Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 31
1.1. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации...31
1. 2. Современные методы диагностики туберкулеза 33
1.2.1. Современные методы иммунодиагностики туберкулеза 36
1. 2. 1. 1. Туберкулинодиагностика 36
1.2. 1.2. Методы детекции высвобождения гамма-интерферона 37
1. 2. 1. 3. Иммуносеродиагностика 39
1.3. Особенности гуморального иммунного ответа при туберкулезе 44
1. 4. Антигены Mycobacterium tuberculosis, имеющие потенциал для серодиагностики туберкулеза з
1.4.1. Критерии отбора антигенов М. tuberculosis для целей серодиагностики туберкулеза 57
1. 4. 2. Способы получения антигенных препаратов М. tuberculosis для целей серодиагностики туберкулеза 63
1. 4. 3. Белковые антигены М. tuberculosis, обладающие потенциалом для использования в серодиагностике туберкулеза 67
1. 4. 3. 1. «RD1 белки»М tuberculosis 67
1. 4. 3. 2. Другие потенциальные белковые антигены М. tuberculosis для целей серодиагностики туберкулеза 70
1. 4. 4. Липидные и углеводные антигены М. tuberculosis 81
1. 4. 4. 1. Липоарабиноманнан (ЛАМ) 83
1. 4. 5. Конъюгаты белков М. tuberculosis с углеводными фрагментами ЛАМ...85
1. 4. 6. Мультиантигенные композиции, используемые в серодиагностике туберкулеза 86
Глава 2. Собственные исследования 90
2. 1. Получение антигенов М. tuberculosis разными методами 90
2. 1. 1. Получение рекомбинантных белков М. tuberculosis в экспрессионной системе Е. coli 90
2. 1.2. Результаты химической конъюгации рекомбинантных белков с гексаарабинофуранозидом ЛАМ 92
2. 1.3. Получение рекомбинантных белков М. tuberculosis в экспрессионной системе P. pastoris 93
2. 2. Результаты иммуноферментного анализа (ИФА) 99
2. 2. 1. Результаты ИФА с белками М. tuberculosis, экспрессированными в системе Е. coli 106
2. 2. 2. Результаты ИФА с конъюгатами белков М. tuberculosis, полученных в системе Е. coli, с синтетическим гексаарабинофуранозидом ЛАМ ПО
2. 2. 3. Результаты ИФА с белками М. tuberculosis, экспрессированными в системе P. pastoris Ill
2. 3. Сравнение диагностического потенциала рекомбинантных и синтетических антигенов М. tuberculosis 112
2. 3. 1. Сравнение показателей эффективности применения в ИФА белков М. tuberculosis, полученных в Е. coli, и их конъюгатов с гексаарабинофуранозидом ЛАМ 115
2. 3. 2. Сравнение результатов применения в ИФА аналогичных рекомбинантных белков М. tuberculosis, полученных в разных экспрессионных системах 117
2. 3. 3. Сравнение результатов применения в ИФА трех вариантов одного белка М. tuberculosis, полученного разными методами 119
2. 4. Определение расчетных показателей эффективности мультиантигенных композиций, включающих антигены М. tuberculosis, использованные в работе 120
Заключение 125
Выводы 148
Практические рекомендации 150
Перспективные направления дальнейшей разработки темы 150
Приложения 152
Приложение 1. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в работе 152
Приложение 2. Основные характеристики белков М. tuberculosis, использованных в работе 153
Приложение 3. Гель - электрофореграмма образцов ДНК 154
Приложение 4. Гель - электрофореграммы белков М. tuberculosis,
использованных в работе 155 Приложение 5. Результаты иммуноблот анализа 159
Принятые обозначения и сокращения 160
Список литературы
- Иммуносеродиагностика
- Белковые антигены М. tuberculosis, обладающие потенциалом для использования в серодиагностике туберкулеза
- Результаты химической конъюгации рекомбинантных белков с гексаарабинофуранозидом ЛАМ
- Определение расчетных показателей эффективности мультиантигенных композиций, включающих антигены М. tuberculosis, использованные в работе
Иммуносеродиагностика
Первоначально синтезировали гексаарабинофуранозид в виде гликозида с агликоном-спейсером, необходимым для удаления углеводного лиганда от носителя и эффективного связывания гликоконъюгата со специфическими антителами. Затем проводили конъюгирование гексасахарида с рекомбинантными белками М. tuberculosis, используя в качестве линкера фрагмент квадратной кислоты. Появление в ультрафиолетовом (УФ) спектре белка дополнительной интенсивной полосы поглощения подтверждало успешное конъюгирование его с гексасахаридом. Размеры конъюгатов анализировали электрофорезом (приложение 4 рисунок Д).
Иммуноблот анализ. Белки, разделенные ДСН-электрофорезом в 10% ПААГ, переносили из геля на поливинилиденфторидную мембрану (Sigma-Aldridge, Германия) с помощью прибора для блота (Mini trans-blot electrophoretic transfer cell (Bio-Rad,CUIA)). Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком (Sigma-Aldridge, Германия) в 50 мМ фосфатном буфере при 4С в течение 16 часов. После трехкратного промывания отмывочным буфером (50 мМ фосфатный буфер (рН=7,4), 0,05% твин-20 (Sigma-Aldridge, Германия)) мембраны инкубировали с моноклональными антиполигистидиновыми мышиными антителами, меченными пероксидазой хрена (Monoclonal anti-polyhistidine peroxidase conjugate produced in mouse (Sigma-Aldridge, Германия)) в разведении 1:2000 в течение 2 часов при 37С в 50 мМ фосфатном буфере с 0,05% твин-20, затем, после отмывания мембран их проявляли 1 мМ динитрометилбензидин ацетат (Sigma-Aldridge, Германия) с 10 мкл 33% Н202 в 10 мл в 50 мМ фосфатного буфера (рН=7,4). Результаты представлены на рисунках А и Б приложения 5.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Детектирование специфических антител против антигенов М. tuberculosis в сыворотках доноров проводили с помощью метода твердофазного гетерогенного непрямого ИФА.
Оптимальные количества компонентов ИФА определяли титрованием по методу «шахматной доски» (checkerboard system) с разведением сывороток (больных или здоровых доноров) в одном направлении, а антигена или анти-IgG конъюгата в другом. Для анализа были выбраны наименьшие разведения сывороток (1:100), антигенов (0,1-1 мкг на лунку) и пероксидазного конъюгата антител против IgG человека (1:10000) при которых обнаруживаются различия между образцами двух групп сравнения. Большие концентрации конъюгата и сывороток могли стать причиной повышения оптической плотности образца в лунке за счет фона, обусловленного неспецифическим взаимодействием их с планшетом, а меньшие - не обеспечить связывания всех активных центров антигенов, и, следовательно, не выявлять всех молекул антител [301].
Кроме бланк-контроля (одной лунки с исследуемым антигеном, но без внесения антител сывороток доноров) в качестве контролей ИФА использовали 5 сывороток (2 сыворотки здоровых и 3 больных пациентов), которые наносили на каждый планшет с каждым исследуемым антигеном для последующего сравнивания результатов, полученных на разных планшетах с одним антигеном.
Белки иммобилизовали в 96-луночных планшетах средней сорбции (Medium binding F-bottom plate (Greiner bio-one, Германия [65])) в концентрации 0,1-1 мкг на лунку (таблица 1) в 50 мМ карбонатно-бикарбонатного буфера (35 мМ NaHC03j 15 MMNa2C03, рН=9,6) при 4С в течение 16 часов.
После однократного отмывания лунок отмывочным буфером (50 мМ фосфатным буфером с 0,025% твин-20) в них вносили по 200 мкл 5% обезжиренного молока (Sigma-Aldridge, Германия) и инкубировали в течение 1 часа при 37С, 250 об/мин.
Промывали лунки дважды отмывочным буфером, затем в них вносили образцы сывороток, разведенные 1:100 в 50 мМ фосфатном буфере (рН=7,4), и инкубировали в течение 1 часа при 37С, 250 об/мин. Отмывали планшеты четыре раза.
В каждую лунку вносили пероксидазный конъюгат антител против IgG человека (Sigma-Aldridge, Германия) в разведении 1:10000, инкубировали в течение 1 часа при 37С и 250 об/мин. Промывали планшеты отмывочным буфером 5 раз. Вносили субстрат, содержащий тетраметилбензидин (ФГУП ГНЦ «НИОПИК») и регистрировали оптическую плотность на приборе Model 680 (Bio-Rad, США) при 450 нм после остановки реакции 1М H2S04 [111, 301]. Таблица 1 - Концентрации антигенов, использованные при постановке ИФА
Статистический анализ данных. Для статистического анализа данных, полученных в ИФА, использовали общепринятые методы статистической обработки данных, описанные в книге С. Гланца «Медико-биологическая статистика» [7], а также программы MedCalc (MedCalc Software, Бельгия) и Microsoft Office Exel (Microsoft, США).
Тип распределения значений в выборках (группах здоровых и больных) определяли с помощью теста Д Агостино-Пирсона в программе MedCalc [77]. При распределении данных анализа с белками по нормальному закону в обеих выборках высчитывали параметрические критерии различий, в противном случае применяли непараметрический тест Манна-Уитни. Согласно центральной предельной теореме при большом размере выборки (п 100), распределение значений в группе признавали нормальным вне зависимости от результатов теста Д Агостино-Пирсона.
Критерий Стьюдента направлен на оценку различий средних величин Хз и Хб обеих выборок, которые распределены по нормальному закону. Если при данном числе степеней свободы и уровне значимости а расчетное t ta, то различия между группами признавались статистически значимыми. При 5% уровне значимости (р 0,05) отвергали нулевую гипотезу о том, что различие между генеральными совокупностями равно нулю (когда различие объясняется случайностью выборки), и принимали альтернативную гипотезу, признающую статистическую значимость различий между группами.
Доверительный интервал разности истинных средних определяли по формуле: Хб-Хз - ta Sx6-X3 Цб" з Хб-Х3 + ta Sx6-Xs- (7) Если при а=0,05 интервал разницы средних принимал положительные значения, следовательно, можно было заключить, что с вероятностью 95% истинное значение разницы средних лежало в диапазоне определяемых значений, то есть различия между группами были статистически значимы. Медиану (50-й перцентиль), значение признака, которое делит вариационный ряд выборки на две равные части, для каждой выборки определяли с помощью компьютерных программ.
Белковые антигены М. tuberculosis, обладающие потенциалом для использования в серодиагностике туберкулеза
Гены белков Rv3872 и Rv3873 относятся к мультигенному семейству РЕ/РРЕ. Оно насчитывает 176 ОРС белков, составляющих 10% протеома М. tuberculosis. Все белки этого семейства имеют высококонсервативные пролин-глутамат (РЕ) и пролин-пролин-глутамат (РРЕ) N-терминальные домены, содержащие ПО и 180 аминокислотных остатков, соответственно [37]. Наличие данных гомологичных участков в структуре указанных RD1 белков, может обусловить перекрестные реакции организма у здоровых БЦЖ-вакцинированных людей, а также пациентов, контактировавших с нетуберкулезными микобактериями, и, таким образом, снизить специфичность иммунологического анализа. Например, L. М. Okkels показано, что пептид Rv3873n8_i35 на 78-89% идентичен последовательностям 9 РРЕ белков М. tuberculosis и М. bovis, а также 2-7 белков М. leprae, М. marinum, М. smegmatis [221]. Действительно, в работе А.В. Жердева и соавторов специфичность ИФА с Rv3873 оказалась невысока -при определении антител класса М - 63,5% (чувствительность - 62,5%), класса G -20,8% (чувствительность - 65,4%) [10].
Использование в ИФА только специфичных пептидов Rv3873, например, как в работе Jia-Nan Xu, может привести к повышению специфичности анализа, по сравнению с целым антигеном [340]. При оценке иммуногенности отдельных перекрывающихся пептидов Rv3872 в работе P. Mukherjee два из них, Р8 и Р9, оказались наиболее серореактивными и показали результаты в ИФА схожие с данными, полученными при оценке целого белка. Вместе Р8 и Р9 позволили выявить 94% (против 92% для Rv3872) случаев легочного и 90% (против 89%) -внелегочного туберкулеза. Специфичность ИФА с Р8 и Р9 составила 100%, что оказалось на 5% выше результатов с целым белком [83, 210, 212].
Rv3874 (CFP-10) и Rv3875 (ESAT-6) - низкомолекулярные белки фильтрата культуры М. tuberculosis, кодируемые генами, относящимися к семейству esat6. Белки, принадлежащие к указанному семейству, имеют гомологию с ESAT-6 в аминокислотной последовательности от 10 до 35%,а их ортологи встречаются у М. leprae, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и другие [ПО, 189, 323]. CFP-10 и ESAT-6 экспрессируются на ранних стадиях развития инфекции, формируют плотный 1:1 гетеродимерный комплекс ESAT-6/CFP-10, который секретируется во внеклеточное пространство благодаря системе ESX-1, при этом сам процесс секреции ассоциирован с патогенезом туберкулеза. ESAT-6 ингибирует антиген-презентирующую функцию макрофагов за счет уменьшения продукции ИЛ-12 посредством нарушения Toll-like рецептор 2 сигнального пути, угнетает Т-клеточный ответ, оказывает влияние на сигнальный путь Т-клеточного рецептора после ZAP70, снижает выработку у-ИНФ, ИЛ-17, фактор некроза опухоли (ФИО), но не ИЛ-2. Действуя как цитолитический токсин, формирующий поры в мембранах клетки, он вызывает лизис эритроцитов, способствует проникновению М. tuberculosis в клетку, избегая фаголизосомы, и, таким образом, диссеминации патогена в организме [99, 122, 160, 260].
В исследованиях, направленных на измерение уровня IgG против перекрывающихся синтетических пептидов ESAT-6, наиболее выраженный антительный ответ был получен против С-концевого участка белка, как у экспериментальных, так и у естественно инфицированных животных. Более того, эти антитела детектировались уже на ранних этапах экспериментальной инфекции, что объяснялось быстрым увеличением числа ESAT-6-специфичных В-клеточных клонов в ходе течения заболевания. В недавних исследованиях в Канаде при сравнении антительного ответа на ESAT-6, 38кДа и 14 кДа (Rv0455c) белки М. tuberculosis у больных и здоровых пациентов, было обнаружено, что ESAT-6 не ассоциирован с активным туберкулезом, а только с факторами риска развития активного заболевания, либо с латентным туберкулезом [119]. В исследованиях, проведенных в Эфиопии, напротив, было показано, что повышенный титр анти-ЕБАТ-б антител характерен для активного прогрессирующего туберкулеза [84]. При изучении антительного ответа на белки ESAT-6 и CFP-10 у больных и здоровых жителей высокоэндемичного региона, Гамбии, чувствительность теста с ESAT-6 составила 67%, а с CFP-10 - 63%, специфичности - 51% и 55%, соответственно. Почти у половины доноров контрольной группы, проживающих в Гамбии, обнаруживались антитела к данным белкам, в то время как в неэндемичных странах с ними реагировали менее 6% сывороток здоровых БЦЖ-вакцинированных доноров. Низкая специфичность тестов, по мнению авторов, объяснялась широкой распространенностью латентного туберкулеза в Гамбии [119].
CFP-10 - один из многообещающих антигенов М. tuberculosis для целей серодиагностики туберкулеза. В работе Н. Zhang и соавторов серологический тест, основанный на CFP-10, выявил 78% случаев легочного, 65,6%-внелегочного туберкулеза, а специфичность теста составила 96,4% [349].
Среди белков М. tuberculosis, гомологичных белкам М. bovis BCG, также есть антигены с высоким потенциалом для применения в серодиагностике туберкулеза. Важной характеристикой таких белков является наличие в их структуре иммунодоминантных эпитопов, специфичных для микобактерий туберкулезного комплекса. Антитела против данных антигенов появляются, либо значительно нарастает их титр (по сравнению с уровнем противотуберкулезных антител у здоровых БЦЖ-вакцинированных или инфицированных туберкулезом людей), только при активации заболевания. Потенциальные белковые серодиагностические маркеры туберкулеза относятся в основном к группам секретируемых белков М. tuberculosis, наиболее доступных для иммунной системы [196, 245].
Результаты химической конъюгации рекомбинантных белков с гексаарабинофуранозидом ЛАМ
В нашей работе мы использовали 12 рекомбинантных белков М. tuberculosis (eRv0040c, eRv0222, eRvl837c, eRvl860, eRv2376c, eRv2875, eRv3425, eRv3872, eRv3874, eRv3875, eRv3881c, eRvl886c-Rv3875), полученных в системе E.coli, в ИФА с сыворотками больных туберкулезом легких и здоровых жителей Саратовской области.
Данные, полученные в ИФА, представлены в виде точечной диаграммы на рисунке 7 (А, Б).
Показатели чувствительности для анализов с белками, экспрессированными в E.coli, варьировали от 27% до 53% при расчете по cutoffi и от 16% до 41% -cutoff . В обоих случаях наибольшие показатели чувствительности были получены для белка eRv3874. Также высокие значения чувствительности для cutoffi были получены для белков eRvl860 (47%), eRv0222 (47%) и слитого белка eRvl886c-Rv3875 (48%).
Специфичность анализов с данными белками составила 90-93,3%. Однако при расчете статистических показателей по cutoff значения чувствительности для анализов с последними двумя белками (28% и 26%, соответственно) оказались существенно ниже значений для анализов с eRvl860 (38%) и eRv3874 (41%).
Точечная диаграмма результатов ИФА с антигенами М. tuberculosis, полученными в экспрессионной системе E.coli, и их конъюгатами с гексаарабинофуранозидом ЛАМ. Примечания: красной чертой обозначены значения cutoffi, синей - выборочные средние для групп. Наиболее низкие значения чувствительности анализов были получены с белками eRv0040c и eRv2376c (27% и 31% - cutoffi, 19% и 16% - cutoff2, соответственно). При расчете специфичностей анализов на основании cutoff2 значение показателя 100% было получено во всех случаях, а на основании cutoffi - только для eRv2875.
Диагностическая достоверность была минимальна для анализов с белками eRv0040c (40,7%) при расчете по cutoffi и с eRv2376c (35,4%) - cutoff2, а максимальна - для eRv3874 при обоих вариантах расчета (62,3% и 54,6%, соответственно).
Чувствительность анализа с eRvl886c-Rv3875 оказалась на 13% выше (cutoffi), чем для eRv3875, однако, снижение специфичности (на 6,7%) для анализа со слитым белком обусловило незначительный прирост в его диагностической достоверности, по сравнению с eRv3875 (на 7,7%). Кривые ROC представлены на рисунке 8 (А, Б, В). В ROC анализе чувствительность ИФА с белками, экспрессированными в E.coli, была от 39% (eRv2376c, eRv3881c) до 68% (eRv3874), специфичность от 70% (eRv0040c) до 100% (eRv2875). Диагностическая достоверность анализов, определенная по данным, соответствующим выбранному критерию, была от 50,3% (для eRv2376c) до 72,3% (для eRv3874).
В ROC анализе значение ОГҐ для ИФА с eRv0040c составило 1,93, что говорит о том, что вероятность истинно положительного результата выше вероятности ложноположительного результата менее чем в два раза, то есть эффективность теста с данным белком мала.
Наибольшее значение ППК среди рекомбинантных неконъюгированных белков было получено для eRv3874 (0,807), наименьшее - для eRv0040c (0,657). Значение ППК для анализа eRvl886c-Rv3875 оказалось ниже, чем для eRv3875, что говорит о меньшей диагностической точности анализа со химерным белком, по сравнению с eRv3875.
Результаты ИФА с конъюгатами белков М. tuberculosis, полученных в системе Е. coli, с синтетическим гексаарабинофуранозидом ЛАМ В данной работе в ИФА было использовано 6 химических конъюгатов рекомбинантных белков М. tuberculosis с синтетическим гексаарабинофуранозидом ЛАМ (eRv0222Ar, eRv2376cAr, eRv2875Ar, eRv3875Ar, eRv3881cAr, eRvl886c-Rv3875Ar). Результаты ИФА представлены на рисунке 7 (А, Б). Наименьшие показатели чувствительности для анализов с конъюгированными белками были получены согласно расчетам по cutoffi и cutoff2 для белка eRv2376cAr (41% и 21%, соответственно), а наибольшие - для eRvl886c-Rv3875Ar (59%) и eRv2875Ar (43%), соответственно. Специфичность анализов составляла от 90% (eRvl886c-Rv3875Ar) до 100% (eRv2875Ar) (cutoffi) и 100% (cutoffi) во всех случаях. Диагностическая достоверность была максимальна для анализов с белком eRvl886c-Rv3875Ar (66,1%) при расчете по cutoffi и с eRv2875Ar (56,1%) - cutoff2, а минимальна для eRv2376cAr при обоих вариантах расчета (53% и 39,2%, соответственно).
Результаты ROC анализа представлены на рисунке 8 (А, Б, В). По результатам ROC анализа значения показателей чувствительности для тестов с конъюгатами варьировали от 49% (eRv2376cAr) до 69% (eRvl886c-Rv3875Ar), специфичности от 80% (eRvl886c-Rv3875Ar) до 100% (eRv2875Ar) и диагностической достоверности от 59,2% (eRv2376cAr) до 71,5% eRvl886c-Rv3875Ar.
Наибольшее значение ППК среди анализов с конъюгированными белками было получено для теста с eRv3881cAr (0,84), наименьшее - с eRv2875Ar (0,745). Значение ППК для eRvl886c-Rv3875Ar (0,836) было выше, чем для eRv3875Ar (0,817). Прирост диагностической достоверности для eRvl886c-Rv3875Ar, по сравнению с eRv3875Ar, в связи со снижением специфичности для слитого белка, был незначительный (на 2,4-6,1% по всем вариантам расчета).
Определение расчетных показателей эффективности мультиантигенных композиций, включающих антигены М. tuberculosis, использованные в работе
Около одной трети населения планеты инфицировано М. tuberculosis. Риск активации туберкулеза у данных лиц в течение первых 5 лет после заражения составляет 5%. Кроме того, этот показатель существенно возрастает при наличии у таких людей сопутствующей патологии, прежде всего иммунодефицитов. Высокие темпы распространения ВИЧ-инфекции и штаммов М. tuberculosis с МЛУ создают в России предпосылки для ухудшения эпидемиологической ситуации по туберкулезу. Решающее значение в борьбе с туберкулезом имеет ранняя достоверная диагностика заболевания, способствующая снижению риска передачи инфекции восприимчивым лицам [23, 25, 51, 217, 302, 335].
Стандартные методы диагностики туберкулеза имеют ряд недостатков, например, таких, как низкая чувствительность микроскопии мазка мокроты у олигобациллярных больных, длительный период роста культуры М. tuberculosis при посеве на твердые питательные среды, неспецифичность рентгенографии, высокая стоимость молекулярных методов детекции микобактерий и ложноположительные реакции при туберкулинодиагностике [51].
К преимуществам серодиагностических тест-систем, детектирующих специфические антитела против антигенов М. tuberculosis, можно отнести их простоту, воспроизводимость, малую инвазивность, возможность выявления заболевания вне зависимости от локализации очага и распространенности инфекции, а также доступность для стран с низким уровнем жизни населения. Однако для утверждения серодиагностики в качестве стандарта необходимо значительное повышение чувствительности и специфичности существующих серодиагностических тестов [15, 108, 334].
Учитывая актуальность проблемы туберкулеза в нашей стране и необходимость повышения выявляемое заболевания на ранних этапах диагностического поиска, нами была поставлена задача - оценить возможности применения серодиагностики для скрининга туберкулеза в одном из регионов РФ. С целью реализации поставленной задачи мы применили метод ИФА для определения уровней антительного ответа против 24 рекомбинантных и синтетических антигенов М. tuberculosis у больных туберкулезом и здоровых жителей Саратовской области. Статистическая обработка данных ИФА позволила сравнить показатели эффективности анализов с различными антигенами М. tuberculosis, в том числе с аналогичными антигенами, полученными разными методами, и выявить потенциальные серомаркеры активного туберкулеза.
На первом этапе выполнения работы, на основании данных, полученных из научной литературы, нами был очерчен круг антигенов, имеющих перспективы для применения в серодиагностике туберкулеза. Обоснованием выбора антигенов служило соответствие их характеристик заявленным критериям, таким как: специфичность антигена для возбудителя туберкулеза, достоверно более высокая реактивность сывороток больных туберкулезом с выбранными антигенами при активном, чем при латентном туберкулезном процессе, отсутствие ложноположительных реакций на исследуемые антигены у здоровых БЦЖ-вакцинированных людей, доказанная эффективность применения данных антигенов для серодиагностики туберкулеза в регионах с высокой инфицированностью населения М. tuberculosis, а также у различных категорий больных, в том числе при сочетании туберкулеза с ВИЧ-инфекцией.
В список антигенов М. tuberculosis, выбранных нами для получения и дальнейшего использования в ИФА, входили как белки, так и гликолипид ЛАМ (а именно его гексаарабинофуранозидный фрагмент).
Среди отобранных нами белков были антигены (Rv3872, Rv3874, Rv3875), кодируемые генами «RD1 региона», отсутствующего в геномах М. bovis BCG и многих нетуберкулезных микобактерий. Серодиагностика туберкулеза, основанная на определении антител против «RD1 белков», может обладать высокой специфичностью в связи с отсутствием у здоровых БЦЖ-вакцинированных людей перекрестной реакции на указанные антигены [63].
Выбранные для исследования антигены относились, главным образом, к группе секретируемых белков М. tuberculosis (Rv0040c, Rv0129c, Rvl837c Rvl860, Rvl886c, Rv2376c, Rv2875, Rv3803c, Rv3872, Rv3874, Rv3875, Rv3881c), которые наиболее доступны для клеток иммунной системы и, вероятно, раньше других вызывают антительный ответ в организме больного активным туберкулезом [99, 150, 176, 198].
Меньшее количество антигенов принадлежало к группам мембранных (Rv0934, Rv2873) и внутриклеточных белков М. tuberculosis (Rv0222, Rvl636, Rv2185c, Rv2031c, Rv3425).
В научной литературе для всех указанных выше антигенов М. tuberculosis были представлены доказательства их иммунодоминантности в гуморальном иммунитете при активном туберкулезе [67, 133, 138, 191, 250, 325, 344, 345].
Разными авторами было показано, что серодиагностика туберкулеза, основанная на выявлении антител против некоторых из выбранных нами антигенов М. tuberculosis (например, Rv0934, Rvl636, Rvl837c, Rv2185c) эффективна в случаях (таких как олигобациллярный легочный, внелегочный и сочетанный с ВИЧ-инфекцией туберкулез), когда традиционная диагностика туберкулеза малоинформативна [67, 133, 191, 258, 309, 325]. Использование указанных белков может определять преимущества серодиагностики перед другими методами диагностики.
Важным этапом выполнения работы являлся выбор способа получения антигенов М. tuberculosis для дальнейшего использования в ИФА. Несмотря на высокую чувствительность серотестов, основанных на нативных антигенах, выделенных из культуры микобактерий, получение данных препаратов для целей серодиагностики не представляется целесообразным в связи с длительностью и сложностью культивирования М. tuberculosis [241, 257, 259]. В связи с этим для получения антигенов М. tuberculosis было решено использовать рекомбинантные экспрессионные системы или химический синтез.
