Введение к работе
Актуальность проблемы. На современном этапе холера продолжает оставаться одной из актуальных, социально-значимых и имеющих международное значение особо опасных инфекционных болезней, единичные случаи и вспышки которой рассматриваются как чрезвычайная ситуация [Онищенко Г.Г. и др., 2011]. Заслуживает внимания, что возбудитель холеры отнесен к категории В – высокоприоритетных патогенов, которые могут быть использованы в качестве биологического оружия [Ломов Ю.М. и др., 2007; Онищенко Г.Г. и др., 2000].
О-антиген холерного вибриона является одним из основных протективных антигенов, отвечающих за формирование антибактериального иммунитета [Freter R., 1976; Johnson G. et al., 1996; Meeks M.D. et al., 2004] и входит в состав практически всех вакцин, предназначенных для специфической профилактики холеры [Онищенко Г.Г. и др., 2011]. Медицинские иммунобиологические препараты являются наиболее эффективными средствами профилактики холеры [Кутырев В.В. и др., 2006]. В Российской Федерации вакцинация против холеры входит в календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям.
Российская холерная химическая вакцина, сконструированная и производимая в институте «Микроб» [Анисимов П.И. и др., 1997; , Джапаридзе М.Н. и др., 1991], основными компонентами которой являются холероген-анатоксин и О-антигены, продуциремые токсигенными клетками холерного вибриона сероваров Инаба и Огава, не уступает по эффективности оральной холерной вакцине WC-rBS [Онищенко Г.Г. и др., 2011; Щуковская Т.Н. и др., 2009]. В технологии производства холерной химической таблетированной вакцины института «Микроб» используютcя токсигенные штаммы Vibrio cholerae. Работа с вирулентными штаммами в условиях производства повышает риск заражения персонала при возникновении аварийных ситуаций.
В РосНИПЧИ «Микроб» сконструированы авирулентные атоксигенные штаммы холерного вибриона V. cholerae eltor КМ 263 Инаба [Ливанова Л.Ф. и др., 2011], V. cholerae eltor КМ 262 Огава [Стрельникова-Ааб Е.Н. и др., 2011], являющиеся продуцентами О1 антигенов. Для продукции О139 антигена возможно использование авирулентного атоксигенного штамма V. cholerae M 377 О139. Эти штаммы холерного вибриона перспективны для создания отечественной современной химической вакцины против холеры. Однако на данный момент отсутствует масштабируемая технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов V. cholerae – продуцентов О-антигенов.
В 90-ых годах прошлого столетия были проведены исследования по концентрированию и очистки О-антигена с использованием ультрафильтрации на полых волокнах [Громова О.В. и др., 1999], что позволило создать промышленную технологию концентрирования О-антигена, продуцируемого клетками холерного вибриона штамма М41 серовара Огава [Дятлов И.А. и др., 2011; Нижегородцев С.А., 2003]. Однако используемый метод имеет ряд недостатков, связанных с тем, что фильтрация протекает в тупиковом режиме: значительные потери полуфабриката, низкая удельная скорость фильтрации. Таким образом, актуальность научных исследований по совершенствованию технологии концентрирования О-антигенов холерного вибриона является очевидной.
В этой связи разработка экспериментальной масштабируемой технологии глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона – продуцентов О-антигенов и совершенствование процесса концентрирования нативных О-антигенов является важным и перспективным направлением научных исследований.
Цель работы. Исследовать процесс глубинного культивирования атоксигенных штаммов V. cholerae – продуцентов О-антигенов и оптимизировать процесс концентрирования нативных О-антигенов.
Задачи исследования:
1. Изучить основные микробиологические свойства атоксигенных штаммов холерного вибриона – продуцентов О-антигенов после длительного хранения.
2. Исследовать физиологические и морфологические особенности атоксигенных штаммов холерного вибриона – продуцентов О-антигенов в ходе их глубинного культивирования.
3. Выявить биокинетические особенности процесса глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона – продуцентов О-антигенов.
4. Определить оптимальные технологические параметры процесса культивирования атоксигенных штаммов V. cholerae – продуцентов О-антигенов.
5. Усовершенствовать технологию концентрирования О-антигенов холерного вибриона методом ультрафильтрации.
6. Изучить антигенные, биохимические, физико-химические и иммунобиологические особенности О-антигенов, полученных с использованием экспериментальной технологии.
7. Изучить нормируемые свойства коммерческого препарата таблетированной холерной вакцины, полученного по усовершенствованной технологии.
Научная новизна работы заключается в том, что изучены основные морфологические и фенотипические свойства атоксигенных штаммов V. cholerae – продуцентов О-антигенов после длительного (36 месяцев) хранения. Показано, что штаммы сохраняют свои основные культурально-морфологические свойства и высокий уровень биосинтеза О-антигенов.
Впервые исследованы физиологические и морфологические особенности атоксигенных штаммов холерного вибриона – продуцентов О-антигенов в ходе их глубинного культивирования. Показано, что при введении основного источника углеводного питания (глюкозы) происходит закисление культуральной жидкости, что требует добавления корригирующего раствора.
Впервые с помощью атомно-световой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологических особенностей бактериальных клеток атоксигенных штаммов V. cholerae КМ 263 биовара Эль Тор серовара Инаба, V. cholerae КМ 262 биовара Эль Тор серовара Огава и V. cholerae M 377 О139 серогруппы, выращенных в условиях глубинного культивирования. Выявлено, что клетки всех трех штаммов холерного вибриона, выращенных при температурах 30 0С и 37 0С, имеют сходный размер и морфологию.
Экспериментально обоснованы оптимальные технологические параметры (температура, продолжительность, профиль введения глюкозы, время добавления аммиака и пеногасителей) процесса культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона – продуцентов О-антигенов, позволяющие получать нативные О-антигены в препаративных количествах.
Впервые показано, что рост атоксигенных штаммов возбудителя холеры – продуцентов О-антигенов зависит не только от концентрации субстрата, но и от концентрации продукта биосинтеза, причем его накопление снижает скорость роста микроорганизмов.
Усовершенствована технология концентрирования О-антигенов холерного вибриона тангенциальной ультрафильтрацией, защищенная патентом на изобретение № 2445116 «Способ концентрирования нативного холерного O-антигена Vibrio cholerae». Определено, что наиболее эффективно концентрирование О-антигенов V. cholerae с использованием мембран с НОММ, равной 500 кДа.
Установлены оптимальные параметры процесса концентрирования: напор на входе ультрафильтрационного аппарата – 2,5 бар, давление на выходе – 0,5 бар; температура продукта – 37 0С.
Впервые изучен химический состав сублимационно высушенных О-антигенов, полученных из атоксигенных штаммов холерного вибриона. Показано, что препараты О-антигены, полученные из атоксигенных и токсигенных штаммов имеют сходный белковый и полисахаридный состав.
В результате сравнительного анализа иммунохимических и физико-химических свойств О-антигенов V. cholerae М-41 серовара Огава, полученных по регламентной и усовершенствованной технологиям концентрирования, выявлено подобие их характеристик.
Практическая значимость работы заключается в том, что разработана масштабируемая технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона – продуцентов О-антигенов, позволяющая получать полуфабрикаты протективных антигенов соответствующих показателям качества на коммерческую холерную вакцину.
На основании проведенных исследований по разработке технологии получения О-антигенов из атоксигенных штаммов холерных вибрионов выработаны рекомендации по её использованию в технологии приготовления холерной вакцины. Усовершенствованная технология концентрирования О-антигена V. cholerae М-41 серовара Огава внедрена в технологию производства коммерческой холерной вакцины.
Разработаны методические рекомендации:
«Концентрирование протективных антигенов холерного вибриона методом тангенциальной фильтрации», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 18 марта 2011 г.) и утверждённые директором института 11 июня 2011 г.;
«Аппаратное культивирование атоксигенных штаммов холерного вибриона продуцентов О-антигенов», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 8 от 26 декабря 2012 г.) и утверждённые директором института 27 декабря 2012 г.
Результаты исследований использовались при разработке регламента производства № ПР 01898109-39-12 «Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой», утвержденного директором РосНИПЧИ «Микроб» 11 июля 2012 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Атоксигенные штаммы V. cholerae – продуценты О-антигенов сохраняют высокий уровень биосинтеза О-антигенов и свои основные микробиологические свойства в процессе длительного (36 месяцев) хранения.
2. Разработана масштабируемая технология глубинного культивирования атоксигенных штаммов холерного вибриона – продуцентов О-антигенов.
3. Технология концентрирования нативных холерных О-антигенов тангенциальной ультрафильтрацией обладает преимуществом перед процессом, протекающим в тупиковом режиме.
4. Коммерческая серия вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, полученная по усовершенствованной технологии концентрирования О-антигена V. cholerae серовара Огава, соответствует требованиям нормативной документации.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на 14 и 15 международных школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука ХХI века», (Пущино, 2010, 2011); Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2010», (Саратов, 2010); Совещаниях специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой (Ростов-на-Дону, 2013); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (Нижний Новгород, 2011); III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, Московская область, 2011); ХI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» (Саратов, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы», (Саратов, 2013), на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов 2011-2013 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, их них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 патент на изобретение.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 223 цитируемых работы, из них 140 отечественных и 83 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 140 страниц. Текст иллюстрирован 28 таблицами и 15 рисунками.
