Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА1. Обзор литературы 20
1.1. Характеристика возбудителя туберкулеза. Эпидемиология туберкулеза. Современные методы микробиологической диагностики туберкулеза 20
1.2. Стратегии и Программы борьбы с туберкулезом. Организация процессов микробиологических исследований для выявления, диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза 27
1.3. Система обеспечения качества клинических лабораторных исследований 30
ГЛАВА2. Материалы и методы исследования 37
ГЛАВА 3. Сравнительная характеристика и стандартизация микробиологических методов диагностики туберкулеза. изучение биологических свойств лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя туберкулеза и мониторинг лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза 50
3.1. Сравнительная характеристика и стандартизация микробиологических методов диагностики туберкулеза 50
3.1.1. Сравнительный анализ и стандартизация различных методов микроскопического исследования 50
3.1.2. Сравнительная эффективность и стандартизация культуральных методов исследования 62
3.2. Изучение биологических свойств лабораторных штаммов микобактерий и клинических штаммов МБТ с множественной лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам 89
3.2.1. Исследование вирулентности лабораторных и клинических штаммов микобактерий
3.2.2. Оценка ростовых свойств лабораторных и клинических штаммов микобактерий
3.2.3. Изучение спектра и степени резистентности лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза ,
3.3. Мониторинг лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза
3.3.1. Диализ причин ошибочного определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза. Разработка мер по обеспечению качественной диагностики
лекарственной чувствительности и достоверности получаемых результатов
3.3.2. Мониторинг распространенности лекарственной устойчивости М. tuberculosis в отдельных регионах РФ
3.3.3. Исследование частоты и спектра лекарственной устойчивости М. tuberculosis в экспериментальных регионах РФ
ГЛАВА 4. Обобщение опыта и анализ результатов реализации лабораторного компонента программы по борьбе с туберкулезом в экспериментальных регионах рф. разработка требований, обеспечивающих качество выполнения микробиологических исследований для диагностики туберкулеза 128
4.1. Разработка модели рациональной организации микробиологических исследований, проводимых для диагностики туберкулеза 131
4.1.1. Анализ проблемы централизации микробиологических исследований, выполняемых для выявления, диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза и разработка подходов к ее решению 132
4.1.2. Разработка оптимальной структуры лабораторной сети и функций лабораторий, выполняющих микробиологические исследования для выявления, диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза 148
4.1.3. Анализ деятельности лабораторий и разработка рациональной схемы обследования пациентов с целью выявления, диагностики и последующего контроля химиотерапии туберкулеза 154
4.2. Совершенствование микробиологической диагностики туберкулеза в бактериологических лабораториях противотуберкулезной службы
экспериментальных регионов РФ 173
4.2.1. Разработка требований к материально-техническому обеспечению процессов микробиологических исследований, выполняемых в центральных региональных бактериологических лабораториях 173
4.2.2. Разработка рекомендаций по обучению персонала бактериологических лабораторий 185
4.2.3. Разработка рекомендаций по проведению кураторских визитов в бактериологические лаборатории различных уровней 187
4.2.4. Повышение эффективности и качества микробиологической диагностики туберкулеза в бактериологических лабораториях экспериментальных регионов 202
4.3. Совершенствование микроскопической диагностики туберкулеза в клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети экспериментальных регионов РФ 213
4.3.1. Разработка требований к материально-техническому обеспечению процесса микроскопического исследования в клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети 214
4.3.2. Разработка рекомендаций по обучению персонала клинико-диагностических лабораторий 217
4.3.3. Разработка рекомендаций по проведению контроля качества микроскопического выявления кислотоустойчивых микобактерий 228
4.3.4. Повышение эффективности и качества микроскопической диагностики туберкулеза в клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети экспериментальных регионов 239
ГЛАВА 5. Оценка эффективности и результатов внедрения системы обеспечения качества лабораторных исследований в экспериментальных регионах рф по сравнению с контрольными 269
5.1. Разработка критериев оценки качества и эффективности микробиологических исследований в учреждениях противотуберкулезной службы и
общей лечебной сети 269
5.2. Сравнительная оценка работы лабораторной службы по микробиологической диагностике туберкулеза в ряде экспериментальных регионов РФ по сравнению с контрольными 283
5.3. Анализ основных проблем лабораторной службы по диагностике туберкулеза и возможные пути их преодоления. Разработка рекомендаций по дальнейшему совершенствованию микробиологической диагностики туберкулеза в РФ 293
Заключение 311
Выводы 344
Практические рекомендации 348
Список литературы 351
- Характеристика возбудителя туберкулеза. Эпидемиология туберкулеза. Современные методы микробиологической диагностики туберкулеза
- Сравнительный анализ и стандартизация различных методов микроскопического исследования
- Анализ проблемы централизации микробиологических исследований, выполняемых для выявления, диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза и разработка подходов к ее решению
- Сравнительная оценка работы лабораторной службы по микробиологической диагностике туберкулеза в ряде экспериментальных регионов РФ по сравнению с контрольными
Введение к работе
Актуальность проблемы
Микробиологические исследования имеют чрезвычайно важное значение в системе выявления больных туберкулезом и являются одними из основных критериев верификации диагноза туберкулез (ТБ). Несмотря на это, в нашей стране организационные методы выявления туберкулеза прошлых лет были в основном направлены на использование рентгенологических исследований, в то время как микробиологическая диагностика ТБ играла второстепенную роль.
Ухудшение эпидемиологической ситуации по ТБ и изменение экономических условий в РФ способствовали повышению значимости выявления бациллярных больных туберкулезом традиционными микробиологическими методами [11, 17, 80, 91, 93], которым в настоящее время, в условиях эпидемии лекарственно-устойчивого ТБ, уделяется особое внимание при проведении как диагностических исследований, так и контроля химиотерапии.
В связи с этим, особенно актуальным становится вопрос совершенствования микробиологической диагностики ТБ, поскольку показатели эффективности и качества работы лабораторий России, выполняющих исследования с целью диагностики ТБ, заметно ниже, чем общепринятые мировые стандарты [39, 41, 81-82].
Совершенствование микробиологической диагностики ТБ невозможно без изучения биологических свойств возбудителя, стандартизации и унификации используемых рутинных методик, оптимальной организации микробиологических исследований и внедрения в лабораторную практику всех составляющих системы обеспечения качества [6-7, 12, 14-15, 35, 49, 107].
В условиях напряженной эпидемиологической ситуации по туберкулезу в РФ особенно остро стоит проблема лекарственно-устойчивого туберкулеза [51, 97-99, 103]. В связи с широким распространением в
9 последние годы штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), весьма актуальными задачами являются изучение биологических особенностей этих штаммов, оценка уровня их распространенности и разработка эффективных методов микробиологической диагностики туберкулеза с МЛУ.
Показатели лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза (ЛУ МБТ) на территории РФ неравномерны, и колеблются в достаточно широком диапазоне [8, 24, 77]. Значительные колебания в частоте ЛУ МБТ, в том числе - в частоте МЛУ МБТ, в различных регионах обусловлены разными причинами - в первую очередь не окончательно стандартизованными методами определения лекарственной резистентности. В связи с этим, разработка и внедрение в рутинную лабораторную практику стандартизованных унифицированных методик микробиологической диагностики ТБ и контроль качества их выполнения являются необходимыми условиями для получения достоверных статистических данных и проведения качественного мониторинга результатов микробиологических исследований, в том числе - мониторинга ЛУ МБТ, регулярное осуществление которого позволяет прогнозировать развитие эпидемиологической ситуации, наблюдать за тенденциями развития ЛУ МБТ и контролировать распространение ТБ с МЛУ.
Значительное повышение эффективности и качества исследований может быть осуществлено за счет разработки и внедрения в практику здравоохранения РФ современных требований к управлению лабораториями и основных принципов рациональной организации процессов микробиологических исследований, выполняемых для диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза [45, 117, 137, 145, 165, 178, 186, 208, 213, 216, 224, 229-230, 239, 257, 262]. Для нашей страны это новое направление исследований, которое недостаточно изучено, несмотря на то, что оно имеет большую практическую значимость и актуальность.
В РФ диагностика ТБ осуществляется как в клинико-диагностических
10 лабораториях общей лечебной сети (КДЛ ОЛС), где проводится первичное выявление бациллярных больных туберкулезом, так и в специализированных бактериологических лабораториях противотуберкулезной службы (БЛ ПТС), осуществляющих диагностические исследования и верификацию диагноза «туберкулез». В связи с этим, возникает необходимость изучить возможность создания в РФ единой лабораторной сети по диагностике ТБ, включающей в« себя лаборатории различной ведомственной подчиненности, и провести исследования по оптимизации её структуры.
Весьма актуальной задачей, решение которой позволит улучшить качество и повысить надежность микробиологической > диагностики ТБ в учреждениях ПТС и ОЛС является разработка и внедрение в полном-объеме в лабораторную практику РФ всех элементов системьг обеспечения качества исследований. Изучение факторов, способствующих повышению эффективности и достоверности! микробиологической' диагностики ТБ в лабораториях ПТС и ОЛС, в том числе — разработка требований к материально-техническому обеспечению процессов микробиологических исследований и к обучению лабораторного персонала, а также рекомендаций по проведению кураторских визитов, представляет большой практический интерес.
Важной частью исследований, направленных на улучшение качества работы лабораторий в учреждениях ПТС и ОЛС, является детальный анализ и тщательное изучение и обобщение опыта работы экспериментальных регионов РФ, которые являлись участниками пилотных проектов по борьбе с ТБ, основанных на рекомендациях ВОЗ [21, 75-76, 93]. Эти исследования необходимы для оценки эффективности реализации лабораторного компонента Программы ВОЗ по борьбе с ТБ в РФ и результатов внедрения в экспериментальных территориях РФ системы обеспечения качества лабораторных исследований, что позволит разработать конкретные рекомендации по дальнейшему совершенствованию' микробиологической диагностики туберкулеза в России.
Цель исследования
Разработка и внедрение научно обоснованного комплекса мероприятий, направленных на повышение эффективности и улучшение качества микробиологической диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза в учреждениях противотуберкулезной службы и общей лечебной сети РФ.
Задачи исследования
1. Провести сравнительный анализ используемых в лабораторной
практике РФ методов микробиологической диагностики ТБ. В дополнение к
Приказу МЗ РФ от 21.03.2003 г. № 109 «О совершенствовании
противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» разработать
стандартные унифицированные методы диагностики, проведя модификацию
существующих методик с учетом современных требований и
международных рекомендаций.
2. Изучить биологические свойства штаммов М. tuberculosis с
множественной лекарственной устойчивостью, выделенных от больных
туберкулезом. Для оценки эпидемиологической ситуации и реального уровня
распространенности лекарственно-устойчивых штаммов, в ряде регионов РФ,
имеющих высокое качество микробиологической диагностики туберкулеза,
провести мониторинг лекарственной устойчивости М. tuberculosis,
включающий статистический анализ частоты и спектра первичной и
приобретенной ЛУ МБТ.
3. Разработать требования к материально-техническому обеспечению
процессов микроскопических и культуральных исследований, выполняемых
с целью выявления, диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза.
4. Разработать современную концепцию обучения персонала
лабораторий, выполняющих микробиологическую диагностику туберкулеза,
в том числе - стандартные программы, учебные пособия и требования к
проведению курсов обучения.
5. Обобщить опыт реализации в пилотных проектах лабораторного
12 компонента Программы по борьбе с ТБ. Оценить эффективность и результаты внедрения в экспериментальных территориях РФ системы обеспечения качества микробиологических исследований, выполняемых с целью диагностики туберкулеза.
6. Определить оптимальные критерии оценки качества и
эффективности микробиологических исследований в учреждениях
противотуберкулезной службы и общей лечебной сети. Провести
сравнительный анализ работы лабораторий, выполняющих
микробиологическую диагностику туберкулеза, в ряде экспериментальных и
контрольных регионов РФ.
7. Провести анализ современного состояния лабораторной службы
РФ по диагностике туберкулеза, выявить основные имеющиеся проблемы и
наметить пути их преодоления. Выработать рекомендации по дальнейшему
совершенствованию микробиологической диагностики туберкулеза в РФ.
Научная новизна исследования
Проведены исследования по стандартизации и унификации традиционных методов микробиологической диагностики туберкулеза, усовершенствованы применяемые в РФ методики исследований. Показана эффективность использования новых ускоренных методов культуральной диагностики ТБ и тестирования ЛУ МБТ.
Изучены биологические свойства лекарственно-устойчивых, в том числе - с множественной лекарственной устойчивостью, штаммов М. tuberculosis. Выявлены основные причины неадекватного тестирования ЛУ МБТ и разработаны.меры по их устранению. В экспериментальных регионах РФ, после выполнения всех составляющих системы обеспечения качества исследований, проведен мониторинг ЛУ МБТ, впервые получены достоверные статистические данные и осуществлен детальный анализ распространенности и спектра ЛУ МБТ.
Впервые в отечественных исследованиях комплексно изучена проблема оптимальной организации процессов микроскопических и культуральных
13 исследований, выполняемых с целью выявления, диагностики и контроля химиотерапии ТБ. Разработаны новые организационно-методические подходы к совершенствованию микробиологической диагностики ТБ в России и изучена эффективность их использования. Определены основные принципы организации сети лабораторий, участвующих в микробиологической диагностике ТБ.
Впервые обобщен и систематизирован 10-летний опыт и подведены итоги реализации в РФ лабораторного компонента пилотных проектов по борьбе с ТБ. Впервые оценены эффективность и результаты внедрения в экспериментальных регионах РФ системы обеспечения качества микробиологических исследований, выполняемых с целью диагностики ТБ. Проведен анализ деятельности лабораторий и показателей работы лабораторной службы по микробиологической диагностике ТБ опытных регионов РФ по сравнению с контрольными. Исследована проблема низкой эффективности и качества микробиологической диагностики ТБ в учреждениях ПТС и ОЛС, обоснованы направления повышения эффективности работы лабораторий и установлены требования, выполнение которых является необходимым условием для проведения качественной диагностики ТБ микробиологическими методами.
Теоретическая значимость работы
Научно обоснована концепция обеспечения качества и повышения эффективности микробиологических исследований, выполняемых с целью диагностики возбудителя туберкулеза, определяющая новые подходы к совершенствованию микробиологической диагностики туберкулеза в РФ.
Получены новые данные о биологических свойствах и распространенности штаммов М. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, позволяющие теоретически обосновать стратегию и тактику борьбы с лекарственно-устойчивым туберкулезом, а также эффективные способы детекции штаммов МБТ с МЛУ.
14 Практическая значимость работы
Определена оптимальная структура лабораторной сети по диагностике ТБ, включая перечень выполняемых функций для лабораторий различных уровней; разработаны подходы к решению проблемы централизации исследований.
Предложена рациональная схема микробиологического обследования пациентов с целью диагностики ТБ и последующего контроля химиотерапии в процессе лечения, позволяющая исключить дублирование анализов в лабораториях различного уровня и выполнение нецелесообразных исследований, не дающих дополнительной информации в клиническую практику.
Разработаны рекомендации по материально-техническому
обеспечению процессов микроскопических и культуральных исследований, выполняемых для диагностики ТБ в лабораториях ПТС и ОЛС. Систематизированы требования к устройству и помещениям лабораторий ПТС и ОЛС, составлены стандартные списки современного оборудования и расходных материалов, необходимых для оснащения Б Л ПТС и КДЛ ОЛС.
Разработаны рекомендации по обучению лабораторных специалистов ПТС и ОЛС с учетом современных подходов к обучению. Составлены стандартные программы обучения персонала лабораторий унифицированным методам микробиологической диагностики ТБ, разработаны требования к проведению курсов обучения, подготовлены комплекты учебных пособий.
Разработана методическая база для осуществления надзора за лабораториями, включая образцы опросных листов для проверки работы лабораторий ОЛС и ПТС и рекомендации по проведению кураторских визитов. Предложены стандартные отчетные формы для оценки работы КДЛ ОЛС и учетно-отчетные формы для ведения документации в специализированных Б Л ПТС.
Определены оптимальные критерии оценки качества и эффективности работы КДЛ ОЛС и БЛ ПТС, выполняющих микробиологические
15 исследования для диагностики туберкулеза.
Внедрение в практику результатов исследования
Проведенные исследования позволили разработать комплекс мер, направленных на совершенствование микробиологической диагностики ТБ, среди которых наибольшее практическое значение имеют мероприятия по внедрению системы обеспечения качества исследований. Выполнение разработанных рекомендаций в ходе реализации в РФ пилотных проектов по борьбе с ТБ привело к повышению эффективности и улучшению качества микробиологической диагностики ТБ в экспериментальных регионах и как следствие - к возрастанию достоверности, точности и надежности получаемых лабораторных результатов.
На основании проведенных исследований:
Разработаны и переданы в МЗиСР РФ материалы для внесения изменений и дополнений в Приложения к Приказу МЗ РФ от 21.03.2003 г. № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в РФ» (акт № 89-634 от 5 мая 2009 г.).
Подготовлены методические рекомендации «Ускоренный метод определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза», которые утверждены Ученым советом ЦНИИТ РАМН (протокол № 14 от 05.12.2000 г.) и используются в практической работе отдела микробиологии ЦНИИТ РАМН.
Составлены методические рекомендации «Протоколы лечения больных туберкулезом с использованием стратегии Всемирной организации здравоохранения в Псковской области» (Псков, 2003), которые утверждены Санкт-Петербургским НИИ фтизиопульмонологии и Комитетом здравоохранения Псковской области и используются в указанном регионе в практической работе.
Разработано руководство «Унифицированный метод микроскопического выявления кислотоустойчивых микобактерий» (М., 2008), которое используется в повседневной работе клинико-
диагностических лабораторий* ОЛС и ПТС, а также ведомственных служб и других подразделений, участвующих в оказании противотуберкулезной (ПТ) помощи населению на территории РФ.
Материалы диссертационного исследования включены в разработанные для профессиональной переподготовки лабораторных специалистов учебные пособия: комплект «Выявление туберкулеза методом микроскопии» (М., 2008; УМО-107 от 08.02.07); «Культуральные методы диагностики туберкулеза» (М., 2008; УМО-685 от 24.10.07); «Люминесцентная микроскопия» (М., 2008; УМО-691 от 24.10.07).
В рамках реализации в РФ Проекта «Профилактика, диагностика, лечение туберкулеза и СПИДа», на Федеральном (2006-2007 гг.) и региональных (2008 г.) уровнях для лабораторных специалистов страны были проведены курсы обучения «Выявление туберкулеза методом микроскопии» и «Культуральные методы диагностики туберкулеза» с использованием разработанных учебных пособий (акты внедрения № 89 от 26.02.09 и № 06/13-165 от 09.04.09).
В 2007 г. по инициативе ВОЗ и при участии экспертов ВОЗ, с использованием разработанных учебных пособий был проведен семинар по подготовке преподавателей для курса обучения «Выявление туберкулеза методом микроскопии», в котором участвовали представители из различных регионов РФ, являющиеся преподавателями на региональном уровне.
Разработанные рекомендации по рациональной организации процессов микробиологической диагностики ТБ и обеспечению качества микробиологических исследований внедрены в практику работы учреждений ПТС и ОЛС таких экспериментальных территорий РФ, как Орловская, Псковская, Белгородская области, Республики Марий Эл, Хакасия, и в настоящее время постепенно внедряются в регионах, входящих в зону курации ЦНИИТ РАМН.
Разработанные рекомендации по устройству и материально-техническому обеспечению специализированных БЛ ПТС были
17 использованы в период с 2002 по 2006 гг. при создании и оснащении новых, а также при проведении реконструкции и ремонта с последующим дооснащением уже существующих лабораторий гражданского и пенитенциарного секторов РФ: центральная БЛ РПТД Республики Марий Эл (г. Йошкар-Ола); центральная БЛ ОПТД г. Пскова; БЛ межрайонного ПТД г. Великие Луки; БЛ ФСИН Псковской области; центральная БЛ ОПТД г. Белгорода; БЛ областной ПТ больницы г. Старый Оскол; БЛ ФСИН Белгородской области; центральная БЛ РПТД Республики Хакасия (г. Абакан); Б Л ФСИН Республики'Хакасия; центральная Б Л ОПТД г. Пензы (акты внедрения от 22 февраля 2008 г. и от 18 марта 2008 г.).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Использование в рутинной лабораторной практике предложенных
стандартных унифицированных методов исследования, разработанных в
соответствии с международными рекомендациями, обеспечивает получение
достоверных и воспроизводимых результатов микробиологической
диагностики туберкулеза.
2. Штаммы М. tuberculosis с множественной лекарственной
устойчивостью существенно различаются между собой по скорости роста и
степеням лекарственной резистентности и характеризуются наличием
большого диапазона вирулентности. Показатели удельного веса штаммов с
МЛУ, выделяемых от впервые выявленных больных туберкулезом, являются
высокими и имеют тенденцию к росту.
Улучшению качества микробиологической диагностики туберкулеза способствует реализация на уровне субъекта РФ комплекса разработанных организационных мероприятий, включающих в себя создание единой лабораторной сети по диагностике туберкулеза, возглавляемой региональной референс-лабораторией, централизацию исследований, а также использование рациональной схемы обследования.
Внедрение в лабораторную практику системы обеспечения качества исследований с использованием разработанных рекомендаций по
18 материально-техническому обеспечению процессов микробиологических исследований, обучению лабораторного персонала и проведению кураторских визитов, повышает показатели эффективности и качества работы лабораторий по диагностике туберкулеза.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась на расширенном
межотделенческом заседании ГУ ЦНИИТ РАМН (протокол № 1 от 24.08.2007).
Основные положения работы были представлены и обсуждены на заседаниях секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1999, 2001, 2005, 2006, 2008, 2009 гг.); на международном семинаре для врачей-бактериологов по современным проблемам бактериологической диагностики туберкулеза (Гомель, 2000); на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы пенитенциарной медицины» (Минск, 2001); на международном региональном семинаре ВОЗ повышенного уровня для руководителей национальных туберкулезных лабораторных служб (Рига, 2005); на 4 Конгрессе Европейского региона Международного союза по борьбе с туберкулезом и заболеваниями легких (МСБТБЗЛ) (Рига, 2007); на 38 и 39 всемирных конференциях МСБТБЗЛ (Кейптаун, 2007; Париж, 2008), на конференции сотрудников ЦНИИТ РАМН (Москва, 2009).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работ, в том числе: 15 статей (из них 11 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ); 1 методические рекомендации для врачей-фтизиатров; 1 руководство для клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений; 1 методическое руководство для преподавателей (с грифом УМО); 5 учебных пособий (с грифом УМО).
19 Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 368 страницах машинописного текста (без приложений) и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практріческих рекомендаций, списка литературы, содержащего 265 источников (в том числе - 108 отечественных и 157 иностранных), и приложений. Диссертация иллюстрирована 49 таблицами и 34 рисунками.
Исследования выполнены в ЦНИИТ РАМН в течение 1997-2007 гг. в рамках 4 плановых научных тем, в которых автор являлся ответственным исполнителем (номера государственной регистрации 01.200.200875; 01.200.201017; 01.200.600831; 01.200.800744). Исследования в субъектах РФ проводились в ходе реализации пилотных проектов по борьбе с ТБ, выполнявшихся при финансовой поддержке международных организаций, и Проекта «Профилактика, диагностика, лечение туберкулеза и СПИДа», финансировавшегося в рамках Соглашения о займе между Международным банком реконструкции и развития и Правительством РФ.
Характеристика возбудителя туберкулеза. Эпидемиология туберкулеза. Современные методы микробиологической диагностики туберкулеза
Одной из наиболее серьезных причин распространения ТБ в наши дни является возрастание доли случаев лекарственно-устойчивого ТБ, в т. ч. — с МЛУ. Последние данные отечественной и зарубежной научной литературы [9, 50-51, 59, 77, 94, 97-99, 103, 127, 138, 252, 265] отмечают тенденцию к возрастанию частоты выделения так называемых multi-drug resistant (MDR) штаммов МБТ (штаммов с множественной лекарственной устойчивостью).
В настоящее время MDR-туберкулез представляет собой серьезную проблему [134, 147]. Однако если возможность выживания MDR-штаммов будет подтверждена как низкая, то распространение MDR-туберкулеза в мире будет расти очень медленно. В литературе имеются сведения о том, что штаммы, обладающие, например, устойчивостью к изониазиду, имеют сниженную вирулентность. В частности, в 1950-60-х гг. было установлено, что штаммы М. tuberculosis, устойчивые к изониазиду и/или стрептомицину, плохо растут in vitro и обладают пониженной патогенностью в отношении морских свинок [193, 249]. Некоторые современные исследования на клеточном и молекулярном уровне подтверждают, что изониазидо-устойчивые штаммы менее вирулентны [127, 185, 210, 264].
Однако ряд исследователей высказывают мнения о большей контагиозное и вирулентности лекарственно-устойчивых МБТ по сравнению с чувствительными [7, 10, 15, 130, 173]. Подтверждением тому может служить тот факт, что в конце 80-х - начале 90-х годов в Западной Европе и Северной Америке прокатилась волна нозокомиальных заражений больных и персонала лечебных учреждений MDR-штаммами ТБ [129, 134, 138, 148, 214]. Эпидемиологические наблюдения, проведенные в Нью-Йорке, показали, что почти во всех случаях изоляты от больных были устойчивы к 4-м препаратам первого ряда (S, Н, R, Е) и канамицину. В 21 госпитале Нью 21 Йорка было выделено 112 культур одного и того же штамма и 8 его вариантов. Указывалось на высокую патогенность MDR-штаммов, однако конкретных данных по вирулентности нам найти не удалось. В связи с этим, вопрос о том, являются ли лекарственно-устойчивые штаммы М. tuberculosis (в том числе - штаммы с МЛУ) столь же вирулентными, как и чувствительные штаммы, требует дальнейшего изучения.
Развитие феномена ЛУ МБТ и распространение ее угрожающими темпами во многих странах мира, включая и Россию, является результатом сочетанного влияния биологических, медицинских, социальных и экономических факторов [77, 79-80, 83-84, 94-96, 129, 195]. Это позволяет многим авторитетным авторам [3, 6, 9-Ю, 20, 32, 59, 92, 101, 133,230,258,263] рассматривать проблему ЛУ МБТ, наряду с ВИЧ-инфекцией, как наиболее серьезное препятствие для эффективной противотуберкулезной работы.
За последние годы число больных, выделяющих МБТ, устойчивые к противотуберкулезным препаратам (ПТП), стало быстро распространяться [8-9, 18, 24, 50-51, 59, 77, 148, 231, 237, 252, 259]. В связи с этим Всемирной организацией здравоохранения и Международным союзом по борьбе с туберкулезом и заболеваниями легких проводятся глобальные проекты по надзору за уровнем и распространенностью ЛУ МБТ к ПТП, которые выполняются с целью оценить глобальные масштабы ЛУ МБТ и выяснить формирующиеся тенденции, определить достижения Программ борьбы с ТБ, укрепить лабораторную сеть, а также получить данные для принятия решения относительно политики борьбы с ТБ [251, 253, 256, 260].
В частности, результаты, получаемые в ходе реализации этих проектов, позволяют судить о необходимости расширения масштабов внедрения ПТ программ, оценивать схемы и результаты лечения, совершенствовать имеющиеся руководства по лечению, а, кроме того, - улучшать работу лабораторной службы, включая обеспечение качественной лабораторной диагностики МЛУ МБТ, совершенствование методов тестирования ЛУ МБТ к препаратам 2-го ряда и повышение надежности получаемых результатов, внедрение методов ускоренного, в том числе - генетического тестирования.
Основные принципы реализации проектов по надзору за ЛУ МБТ состоят в том, что выборка образцов для исследования точно представляет популяцию исследования, лабораторные результаты имеют гарантированное качество, проводится дифференциация между новыми и ранее лечеными случаями ТБ [219, 255]. Таким образом, грамотно проводимый мониторинг распространения ЛУ МБТ предполагает контролируемый сбор данных и внешнюю оценку качества микробиологических исследований в задействованных лабораториях. С целью обеспечения гарантированного качества лабораторных исследований, в работе по проведению мониторинга ЛУ МБТ принимают участие только те лаборатории, которые имеют необходимый уровень оснащения и обученные квалифицированные кадры.
Анализ литературных данных позволяет сделать вывод о том, что по сравнению с западноевропейскими странами в РФ» регистрируется высокий уровень ЛУ и МЛУ МБТ [8-9, 24, 51, 59, 77, 237]. В связи с этим, для оценки остроты проблемы лекарственно-устойчивого ТБ в РФ также необходимо на регулярной основе проводить качественный мониторинг ЛУ МБТ.
В современной напряженной эпидемиологической ситуации по ТБ микробиологические (м/б) исследования играют важнейшую роль в диагностике и дифференциальной диагностике заболевания, контроле бактериовыделения в процессе лечения, выборе рациональных схем и коррекции химиотерапии (х/т), оценке ее эффективности, в прогнозировании течения инфекционного процесса, а также в бактериологическом подтверждении излечения больного после окончания курса лечения [5,11, 16-17, 23, 26, 43-45, 91]. На сегодняшний день роль традиционных м/б методов, таких как бактериоскопия мазка и культуральные исследования (посев), значительно возросла, и они являются одними из основных в диагностике ТБ [37-38,78-80]. Обнаружение МБТ в диагностическом материале м/б методами позволяет подтвердить достоверность поставленного диагноза «туберкулез».
Изучение образцов мокроты с помощью бактериоскопического исследования — сравнительно быстрый, простой, недорогой и достаточно специфичный метод, который должен использоваться во всех случаях при подозрении на ТБ [2, 23, 25-26, 46,90,234,245,262]. На практике используются два метода микроскопического исследования диагностического материала с целью выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) [71-72, 223, 240]: - метод прямой микроскопии, когда мазок приготавливается непосредственно из необработанного (нативного) диагностического материала или его осадка (в случае жидкого материала); - метод микроскопии мазка из обработанного осадка материала, подготовленного для культурального исследования путем обработки материала разжижающими и деконтаминирующими средствами и последующего центрифугирования при 3000 g в безопасной центрифуге. Первый, наименее затратный метод широко применяется в тех лабораториях, в которых производятся только микроскопические исследования, с окраской мазков по методу Циля-Нильсена и исследованием их в обычном световом микроскопе проходящего света (в КДЛ ОЛС).
Сравнительный анализ и стандартизация различных методов микроскопического исследования
Метод микроскопического исследования мокроты является обязательным при выявлении больных туберкулезом легких (ТБЛ) и входит во все схемы обследования пациентов с целью выявления туберкулезной инфекции, а также используется для контроля динамики лечения и подтверждения излечения.
Наиболее употребляемым и распространенным методом для выявления КУМ является метод приготовления мазков непосредственно из диагностического материала с последующей окраской их по Цилю-Нильсену и микроскопическим исследованием приготовленных препаратов в световом микроскопе проходящего света. Этот метод широко используется в большинстве КДЛ ОЛС России для выявления КУМ при первичном обследовании на наличие туберкулезной инфекции и должен выполняться в соответствии с методикой, изложенной в Приказе МЗ РФ от 21.03.2003 № 109. К сожалению, в РФ было опубликовано несколько руководств, учебников, методических рекомендаций, а также рекомендаций фирм, предлагающих к продаже химические компоненты рабочих растворов для метода Циля-Нильсена, в которых этот метод описан не достаточно корректно. В частности, кураторские визиты, проведенные нами в различные регионы РФ, показали, что лабораторные специалисты на местах широко использовали в своей работе готовые наборы реактивов отечественного производства, предназначенные для окрашивания препаратов методом Циля-Нильсена. В инструкциях, прилагаемых к таким наборам, приводилось описание метода окраски мазков по Цилю-Нильсену, которое содержало грубые ошибки, существенно отличаясь от стандартной унифицированной методики, изложенной в Приказе № 109. Образцы вышеуказанных инструкций, прилагавшихся к использовавшимся в лабораториях многих регионов наборам реагентов для проведения окраски мазков методом Циля-Нильсена, представлены в Приложениях 1, 2. Концентрации красителей, входящих в состав набора, в этих инструкциях не указаны, а в качестве обесцвечивающего раствора предлагается использовать 5% раствор серной кислоты (вместо 25% раствора, регламентированного Приказом № 109). Описанные в инструкциях методики проведения окрашивания также не соответствуют методике, изложенной в Приказе № 109. В частности, указаны неверные временные интервалы окрашивания и неправильно описан способ проведения окрашивания, а также условия хранения реактивов. В итоге, использование в рутинной лабораторной практике не стандартизованных методик исследования, а также отсутствие эффективной системы внутри лабораторного и, особенно, внешнего контроля качества исследований приводило к низкой результативности бактериоскопической диагностики туберкулеза. Для того чтобы обеспечить проведение в КДЛ ОЛС качественной лабораторной диагностики туберкулеза, необходимо было разработать отдельный, четко сформулированный документ, акцентирующий особое внимание на методах бактериоскопического выявления КУМ в диагностическом материале, а также на проведении ВЛК и ВОК микроскопических исследований, выполняемых с целью выявления КУМ. Необходимость создания такого документа назрела также и в связи с тем, что некоторые положения методики микроскопического исследования, представленной в Приказе № 109, в настоящее время устарели и не соответствуют международным стандартам. Кроме того, в Приказе № 109 отсутствует либо недостаточно1 корректно изложена информация, касающаяся сбора мокроты, обеспечения биологической безопасности и. контроля качества микроскопических исследований. В связи с вышеизложенным, нами были подготовлены и направлены в МЗиСР РФ предложения по внесению изменений в действующий Приказ. Мы внесли изменения в описание процедуры приготовления препаратов, привели дополнительные рекомендации по обесцвечиванию мазков, изложили измененные правила сбора мокроты, перечень мероприятий по обеспечению биологической безопасности в лаборатории, а также представили описание методов ВЛК и ВОК микроскопических исследований. В частности, в отличие от методики, изложенной в действующем в настоящее время Приказе № 109, мы предлагаем при приготовлении нативных мазков исключить имеющуюся рекомендацию по переливанию мокроты в чашку Петри, так как при выполнении этой процедуры создается очень высокий риск образования инфицированного аэрозоля. В связи с этим, выбор гнойных комочков рекомендуется производить непосредственно из контейнера для сбора мокроты, который должен быть одноразовым, прозрачным и широкогорлым. Кроме того, мы рекомендуем, по-возможности, проводить обесцвечивание мазка 25% серной кислотой, с последующей обработкой его 96% этиловым спиртом в течение 5 минут для удаления с мазка кристаллов и- остатков краски, что1 позволяет избежать гипердиагностики КУМ. Рекомендуемая для использования в практической работе стандартная методика микроскопического исследования методом Циля-Нильсена, разработанная с учетом современных международных рекомендаций. [46, 145, 155, 165; 232-233, 257], изложена в подготовленном нами учебном пособии «Выявление туберкулеза методом микроскопии», утвержденном УМО РФ, а также в Руководстве для КДЛ ЛПУ «Унифицированный метод микроскопического выявления кислотоустойчивых микобактерий».
Помимо описания собственно методики исследования, в разработанном нами учебном пособии «Выявление туберкулеза методом микроскопии» также имеются составленные нами рекомендации относительно процедуры и правил сбора мокроты, предусматривающие использование кабин для сбора мокроты и одноразовых контейнеров, а, кроме того, изложены меры обеспечения биологической безопасности1 в лаборатории и описаны методы контроля качества микроскопических исследований.
Метод люминесцентной микроскопии имеет ряд преимуществ по сравнению с методом Циля-Нильсена и широко используется: в специализированных БЛ ПТС, выполняющих исследования мазков, приготовленных из осадка материала, обработанного для культурального исследования.
В соответствии с Приказом № 109, для количественной оценки результатов исследования мазков, окрашенных флуорохромами, количество КУМ, выявленных методом люминесцентной микроскопии, необходимо разделить на определенное число (так называемый «фактор увеличения»), значение которого зависит от величины использовавшегося увеличения люминесцентного микроскопа.
Анализ проблемы централизации микробиологических исследований, выполняемых для выявления, диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза и разработка подходов к ее решению
Для больных туберкулезом, выделяющих лекарственно-устойчивые штаммы М. tuberculosis, крайне важно провести коррекцию химиотерапии на возможно более раннем этапе лечения, что значительно повышает его эффективность. Особенно актуальна эта проблема для больных остропрогрессирующими формами ТБ легких, характеризующимися быстрым развитием туберкулезного процесса.
Мы провели анализ эффективности химиотерапии у 83 больных с лекарственно-резистентными остропрогрессирующими формами туберкулеза легких в зависимости от сроков ее коррекции по результатам тестирования ЛЧ МБТ различными ускоренными методами, такими как прямой метод с использованием системы ВАСТЕС-460, прямой метод с использованием плотной питательной среды Попеску и непрямой ускоренный нитратредуктазный метод с использованием реактива Грисса. Исследования проводились совместно с врачом-фтизиатром I терапевтического отделения ЦНИИТ РАМН Г.А. Ворониной.
Для 10 из 83 больных ОПТБЛ коррекцию химиотерапии проводили по результатам тестирования ЛЧ МБТ, полученным с помощью прямого метода определения ЛЧ МБТ в системе ВАСТЕС-460. Этот метод позволял получить данные ЛУ уже через 8-10 дней от момента посева диагностического материала и в эти же сроки скорректировать режим химиотерапии.
Для 11 из 83 больных ОПТБЛ коррекцию химиотерапии проводили с использованием результатов, тестирования ЛЧ МБТ прямым методом на плотной, питательной среде Попеску. Этот метод позволял получить данные ЛУ на 21 день от момента посева диагностического материала, взятого на анализ, и, как и в первом случае, оперативно провести коррекцию химиотерапии на достаточно ранних сроках лечения.
Для оставшихся 62 больных коррекцию химиотерапии проводили по результатам тестирования ЛЧ МБТ непрямым ускоренным: нитратредуктазным методом. Этот метод потребовал для определения ЛУ от 30 до 45 суток. В этом случае коррекция!химиотерапии носила отсроченный характер, как правило - на конечном этапе интенсивной фазы химиотерапии.
Эффективность лечения 83 больных с ЛУ, у которых коррекция режима химиотерапии проводилась в различные сроки (в. зависимости от использовавшегося метода тестирования- ЛЧ МБТ), сравнивали с эффективностью лечения 25 больных с лекарственно-чувствительными штаммами, не требующими изменения режима химиотерапии. При этом были получены следующие результаты.
Наиболее высокую частоту прекращения бактериовыделения наблюдали у больных, выделявших лекарственно-чувствительные штаммы МБТ. Через 4 месяца химиотерапии абациллирование отмечалось у 21 (84%) из 25 больных. При коррекции химиотерапии, проводимой по результатам тестирования ЛЧ МБТ с помощью BACTEG-460, то есть через 8-Ю дней от момента начала лечения, абациллирование к окончанию 4 месяца химиотерапии наступило у 8 из 10 (80%) пациентов.
Таким образом, эффективность, прекращения бактериовыделения у больных с лекарственно-резистентными штаммами при ранней коррекции х/т по данным ВАСТЕС-460 и у больных с лекарственно-чувствительными штаммами МБТ, была практически одинаковой - 80% и 84% соответственно (р 0,05). Отметим, что данные ЛУ МБТ, полученные при использовании прямого метода тестирования ЛЧ МБТ в системе BAGTEC-460, полностью совпадали с данными, полученными при использовании непрямого метода. Более низкие показатели прекращения бактериовыделения к концу 4 месяца лечения были отмечены при коррекции х/т с использованием непрямого ускоренного нитратредуктазного метода - прекращение бактериовыделения наблюдалось у 39 из 62 больных, что составило 62,9%. Это обстоятельство объясняется тем, что в этом случае коррекция х/т проводилась в более поздние сроки, через 1,5-2 месяца от начала лечения.
При коррекции х/т по результатам тестирования ЛЧ МБТ прямым методом на плотной питательной среде прекращение бактериовыделения за эти же сроки наблюдения было отмечено у 6 из 11 больных (54,5%). Низкие показатели абациллирования при коррекции х/т по результатам прямого метода были, вероятно, обусловлены менее достоверными результатами ЛУ МБТ, полученными при использовании данного метода тестирования. В1 6 случаях из 11 отмечалось частичное несовпадение результатов тестирования ЛЧ МБТ прямым методом с данными, полученными непрямым методом, что потребовало дополнительной повторной коррекции х/т и, следовательно, более длительных сроков для прекращения бактериовыделения.
Таким образом, проведенные исследования позволили сделать вывод о том, что чем раньше выполнена соответствующая коррекция химиотерапии у больных, выделяющих резистентные штаммы, тем быстрее происходит уничтожение микобактериальной популяции и выше эффективность лечения. Использование ВАСТЕС-460 для прямого ускоренного определения ЛУ МБТ позволяло быстро, за 8-Ю дней выявлять ЛУ у больных ОПТБЛ и своевременно скорректировать тактику химиотерапии на ранних этапах лечения, что дало возможность к окончанию интенсивной фазы лечения добиться высокого процента абациллирования (80% случаев), сравнимого с результатами абациллирования в контрольной группе больных с чувствительностью к ПТП.
Подводя итоги выполненных в данном разделе работы исследований отметим, что существующие традиционные бактериологические методы определения ЛЧ МБТ требуют значительных затрат времени, а методы с использованием автоматизированных систем, будучи чрезвычайно эффективными, тем не менее имеют ряд недостатков, а именно: являются очень дорогостоящими и требуют существенных трудозатрат персонала при выполнении процедур исследования. В связи с этим автоматизированными системами бульонного культивирования рекомендуется оснащать только крупные централизованные лаборатории, выполняющие большое количество исследований и имеющие достаточные материальные ресурсы.
Что касается ускоренного нитратредуктазного метода тестирования ЛЧ МБТ (метода Грисса), то он является быстрым, недорогим и легким в исполнении. Для него не требуется дополнительного оборудования, дорогих субстратов или реагентов. Он может быть легко внедрен в повседневную лабораторную практику противотуберкулезных учреждений в порядке альтернативы традиционным методикам, особенно при скудных ресурсах.
Сравнительная оценка работы лабораторной службы по микробиологической диагностике туберкулеза в ряде экспериментальных регионов РФ по сравнению с контрольными
Регулярные кураторские визиты в лаборатории пилотных регионов проводились с целью оценки соответствия деятельности лабораторий правилам проведения лабораторных работ, состояния оборудования и выполнения норм техники безопасности. Основное условие инспекторских проверок заключалось в контроле и стандартизации используемых лабораторных методов, в том числе - метода определения ЛЧ МБТ.
Проводившаяся нами в подведомственных регионах кураторская работа включала в себя как консультативную, так и практическую организационно-методическую помощь по внедрению и совершенствованию методов современной м/б диагностики ТБ, а также обучение персонала лабораторий на местах и повышение квалификации медицинских кадров. Особое внимание уделялось контролю качества определения ЛЧ МБТ, включающему в себя стандартизацию способа приготовления питательных сред и метода определения резистентности МБТ.
Проведение контроля качества определения ЛЧ МБТ являлось одним из основных направлений нашей кураторской деятельности в экспериментальных регионах РФ, осуществлявших работу по Программе. В процессе работы были выявлены, проанализированы и исправлены основные ошибки, встречавшиеся при постановке теста на ЛЧ МБТ. Ниже представлен подробный анализ наиболее типичных ошибок, связанных с нарушением стандартных правил приготовления питательных сред для определения ЛЧ МБТ и правил приготовления микобактериальных суспензий.
Одной из причин ошибочного определения ЛЧ в курируемых нами регионах было использование неадекватных питательных сред. В некоторых территориях для определения ЛЧ МБТ применяли лиофилизированную среду Л-Й, что не позволяло получить достоверные данные. Использование лиофилизированной среды, как это было показано нами в разделе 3.1.2 настоящего исследования (см. табл. 8), недопустимо, так как приводит к искажению результатов ЛЧ МБТ.
Кроме того, к ошибкам в определении ЛЧ МБТ приводило использование при приготовлении питательных сред яиц от кур, получавших питательные добавки, содержащие антибактериальные препараты (используемые на птицефабриках для профилактики инфекционных заболеваний птиц). Отметим, что яйца, используемые для приготовления питательных сред, должны быть только диетические. К сожалению, придерживаясь схемы закупки яиц в торговой сети, принципиально не представляется возможным отследить сроки их производства и экологическую чистоту. Приобретение диетических экологически чистых яиц возможно только частным образом за наличный расчет. Большинство лабораторий РФ не имеют таких возможностей, вследствие чего не могут гарантировать идеальное качество используемых для тестирования ЛЧ МБТ питательных сред.
Важнейшее значение при постановке тестов на ЛЧ МБТ имеют такие факторы, как верный подбор концентраций используемых ПТП и правильное приготовление рабочих разведений препаратов, а также использование чистых субстанций препаратов вместо таблетированных форм. Указанное положение может быть проиллюстрировано следующим примером.
В 1998 г. лаборатория ЦНИИТ РАМН получила 173 чувствительных и лекарственно-устойчивых штамма МБТ, выделенных от в/в больных ТБЛ в Ивановской области, для проведения их повторного тестирования на ЛЧ к ПТП. Результаты определения ЛЧ МБТ, полученные в БЛ Ивановского ОПТД и в лаборатории микробиологии ЦНИИТ РАМН, совпали: по стрептомицину - в 22,95% случаев, по изониазиду - в 17,21% случаев, по рифампицину и по этамбутолу - в 13,11% случаев. В целом результаты определения ЛЧ МБТ полностью совпали только для 71 из 173 повторно тестированных штаммов, что составило 58,2%.
Аналогичный контрольный анализ ЛЧ МБТ проводился также в 1999 г. для 104 штаммов МВТ, выделенных в Ивановской области от в/в. больных, получавших лечение в соответствии с Программой контролируемой химиотерапии. Все отобранные к испытанию штаммы были резистентны к тому или иному ПТТТ. Совпадение результатов определения ЛУ составило: по S - 60,29%, по Н - 42,65%, по R - 33,82% и по Е - 57,35%.
Таким образом, начиная с 1999 г., наметилась, тенденция к более высокому уровню сопоставимости результатов определения ЛЧ МБТ, полученных в БЛ.Ивановского ОПТД и лаборатории микробиологии ЦНИИТ РАМН. Значительно более высокая частота совпадений в 1999 году объяснялась тем, что с 1999 г. обе лаборатории начали использовать при постановке метода абсолютных концентраций исключительно чистые субстанции ПТП со стандартизованной активностью. Таблетированные лекарственные препараты, которые до- 1999 г. использовались в БЛ Ивановского ОПТД, как известно, содержали наполнители и связующие вещества, в. связи с чем, их дозирование во время приготовления питательных сред было относительно неточно. Кроме того, такие препараты, как стрептомицин и этамбутол, которые использовались для тестов на ЛЧ, в таблетированных формах имели другой состав. Эти условия делали проблематичным строгое дозирование лекарственных препаратов.
Ошибки при приготовлении питательных сред, выявленные нами в экспериментальных регионах, были связаны как с тем, что лабораторными специалистами не всегда учитывались сроки годности ПТП, их активность и чистота, так и с тем, что при взвешивании препаратов, как правило, использовались недостаточно точные весы, а при приготовлении рабочих разведений препаратов не использовались показанные растворители и градуированная посуда. Кроме того, зачастую применялся неправильный режим свертывания питательных сред.
Отметим, что по мере замены лиофилизированной питательной среды Л-И на нативную и коррекции концентраций ПТП в среде, в экспериментальных регионах отмечалось снижение количества ошибочных результатов определения ЛЧ МВТ.
Чрезвычайно важным компонентом определения ЛЧ МВТ является также приготовление микобактериальной суспензии. Правильность ее приготовления оказывает значительное влияние на достоверность получаемых результатов. Было установлено, что адекватность определения лекарственной резистентности клинических штаммов находилась в прямой зависимости от количества колоний, снятых с питательной среды для приготовления суспензии стандартной мутности, — чем; большее- их число было использовано для приготовления суспензии, тем наиболее сопоставимые данные были получены в итоге. Результаты повторного анализа культур показали, что если гомогенат был приготовлен из менее, чем 10 колоний, то в большинстве случаев результаты тестирования были не сопоставимы.
