Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Применение амплификационных технологий для выявления и идентификации возбудителя холеры 14
1.2 Применение молекулярно-генетических технологий для выявления и идентификации возбудителя сибирской язвы 21
1.3 Совершенствование исследований методом ПЦР с применением генно-инженерных технологий 32
Собственные исследования 35
Глава 2 Материалы и методы 35
2.1 Объекты исследования 35
2.1.1 Штаммы микроорганизмов 35
2.1.2 Реактивы, питательные среды, диагностические препараты
2.2 Культивирование микроорганизмов 47
2.3 Подготовка проб
2.3.1 Приготовление бактериальных взвесей 47
2.3.2 Подготовка проб биологического материала и объектов окружающей среды, искусственно контаминированных Bacillus spp. и гетерологичными микроорганизмами 48
2.3.3 Подготовка проб биологического материала и из объектов окружающей среды, искусственно контаминированных возбудителем холеры и гетерологичными микроорганизмами 49
2.3.4 Подготовка проб воды поверхностных водоемов 51
2.4 Выявление и идентификация холерных вибрионов из воды открытых водоемов с использованием бактериологического анализа 51
2.5 Обеззараживание проб 53
2.5.1 Обеззараживание проб, содержащих микроорганизмы рода Bacillus 53
2.5.2 Обеззараживание проб, содержащих V. cholerae и гетерологичные микроорганизмы з
2.6 Выделение ДНК из бактериальных суспензий, проб биологического материала и из объектов окружающей среды 53
2.7 Полимеразная цепная реакция 54
2.8 Программы и базы данных для анализа нуклеотидных последовательностей 55
2.9 Клонирование ПЦР-продукта в вектор pGEM, выделение рекомбинантной плазмиды и определение её концентрации 55
2.9.1 Подготовка ампликонов 55
2.9.2 Селекция рекомбинантных клонов 56
2.9.3 Выделение плазмидной ДНК рекомбинантного штамма Е. coli JM109 56
2.9.4 Определение концентрации ДНК 56
2.9.5 Определение количества ГЭ плазмиды pGEM со вставкой 57
2.10 Статистическая обработка полученных данных 57
Глава 3 Разработка способов выявления и ускоренной идентификации холерных вибрионов методом пцр с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 58
3.1 Выбор ДНК-мишеней 58
3.2 Подбор специфичных праймеров к выбранным локусам и оптимизация условий амплификации с различным способом учета результатов 72
3.3 Разработка стандартного образца предприятия для оценки эффективности амплификации ctxA и tcpA генов 78
Глава 4 Конструирование наборов реагентов для индикации и идентификации холерных вибрионов методом пцр с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов и оценка их диагностической эффективности 82
4.1 Описание тест-систем 82
4.2 Проведение анализа 84
4.3 Оценка чувствительности и специфичности созданных тест-систем в рамках межлабораторных испытаний 93
4.4 Оценка диагностической ценности сконструированного набора реагентов «Ген Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ» в рамках медицинских испытаний 96
ГЛАВА 5 Апробация сконструированных амплификационных тест-систем при идентификации штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории российской федерации, и при исследовании проб воды открытых водоемов 102
5.1 Идентификация штаммов холерных вибрионов 102
5.2 Проведение мониторинга воды поверхностных водоемов на наличие V. cholerae Ill
Глава 6 Оценка диагностической эффективности набора реагентов «амплисенс bacillus anthracis frt» в рамках медицинских испытаний 115
6.1 Подготовка целевой коллекции штаммов бацилл для оценки эффективности нового препарата для генной диагностики сибирской язвы 115
6.2 Подготовка проб для проведения медицинских испытаний набора реагентов «АмплиСенс Bacillus anthracis-FRT» 118
6.3 Результаты медицинских испытаний набора реагентов «АмплиСенс Bacillus anthracis-FRT»
Заключение 129
Выводы і37
Перечень сокращений, условных обозначений ш
Список использованной литературы i40
- Реактивы, питательные среды, диагностические препараты
- Выделение плазмидной ДНК рекомбинантного штамма Е. coli JM109
- Разработка стандартного образца предприятия для оценки эффективности амплификации ctxA и tcpA генов
- Оценка чувствительности и специфичности созданных тест-систем в рамках межлабораторных испытаний
Реактивы, питательные среды, диагностические препараты
Молекулярно-генетические технологии, в особенности полимеразная цепная реакция (ПЦР), получили широкое применение для выявления ДНК возбудителя холеры в нативном материале, ускоренной идентификации выделенных культур холерных вибрионов по эпидемической значимости и таксономическому положению, расширенной характеристике по наличию генов, расположенных в области мобильных генетических элементов СТХф, RSIo,, RSII, TLC,VPI-I, VPI-II, VSP-I, VSP-II; кластеров RTX, MSHA, T3SS, T6SS; коньюгативных элементов ICEs по типу SXT , интегрона 1 класса, а также локусов коровой части хромосом, ассоциированных с вирулентностью, жизнеспособностью, видовой и подвидовой принадлежностью.
Первые работы по применению ПЦР для детекции возбудителя холеры основаны на использовании в качестве ДНК-мишени одного из важных маркеров эпидемической значимости вибрионов - сїхА гена, определяющего биосинтез А-субъединицы холерного токсина (Четина и др., 1992; Глухов и др., 1996; Балахонов и др., 1998; Парамонов и др., 1998; Kobayashi et al., 1990; Fields et al., 1992; Salles et al., 1993; Varela et al., 1993; Shangkuan et al., 1995). Это позволило авторам выявлять холерные вибрионы и, одновременно, определять их токсигенность и эпидемическую значимость.
Впервые возможность обнаружения штаммов V. cholerae в биологическом материале, в частности, в испражнениях, на основании амплификации фрагмента ctxA гена размером 302 п.н. показали Shirai с соавторами (1991). Установлено, что жидкие испражнения больных холерой людей могут быть напрямую добавлены в реакционную смесь в объеме, не превышающем 10%. Varela с соавторами (1994) получили аналогичные данные при исследовании нативных образцов из ректальных тампонов. Применение ПЦР для анализа испражнений в условиях лечебного учреждения позволило с 100%-ной чувствительностью и 95,2%-ной специфичностью детектировать V. cholerae по сравнению с культуральным методом, причем в нескольких пробах не удалось обнаружить холерные вибрионы с помощью бактериологического метода (Hoshino et al, 1998). Сравнительный анализ методов ПЦР и ELISA, проведенный Ramamurthy с соавторами (1993), при исследовании испражнений на наличие возбудителя холеры, показал более высокую диагностическую чувствительность ПЦР.
Рядом авторов показана возможность обнаружения холерных вибрионов в пищевых продуктах (моллюски, крабы, овощи, фрукты) методом ПЦР с праимерами на основе ctxA гена (Koch et al, 1993; Popovic et al, 1994; DePaola, Hwang, 1995). Именно этот подход был использован Popovic с соавторами (1994) для установления источника и способа завоза возбудителя холеры в Нью-Йорк во время вспышки в 1991 году.
Kong с соавторами (2002) для выявления холерного вибриона в пробах воды предложили использование ПЦР с праимерами, комплементарными epsM гену V. cholerae, кодирующему продукцию экзополисахарида (EPS). Установлена эффективность обнаружения возбудителя холеры методом ПЦР, где в качестве ДНК-матрицы выступает ЫуА ген (Lyon, 2001; Shangkuan et al, 1995). В первом случае предложена система с зондами типа TaqMan и регистрацией результатов в режиме реального врмени, во втором - подобраны праймеры на область данного гена, содержащую делению 11 п.н., что позволило авторам провести биотипирование холерных вибрионов.
Ряд авторов при разработке ПЦР для выявления ДНК холерных вибрионов выбрали локусы, которые ранее не использовались для этих целей: recA, lolB, sodB, oriCIvc (Cho et al, 2013; Low et al, 2013; Madhusudana, Surendran, 2013; Roozbehani et al, 2012; Saha et al, 2006). Во всех случаях показана высокая специфичность разработанных ПЦР для определения видовой принадлежности холерных вибрионов. При выполнении анализа с праимерами на основе oriCIyc предусмотрена обработка амплифипируемого фрагмента рестриктазами Bglll и Mlul.
Важное место в механизме развития холеры, а также образовании токсигенных штаммов V. cholerae из нетоксигенных, занимают токсин-корегулируемые пили (TCP), которые являются рецептором для умеренного нитевидного фага СТХф (Смирнова и др., 1999; Herrengton et al, 1988; Attridge et al, 1993; Waldor, Mekalanos, 1996). Рядом авторов были разработаны ПЦР для выявления tcpA гена (Водопьянов и др., 1999; Парамонов и др., 1999; Сучков и др., 2000; Bengti et al., 1995; Faruque et al., 1997, 1998a). Изучение данного локуса у штаммов возбудителя холеры показало, что его нуклеотидная последовательность у вибрионов эльтор имеет отличие от таковой у штаммов V. cholerae классического биовара, что позволило исследователям разработать аллельспецифичную ПЦР и провести биотипирование токсигенных штаммов патогена (Keasler, Hall, 1993; Bertran et al, 1999; Rivera et al., 2001).
Фадеевой с соавторами (2012) предложен способ выявления tcpA различных типов методом ПЦР с помощью праймеров, один из которых расположен в области, кодирующей N-терминальную часть молекулы пилина TcpA, а второй - на участке, примыкающем к гену с 3 конца. Разработанный прием был апробирован более, чем на 100 штаммах V. cholerae, при этом авторам удалось выявить новый аллельный вариант tcpA гена у токсигенных холерных вибрионов не-01 не-0139 серогруппы.
Помимо основного холерного токсина, описан ряд других токсинов холерного вибриона, обладающих мембранотоксическими и питотоксическими свойствами, в частности, дополнительный Ace-токсин (от англ. accessory cholera enterotoxin) и Zot-токсин (токсин зонального поглощения, от англ. zonula occludens toxin), биосинтез которых определяется асе и zot генами, соответственно, локализованными в геноме профага СТХф (Trucksis et al., 1993). Таким образом, выявление в ПЦР данных генов наряду с ctxA геном имеет определенную ценность. Рядом авторов (Tamayo et al., 1997; Colombo et al., 1997; Aidara et al., 1998) были подобраны специфичные праймеры к последовательностям асе и zot генов, которые успешно использовались в ПЦР для генетической характеристики изучаемых штаммов V. cholerae.
Успехи, достигнутые при изучении особенностей генетической организации холерных вибрионов с разной вирулентностью и внутривидовой принадлежностью, определили одно из основных направлений развития генной диагностики холеры -проведение многофакторного анализа для выявления генетических маркеров, ассоциированных с токсигенностью, эпидемическим положением, персистенцией, таксономическим положением и др. Выполнение таких исследований возможно при использовании технологии мультилокусной ПЦР как с электрофоретическим учетом результатов, так и с гибридизапионно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Амплификационная тест-система для обнаружения и идентификации холерных вибрионов, основанная на одновременном выявлении ctxA, tcpA, toxR генов была предложена Парамоновым с соавторами (1999). Челдышева с соавторами (2000) показали перспективность применения мультилокусной ПЦР, основанной на амплификации ctxA, tcpA, toxR и hap генов, для идентификации штаммов V. cholerae 01 с различным эпидемическим потенциалом, выделенных от больных и из объектов окружающей среды.
Rivera с соавторами (2001) было исследовано 69 штаммов V. cholerae, а также пробы биологического материала и из объектов окружающей среды с помощью мультилокусной ПЦР, направленной на амплификацию фрагментов генов ctxA, ompU, МуА, zot, toxR, tcpA, и монолокусных ПЦР для выявления локусов tcpl и stn/sto. Авторы показали высокую чувствительность и специфичность анализа. Отмечено 100% совпадение результатов биологического, бактериологического и молекулярно-генетического исследования. Singh с соавторами (2002) разработали мультилокусную ПЦР для одновременного выявления ctxA, zot, асе, tcpA, ompU, toxR генов холерных вибрионов и апробировали её на 91 культуре возбудителя холеры и V. mimicus. Установлено, что вибрионы могут иметь различные комбинации обозначенных выше локусов. Все ДНК-мишени выявлены у 55 штаммов V. cholerae и V. mimicus, продуцирующих холерный токсин, только гены tcpA, ompU, toxR - у 2 штаммов данных видов, гены ompU и/или toxR - у всех оставшихся изолятов. Предлагаемый подход, по мнению авторов, представляется перспективным для проведения скрининга нативных проб биологического материала и из объектов окружающей среды на наличие токсигенных и нетоксигенных штаммов V. cholerae и V. mimicus.
Позднее Goel с соавторами (2007) применили для этих целей ПЦР с праймерами на основе локусов ompW, ctxB, zot, rfbOl, tcpB, a Mehrabadi с соавторами (2012) - ctxA, tcpA, ompW. При этом, если в первом случае чувствительность анализа не превышала 5x10 м.к./мл, то во втором составила 1x10 - 1x10 м.к./мл. Fykse с соавторами (2007) разработали способ выявления жизнеспособных клеток холерных вибрионов с помощью технологии NASBA с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, эффективность которого достигала 50 м.к./мл, а время проведения исследования - 3 ч. Авторы в качестве ДНК-мишеней выбрали гены ctxA, tcpA, toxR, groEL, ЫуА. В более поздних работах этот прием и ПЦР с обратной транскрипцией успешно нашли применение для определения холерных вибрионов в балластных водах (Fykse et al., 2012). В своей работе Kanoktippornchai с соавторами (2014) на основе выявления иРНК генов ctxA, tcpA, ompW методом обратной транскрипции и ПЦР смогли выявить в пробах воды открытых водоемов на территории Северного Таиланда 15 токсигенных и 20 нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, тогда как при бактериологическом анализе этих же образцов было обнаружено только 3 культуры V. cholerae (ctxA+ tcpA+).
Для идентификации культур холерных вибрионов Imani с соавторами (2013) создана мультилокусная ПЦР, основанная на амплификации сїхВ, їсрі, ЫуА генов. Авторы в своей работе выбрали ДНК-мишени, расположенные в СТХФ и VPI-I, но альтернативные часто используемым. Mousavi с соавторами (2008) дополнили ПЦР с праймерами на основе ctxB гена гибридизационно-ферментным способом учета результатов, тем самым увеличив чувствительность анализа до 5 м.к. Эффективность предложенного авторами подхода была подтверждена при исследовании проб из Южного Ирана.
Gubala, Proll (2006) предложили использовать в качестве ДНК-мишеней для выявления холерных вибрионов методом ПЦР гены rtxA, epsM, ompW, tcpA, и провести учет результатов в режиме реального времени с применением зондов типа Molecular Beacon. Чувствительность такой реакции при исследовании чистых культур холерных вибрионов составила 1x10 м.к./мл. При выявлении ДНК возбудителя холеры в пробах воды открытых водоемов значения этого показателя были на порядок выше (1x10 м.к./мл). Включение предварительного этапа очистки ДНК позволило повысить чувствительность анализа в 10 раз - до 1x10 м.к./мл. Применение для регистрации результатов амплификации зондов, меченных флуоресцентными метками, также способствовало повышению эффективности разработанной мультилокусной ПЦР, по сравнению с, предложенной в более ранней работе Gubala (2005), системой амплификации rtxA, epsM, mshA, tcpA генов в присутствии интеркалирующего красителя SYBRGreenl.
Выделение плазмидной ДНК рекомбинантного штамма Е. coli JM109
Для приготовления рабочих растворов использовали Taq-полимеразу, дезоксинуклеотидтрифософаты (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ), глицерин, трис-оксиметиламинометан, двухзамещенную соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), хлорид натрия, азид натрия, бромфеноловый синий натривая соль, натриевую соль бензилпенициллина, хлорид магния, сульфат магния, сульфат аммония, соляную кислоту, ледяную уксусную кислоту, гидроокись натрия, бромид этидия, тритон Х-100 твин-20, масло минеральное, этанол, гуанидинитиоцианат, агароза. Чистота реактивов «осч», «хч», «чда», «Molecular Biology Grade».
Для культивирования микроорганизмов использовали следующие питательные среды: бульон Хоттингера, рН 7,2 и 7,6 (МУК 4.1/4.2.588-96); 1% пептонная вода (из пептона основного (ФБУН «ГНЦ ПМБ», п. Обо лене к); агар Хоттингера, рН 7,2 и 7,6 (МУК 4.1/4.2.588-96); мясопептонный агар, рН 7,2, (лабораторного приготовления в отделе питательных сред ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»); эритрит-бульон, рН 7,2 (НИИ им. Мечникова, г. Москва); эритрит-агар, рН 7,2 (НИИ им. Мечникова, г. Москва); энтерококкагар (ГНЦ ПМБ, п. Оболенск).
Для исследования проб воды открытых водоемов применяли следующие питательные среды, наборы реагентов и другие препараты: пептон основной сухой, среда Клиглера, среда Хью-Лейфсона (ФБУН «ГНЦ ПМБ», п. Оболенск); питательная среда для выделения и культивирования холерного вибриона сухая (щелочной агар) (ФГУП «НПО «Микроген»); агар Хоттингера, рН 7,2 с добавлением 5% крови барана (лабораторного приготовления); тесты для определения цитохромоксидазной активности микроорганизмов OXItest (PLIVA-Lachema, Чехия); сыворотки диагностические холерные Огава и Инаба, 01, RO, не 01 группы 0139 (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»); бактериофаги диагностические холерные эльтор СТХ+ и СТХ-(ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»); бактериофаги диагностические холерные классический и эльтор (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»); иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные адсорбированные лошадиные (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»); наборы для ускоренной идентификации энтеробактерий и других неприхотливых грамотрицательных палочек API 20Е, карты для идентификации VITEK 2 GN в комплекте с соответствующим программным обеспечением и базами данных (BIOMERJEUX, Франция); диски для определения чувствительности к антимикробным препаратам (HiMedia, Индия).
Для культивирования микроорганизмов применяли общепринятые среды и методы (Дяченко, 1962; Лабинская, 1963). Работу с культурами возбудителей холеры, сибирской язвы, бруцеллеза проводили в соответствии с действующей нормативной документацией по организации и проведению лабораторной диагностики данных инфекций.
Ампулы с лиофилизированными культурами микроорганизмов стерильно вскрывали и вносили по 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия.
Полученную суспензию холерных вибрионов в объеме 0,1 мл засевали в 1 % пептонную воду и инкубировали в течение 3-6 ч при температуре 37±1С. Затем высевали с помощью бактериальной петли № 2 на агар Хоттингера, рН 7,6 и инкубировали при температуре 37±1С в течение 18-20 ч. Микробную взвесь Bacillus spp. в объеме 0,1 мл или культуры со среды хранения засевали в пробирки с 5 мл бульона Хоттингера, рН 7,2, инкубировали в течение 18-24 ч при температуре 37±1С. Затем проводили посев бактериальной петлей № 2 на чашки Петри с мясо-пептонным агаром, рН 7,2 и инкубировали при тех же условиях. Полученную суспензию клеток штаммов Brucella spp. в объеме 0,1 мл засевали в пробирки с 5 мл эритрит-бульона, инкубировали в течение 24 ч при температуре 37±1С. Затем высевали на чашки Петри с эритрит-агаром с помощью бактериальной петли № 2 и инкубировали 48-72 ч при температуре 37±1С. Суспензии клеток оставшихся гетерогенных культур в объеме 0,1 мл засевали в пробирки с 5 мл бульона Хоттингера, рН 7,2, инкубировали в течение 18-24 ч при температуре 37±1С, с последующим высевом на чашки Петри с энтерококкагаром для Enterococcus spp. и с агаром Хоттингера, рН 7,2 для Aeromonas spp., Alcaligenes faecalis, Commomonas spp., Escherichia coli, Plesiomonas spp., Proteus spp, Pseudomonas spp., Salmonella spp., Shigella spp. и инкубацией в течение 24 ч при температуре 37±1С.
Бактериальные взвеси клеток готовили до конечной концентрации 1,1 х Ю м.к./мл для V. cholerae, 1x10 м.к./мл для Bacillus spp., 1,65x10 м.к./мл для возбудителя бруцеллеза, 1x10 м.к./мл для гетер о логичных микроорганизмов. Подготовку суспензии осуществляли в 2 мл 0,9% раствора хлорида натрия по отраслевым стандартным образцам мутности 10 единиц и 5 единиц ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-59-85П и ОСО 42-28-59-86П, соответственно). Затем проводили 10-кратные разведения подготовленных суспензий до конечных концентраций 1x10, 1x10, 1x10, 1x10, 1x10 м.к./мл, а гетерологичных микроорганизмов - до 1x10 м.к./мл. Для разведения использовали 0,9%-ный раствор хлорида натрия. Для оценки эффективности подготовки бактериальных суспензий и их разведения проводили высев по 0,1 мл из микробной взвеси каждого штамма с концентрацией 1x10 м.к./мл на соответствующие плотные питательные среды. В работе использовали только те микробные взвеси у которых через 24-72 ч при температуре 37±1С на агаровых пластинках вырастало не менее 30 колоний.
Работа проводилась с цитратной кровью. В пробирки вносили по 4,5 мл крови, в одну из них добавляли 0,5 мл бактериальной суспензии В. anthracis рХ01+рХ02+ с концентрацией 1x10 спор/мл (получая конечную концентрацию 1x10 спор/мл), во вторую - В. anthracis рХ01+ рХ02+ с концентрацией 1хЮ4 спор/мл (конечная концентрация - 1x10 спор/мл), в третью и четвертую - по 0,5 мл бактериальных суспензии В. cereus и В. subtilis с концентрацией 1x10 спор/мл (конечная концентрация - 1хЮ7 спор/мл).
Разработка стандартного образца предприятия для оценки эффективности амплификации ctxA и tcpA генов
Проведение ПЦР с набором «Ген Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ» Если использовали все три ПЦР-смеси одновременно отбирали необходимое количество микропробирок с ПЦР-смесью «ctxcp», ПЦР-смесью «01-биовар» и ПЦР-смесью «0139», равное числу исследуемых проб каждой, еще по 2 микропробирки - для положительного и отрицательного контролей и дополнительно 1-е ПЦР-смесью «ctxcp» для ОКБ. В микропробирке объемом 0,6 мл или 1,5 мл готовили реакционную смесь из расчета: ПЦР-смесь-2 - 10 MKJIX(N+1), Taq-полимераза - 0,2 MKJIX(N+1), где N - суммарное количество микропробирок с ПЦР-смесями «ctxcp», «01-биовар», «0139». Полученную реакционную смесь тщательно перемешивали на микроцентрифуге-встряхивателе и переносили по 10 мкл в подготовленные микропробирки с ПЦР-смесью «ctxcp», ПЦР-смесью «01-биовар», ПЦР-смесью «0139», не повреждая слой парафина. В случае использования амплификатора без нагреваемой крышки сверху добавляли по капле минерального масла. В подготовленные пробирки под масло вносили по 10 мкл ДНК из исследуемых проб, не повреждая слой парафина. В пробирку с ПЦР-смесью «ctxcp», обозначенную как «ОКБ», вносили 10 мкл ОКБ.
В пробирку с ПЦР-смесью «ctxcp», обозначенную как отрицательный контроль амплификации (K-Ctx_tcp), вносили 10 мкл ТЕ-буфера, в пробирку, обозначенную как положительный контроль амплификации (K+Ctx_top) - 10 мкл препарата «ПКО ДНК V. cholerae eltor 01 (ctxA+tcpA+)». В пробирку с ПЦР-смесью «01-биовар», обозначенную как отрицательный контроль амплификации (K-0i биовар), вносили 10 мкл ТЕ-буфера, в пробирку, обозначенную как положительный контроль амплификации (К+о1 биовар) - 10 мкл препарата «ПКО ДНК V. cholerae eltor 01 (ctxA+tcpA+)». В пробирку с ПЦР-смесью «0139», обозначенную как отрицательный контроль амплификации (К-ош), вносили - 10 мкл ТЕ-буфера, в пробирку, обозначенную как положительный контроль амплификации (К+ош) Ю мкл препарата «ПКО ДНК V. cholerae 0139».
При использовании только одной из обозначенных ПЦР-смесей подготовку реакционных пробирок проводили аналогичным образом, только используя пробирки с соответствующей ПЦР-смесью и ПКО. Подготовленные пробирки помещали в амплификатор и проводили реакцию по следующей программе: предварительная денатурации при температуре 95С в течение 5 мин, 5 циклов, включающих 95С - 40 (10) с, 62С - 40 (10) с, 72С - 40 (10) с; 30 циклов, включающих 95С - 30 (7) с, 60С - 30 (7) с, 72С - 30 (7) с; заключительная достройка комплементарной цепи при температуре 72С в течение 5 мин (в скобках указана продолжительность поддержания температуры при использовании активного режима термопиклирования). Учет и интерпретация результатов
При использовании набора реагентов «АмплиСенс Vibrio cholerae-FL» учет результатов проводили отдельно по каждой ПЦР-смеси «Скрин» и «Тип» и каналу флуоресценции, используя следующие показатели: значения пороговой линии (Threshold) по каналам FAM и JOE - 0,05, по каналу ROX - 0,1; значение функции More Settings I Outlier Removal I Устранение выбросов - 5% для всех каналов, значение функции Slope Correct I Коррект. уклона - не используется для всех каналов.
Результаты учитывали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов).
Наличие флуоресценции по каналу FAM с ПЦР-смесью «Скрин» при величине Ct не выше 33 свидетельствует об амплификации фрагмента ctxA гена, по каналу JOE с тем же показателем Ct - ВКО, каналу ROX с тем же показателем Ct - фрагмента гена tcpA.
Наличие флуоресценции по каналу FAM с ПЦР-смесью «Тип» при величине Ct не выше 33 свидетельствует об амплификации фрагмента wbeT гена (01 антиген), по каналу JOE с тем же показателем Ct - ЫуА гена, каналу ROX тем же показателем Ct -фрагмента гена wbfR (0139 антиген).
При использовании набора реагентов «Ген Vibrio cholerae - идентификация -РЭФ» регистрацию результатов ПЦР осуществляли методом электрофореза в 1,7-2% агарозном геле. Работу проводили в соответствии с инструкцией к набору при градиенте напряжения 8,5 В/см в течение 30 мин. Результаты учитывали на основании наличия (или отсутствия) на электрофореграмме специфичных полос амплифицированной ДНК.
Интерпретацию результатов, полученных с помощью обоих препаратов, проводили в соответствии с таблицей 4.2 и рисунками 4.1, 4.2. Образование фрагмента размером 564 п.н. при использовании ПЦР-смеси «ctxcp» указывает на амплификацию сїхА гена, а 218 п.н. - tcpA гена. Формирование ампликонов размером 420 п.н. при проведении реакции с ПЦР-смесью «01-биовар» свидетельствует об амплификации фрагмента wbeN гена (01 антиген), а 264 п.н. -специфичного для холерных вибрионов биовара эльтор и не-01 серогрупп участка ЫуА гена. Выявление фрагмента размером 439 п.н. при использовании ПЦР-смеси «0139» показывает наличие у исследуемых штаммов участка wbfR гена (0139 антиген).
Оценка чувствительности и специфичности созданных тест-систем в рамках межлабораторных испытаний
Из компонентов буфера для проведения амплификации с добавлением фермента получены ПЦР-смесь-2-FL и без него ПЦР-смесь-2, которые обеспечивают осуществление реакции с гибридизационно-флуоресцентным и электрофоретическим учетом результатов. В ПЦР-смесь-2 также были введены реагенты из буфера для нанесения проб на агарозный гель: бромфеноловый синий, глицерин.
Для контроля эффективности экстракции ДНК в исследуемых пробах был разработан рекомбинантный неконкурентный внутренний контрольный образец (ВКО), представляющий собой бактериофаг лямбда GT67, содержащий клонированную генно-инженерную конструкцию искусственной нуклеотидной последовательности ДНК с последовательностью праймеров для сїхА. Для выявления ВКО сконструирован специфичный зонд с флуоресцентными метками R6G-BHQ1 и его амплификация предусмотрена вместе с праймерами и зондами на основе сїхА и tcpA генов в ПЦР-смеси «Скрин».
В ходе ряда экспериментов установлен оптимальный состав реакционных смесей и условия термоциклирования для проведения реакции с учетом результатов в режиме реального времени и с помощью электрофореза в агарозном геле, которые обеспечивают высокую чувствительность - 1x10 м.к./мл и специфичность - 100% анализа, как при исследовании культур хлерных вибрионов, так и проб биологического материала и объектов окружающей среды, искусственно контаминированных эпидемически значимыми штаммами вибрионов. Для снижения негативного воздействия компонентов нативного материала, которые могут остаться в препаратах ДНК, было предложено использовать прослойку парафина для разделения ПЦР-смесей «Скрин», «Тип», «ctxcp», «01-биовар», «0139» и ПЦР-смеси-2-FL или ПЦР-смеси-2 на этапе помещения пробирок в термоциклер и начала этапа предварительной денатурации. Применение такого подхода не повлияло на чувствительность разработанных мультилокусных ПЦР, но повысило их специфичность.
Полученные результаты послужили основанием для конструирования экспериментальных серий препаратов: «Набор реагентов для выявления ДНК Vibrio cholerae и идентификации патогенных штаммов Vibrio cholerae в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс Vibrio cholerae-FL» и «Набор реагентов для выявления и ускоренной идентификации Vibrio cholerae методом полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ)». Для обеспечения возможности решения различных задач в зависимости от эпидемиологической ситуации по холере: детекция эпидемически значимых шатммов возбудителя холеры в нативном материале или идентификация выделенных культур по эпидемической значимости и таксономическому положению, оптимизированы варианты использования ПЦР-смесей, входящих в состав предложенных наборов реагентов.
Для исключения необходимости использования вирулентных штаммов холерных вибрионов в технологической линии комплектации новых препаратов для генной диагностики холеры, при оценке эффективности амплификации ctxA и tcpA генов были сконструированы рекомбинанатные штаммы Е. coli JM109 pGEMctx564 и Е. coli JM109 pGEMtcp667, содержащие фрагменты этих локусов размером 564 и 667 п.н., соответственно. На основании полученных плазмид pGEMtep667 и pGEMctx564; предложен СОП, представляющий собой их разведения по отдельности и вместе в концентрации 1x10-1x10" ГЭ/мл каждой. Показано совпадение результатов определения чувствительности разработанной мультилокусной ПЦР при исследовании препаратов ДНК из бактериальных суспензий вирулентного штамма возбудителя холеры и созданного СОП.
При изучении чувствительности и специфичности разработанных тест-систем в ходе межлабораторных испытаний установлено, что специфическая флуоресценция по каналам FAM и ROX с ПЦР-смесью «Скрин» и образование ампликонов размером 218 п.н. и 564 п.н. с ПЦР-смесью «ctxcp» наблюдались только при исследовании эпидемически опасных штаммов возбудителя холеры, а флуоресценция по каналам FAM и JOE с ПЦР-смесью «Тип» и образование фрагмента размером 420 п.н. с ПЦР-смесью «01-биовар» - V. cholerae 01 серогруппы; ампликонов размером 420 п.н. и 264 п.н. -только V cholerae eltor. При исследовании культур возбудителя холеры 0139 серогруппы зарегистрирована флуоресценция по каналам JOE и ROX с ПЦР-смесью «Тип» и наличие фрагментов 264 п.н. с ПЦР-смесью «01-биовар» и 439 п.н. с ПЦР-смесью «0139». Специфичность экспериментальных серий препаратов была подтверждена и при исследовании ДНК гетерологичных микроорганизмов, п дуоденального содержимого, испражнений людей без энтеритов и с энтеритами различной бактериальной и вирусной этиологии, воды открытых водоемов, а так же при тестировании штаммов V. cholerae, относящихся к 61 различным серогруппам.
Определение диагностической эффективности набора реагентов для выявления и ускоренной идентификации V. cholerae методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов («Ген Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ») проводили в рамках медицинских испытаний, в ходе которых установлены высокие показатели чувствительности: 1x10 м.к./мл - в 100% случаях, 1x10 м.к./мл - в 87%, и специфичности (100%) реакции. Для исследования было выбрано 19 штаммов холерных вибрионов с различным набором маркеров эпидемической значимости, 6 штаммов гетерологичных микроорганизмов; пробы биологического материала (желчь, испражнения) и объектов окружающей среды (вода поверхностных водоемов, смывы с поверхностей), искусственно контаминированные эпидемически опасными и безопасными штаммами V. cholerae 01 и 0139 серогрупп. Полученные результаты послужили основанием для регистрации обеих тест-систем в Росздравнадзоре.
На следующем этапе нашей работы, при исследовании с помощью разработанных наборов реагентов «АмплиСенс Vibrio cholerae-FL» и «Ген Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ» 177 штаммов холерных вибрионов, выделенных из различных источников на территории Российской Федерации, 143 культуры идентифицировано как V cholerae 01 серогруппы биовара эльтор эпидемически безопасные (ctxAcpA-), 21 штамм - V cholerae 01 eltor (ctxAcpA+), 11 штаммов - V cholerae не-01 не-0139 серогруппы эпидемически безопасные (ctxAcpA-), 2 штамма -V cholerae 01 серогруппы биовара эльтор эпидемически опасные (ctxA+tcpA+). В то же время, при определении биовара данных изолятов с помощью холерных бактериофагов, зарегистрирован высокий процент штаммов, атипичных по фаговым тестам - до 63,3%. Вышесказанное указывает на перспективность использования разработанных амплификационных тест-систем для биотипирования выделенных культур холерных вибрионов.
