-1 разливают в стерильные кюветы наливом по 300-350 мл в каждую и лиофилизируют в сушильной камере, предварительно замораживая ее в низкотемпературном столе при температуре минус (45+1) С в течение 16-18 часов. Лиофилиза-цию- проводят в течение 24-28 часов, конечная температура высушивания (37+1) С. Высушенную биомассу фасуют во флаконы емкостью 50 мл, укупоривают резиновыми пробками и парафинируют.
Для получения антраксина из бакмассы удаляют липиды, используя аппарат Сокслета. Обезжиривание бакмассы сначала проводят диэтиловым эфиром при температуре (37+1) С, а затем хлороформом при температуре (80+1) С, по 6 часов каждый цикл. После чего препарат переносят для досушивания при (37+1) С в термостат на 3-4 часа. Экстракцию аллергена проводят 1 % раствором уксусной кислоты на водяной бане при температуре 100 С 3 часа, затем охлаждают, дальнейшую экстракцию проводят в холодильнике на шуттель-аппарате в течение (18+2) часов.
Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр. Осадок растворяют в 1 % растворе уксусной кислоты с последующим центрифугированием в течение (10+2) мин при 2000 об/мин. Центрифугат объединяют с полученным ранее фильтратом. Объем гидролизата доводят до первоначального дистиллированной водой, корректируя рН 10% раствором натрия едкого до 7,4-7,6.
Концентрация белка в аллергене должна быть 0,28-0,36 мг/мл.
Определяют токсичность препарата путем внутрибрюшинного введения по (0,5+0,05 мл) трем белым мышам массой (20+2) г или подкожного введения по (0,5+0,1) мл двум морским свинкам массой (300+50) г. Препарат является нетоксичным, если в течение трех суток с момента введения животные остаются живыми.
Контроль препарата на специфическую активность проводят следующим образом: иммунизируют морских свинок однократно подкожно в дозе (30+10)х105 спор вакцины сибиреязвенной СТИ-1. Пробы ставят в период от 2-х недель до одного месяца после иммунизации животных. Аллерген вводят асептически в объеме (0,1+0,001) мл внутрикожно в депилированную кожу боковой поверхности живота. Кожные реакции учитывают через 24-48 часов (рисунок 15).
При наличии положительной реакции менее, чем у трех из четырех иммунизированных животных проверку проводят повторно на удвоенном количестве животных. При повторном получении положительных реакций менее, чем у шести из восьми иммунизированных морских свинок препарат бракуют.
Контроль подлинности: аллерген вводят трем морским свинкам внутрикожно по (0,1+0,01) мл. Препарат вызывает положительную реакцию не менее чем у трех из четырех морских свинок через 2-4- недели после иммунизации (30+10)х105 спор вакцины сибиреязвенной СТИ-1. Техника проведения и учета результатов контроля такая же, как и при определении специфической активности.
Препарат разливают в ампулы по 1 мл, запаивают и стерилизуют в автоклаве при температуре (120+1) С в течение 30 минут.
Препарат представляет собой слабо кислотный гидролизат вегетативных форм вакцинного штамма сибиреязвенного микроба СТИ-1 после предварительной термической денатурации балластных белков.
Готовый антраксин - прозрачная, стерильная жидкость, бесцветная или бледно-соломенного цвета. В 1 мл препарата содержится 10 подкожных доз.
Антраксин вводят с соблюдением всех правил асептики строго внутри-кожно в количестве 0,1 мл в нижней трети левого предплечья на внутренней стороне. На месте инъекции должна образовываться беловатая, хорошо ограниченная папула около 0,8 см в диаметре, имеющая вдавление на месте волосяных мешочков. В месте введения антраксина через 24-48 ч учитывается наличие гиперемии и инфильтрата. В зависимости от размеров этих элементов производят оценку пробы, руководствуясь приведенной ниже шкалой (таблица 11).
Диагноз сибирской язвы подтверждается при наличии положительной антраксиновой пробы с оценкой от 2 до 4+. При наличии сомнительной (+) или слабоположительной (+) пробу следует повторить через 5-7 дней. Отрицательная реакция на антраксин не исключает диагноза сибирской язвы.
