Содержание к диссертации
Список сокращений и условных обозначений 5
Введение 6
Обзор литературы 12
Глава 1 Биотехнологические аспекты ферментативного
гидролиза биологических субстратов 12
Принципы гидролиза биологического сырья для получения продукта с заданными свойствами 12
Принципы автолиза дрожжевого сырья для получения продукта с заданными свойствами 19
Глава 2 Конструирование питательных сред для культивирования
лакто- и бифидобактерий 24
Глава 3 Биологические производственно-ценные свойства . *
промышленных штаммов лакто — и бифидобактерий 30
Собственные исследования
Глава 4 Материалы и методы исследований 42
Глава 5 Оптимизация способа получения ферментативных казеиновых
и мясных гидролизатов с высокой ростстимулирующей
активностью в отношении лакто- и бифидобактерий 49
Изучение степени конверсии модельного белкового субстрата при использовании различных ферментных препаратов и ферментосодержащего биологического сырья 51
Изучение кинетики ферментативных реакций и химического состава ферментативных белковых гидролизатов при конструировании двухстадийной модели гидролиза 56
5.3 Изучение влияния степени конверсии субстрата и амино
кислотного состава ферментативных белковых гидролизатов на
накопление биомасс лакто- и бифидобактерий 66
Изучение химического состава и выхода панкреатических **'* белковых гидролизатов, полученных :.:.-разработанньши способами 72
Изучение скорости роста и стабильности основных биологических свойств лакто- и бифидобактерий -v на моделях панкреатических белковых гидролизатов, полученных разработанными способами 82
Глава 6 Разработка способа получения ферментативного
дрожжевого гидролизата с высокой ростстимулирующей
активностью в отношении лакто- и бифидобактерий 85
Изучение качественной характеристики дрожжей хлебопекарных прессованных разных производителей 85-
Изучение влияния условий автолиза и плазмолизирующих реагентов на скорость и степень конверсии дрожжевого сырья 89
Конструирование двухстадийной модели гидролиза дрожжевого сырья при последовательном воздействии эндогенных и экзогенных ферментов 102
Изучение химического состава и выхода дрожжевых автолизатов и ферментативных гидролизатов 105
Изучение скорости роста и стабильности основных :,-":'-биологических свойств лакто- и бифидобактерий
на моделях дрожжевых автолизатов и
ферментативных гидролизатов 110
Глава 7 Конструирование питательных сред для культивирования лакто-
и бифидобактерий 1 16
Глава 8 Сравнительное изучение биологических свойств производствен-
ных штаммов лакто - и бифидобактерий 132
8.1 Антагонистическая активность исследуемых штаммов
лакто- и бифидобактерий 132
Активность кислотообразования исследуемых штаммов лакто- и бифидобактерий
Адгезивная активность исследуемых штаммов лакто- и бифидобактерий
8.4 Антибиотикорезистентность исследуемых штаммов
лакто- и бифидобактерий
8.5 Устойчивость исследуемых штаммов лакто- и
бифидобактерий к биологическим жидкостям
(желудочному соку, желчи) Заключение Выводы
Практические рекомендации Список литературы
5 Список сокращений и условных обозначений
АА - адгезивная активность
АК - активность кислотообразования
АСБ - абсолютно сухая биомасса
БГ — белковый гидролизат
БДДП - биологически дееспособная дискретная плотность
ДА - дрожжевой автолизат
ИАА — ингибирующая антагонистическая активность
К - коэффициент участия клеток в адгезивном процесе
КД - казеиново-дрожжевая среда
КПГ — казеино-печеночньтй гидролизат
КМД - казеиново-мясо-дрожжевая среда
МГІА — мясо-пептонный агар
МПГ - мясо-печеночный гидролизат
МПК — минимальная подавляющая концентрация
МРС — молочно-растительная среда
НС - нативный субстрат
ПА - протеолитическая активность
РП - регламент производства
СПА - средний показатель адгезии
ТДС - термически денатурированный субстрат
ФДГ - ферментативный дрожжевой гидролизат
ФС - фармакопейная статья
ФСП - фармакопейная статья предприятия
ЭМБ - эндотрофная микрофлора биотопов
GMP - Good Manufacturing Practice
Введение к работе
Одним из достижений конца XX века явились разработка и внедрение в жизнь концепции «пробиотики и функциональное питание» [Шендеров Б.А., 2002; Roberfroid М.В., 1998; Kenings W.N., 2000]. Практическая реализация данной концепции способствует решению проблемы массового оздоровления населения, так как реальные и потенциальные потребности отечественного рынка пробиотиков обусловлены широкой распространенностью нарушений естественного микробиоценоза человека.
Приоритетным направлением современной промышленной микробиологии являются многоплановые исследования в области разработки эффективных средств коррекции биоценозов, усовершенствовании выпускаемых форм препаратов, интенсификации и повышении экономической эффективности производства [Алсшкин В.А., 2002; Поспелова В.В. и др., 2002; Бондаренко В.М. и др., 2004; Collins M.D., Gibson G.R., 1999: Cummings J.H. et'al., 2001; Floch M.N., Hong - Curtiss J., 2001].
Прогноз, основанный на анализе экономических и технологических тенденций в сфере производства отечественных пробиотиков, позволяет сделать вывод о том, что в условиях ограниченных инвестиционных возможностей минимизация затрат, необходимая для развития производства в соответствии с требованиями GMP, может быть достигнута лишь при повышении эффективности технологических процессов [Казьянии А.В. и др., 2002]. Одним из стратегических направлений развития индустрии препаратов и продуктов функционального питания с пробиотическими свойствами является усовершенствование методологии промышленного получения биомасс кислотообразующих микроорганизмов-пробионтов, в частности, требуют дальнейшего разрешения вопросы обоснования и регламентации характеристик питательных сред для крупномасштабного культивирования лакто- и бифидобактерий [Лазарева Г.И., 1991; Критская И.В. и др., 1996; Андреева М.А. и др., 1998;
7 -Я:'
Степаненко П.П., 1999; Ганина В.И., 2001; Тихомирова Н.А., 2001; Poch М;,
Bezkorovainy А., 1988; Gibson G.R., Fuller R., 2000]. /'''''[
Известно, что потребность микроорганизмов в питательных веществах
является фенотипическим выражением их генома. Формирование чрезвычай
но ограниченных синтетических способностей лакто- и бифидобактерий фи
логенетически обусловлено их обитанием в естественных нишах биоценоза,
где нутриенты значительно гидролизованы пищеварительными ферментами
макроорганизма [Бойцов А.Г. и др., 1990; Работнова И.Л, Позмогова И.Н.,
1993; Степаненко П.П., 1999]. При изучении питательных потребностей лак-
то- и бифидобактерий, адаптировавшихся к комплексным органическим суб
стратам, выявлена необходимость наличия в составе питательных сред ами
нокислот, витаминов, пуриновых и пиримидиновых оснований, аминосаха-
ров и других ингредиентов, к.примеру, известно, что молочнокислые бакте
рии неизменно нуждаются в витаминах группы Вив значительном количе
стве аминокислот, потребности в которых гораздо шире соответствующих
потребностей высших животных [Stanier R. Y., 1979]. Но, в то же время^ ана-.
лиз литературы не позволяет сделать достоверные выводы о влиянии амйно-
кислотно-пептидного состава ферментативных белковых гидролизатов нана-
копление биомасс лакто- и бифидобактерий вследствие разноречивости дан
ных о наиболее пригодных для них формах азотистого питания [Рахимова
Н.Г., 1969;ВоронкинаИ.М., 1970; ЭрвольдерТ.М. и др., 1980; Назарова А.А.,
1991; Работнова И.Л, 1993; Андреева М.А., 1998; Степаненко П.П., 1999; Sta
nier R.Y. et al, 1979; Jeremija L. et al., 1983; De Feo J.A., 1985]. Регламентиро
ванные технологии производства питательных сред для культивирования
лакто- и бифидобактерий предусматривают использование гидролизата ка
зеина с высокой степенью конверсии белка после гидролиза в течение 5-7 су
ток [Рахимова Н.Г. и др., 1975]. "г""
Исходя из этого, одним из актуальных направлений создания препаратов и продуктов функционального питания с пробиотическими свойствами я'в-ляются разработка методов направленного гидролиза биологического сырья
.:?*
8 /v
для получения белковых гидролизатов и дрожжевых автолизатов с заданны
ми свойствами, в частности, с увеличенным содержанием фракций, обла
дающих ростстимулирующим действием на изучаемые культуры микроорга
низмов, и конструирование на их основе питательных сред с высокими рос
товыми свойствами для накопления биомасс лакто- и бифидобактерий [Тер-
новская Л.Н. и др., 1993; Критская И.В. и др., 1996; Ильина P.M. и др., 2000;
ГанинаВ.И., 2001; D.Dai, W.A.Walcer, 1999]. '"-
Цель исследования: разработка питательных сред, обеспечивающих
высокую скорость роста и стабильность основных биологических свойств
производственных штаммов лакто- и бифидобактерий. ';'.*-
Задачи исследования: i!
Оптимизировать промышленные способы получения основных компонентов питательных сред - ферментативных белковых гидролизатов'/и дрожжевых автолизатов. -*: ;>
Изучить влияние степени конверсии субстратов, качественных и количественных характеристик аминокислотного состава ферментативных белковых гидролизатов на скорость роста и стабильность основных биологических свойств производственных штаммов лакто- и бифидобактерий. ,,;'- '
Сконструировать питательные среды с высокой ростстимулирующей активностью для культивирования лакто- и бифидобактерий.
4 Охарактеризовать производственные штаммы лакто- и бифидо
бактерий по совокупности биологических свойств: антагонистическойу'ки-
слотопродуцирующей, адгезивной активности, аптибиотикорезистентнбети,
устойчивости к биологическим жидкостям желудочно-кишечного тракта;-'*'"
5 Изучить скорость роста и стабильность основных биологических
свойств подобранных производственных штаммов лакто- и бифидобактерий
в сконструированных питательных средах.
Научная новизна. '*-:
Впервые выявлено ростстимулирующее действие фракций белковых гидролизатов с различной степенью конверсии белка на накопление биомасс
лакто- и бифидобактерий. На основании изучения потребностей микроорганизмов в наиболее усвояемых формах азотистого питания оптимизированы условия гидролиза подобранных многосубстратных белковых основ, обеспечивающие эффективные кинетические параметры процесса и максимальный выход продукта с заданными степенью конверсии белка и аминокислотном составом.
Предложена двухстадийная модель биотраасформации дрожжевого сы
рья с последовательной активацией ферментативного профиля автолизи-
рующих дрожжей, обеспечивающая получение ферментативного гидролизата
с высоким содержанием аминокислот, производных нуклеиновых кислот1 и
витаминов группы В. '*""
Новизна проведенных исследований подтверждена решением № 2002132307 о выдаче патента на изобретение «Способ получения панкреатического белкового гидролизата и питательная среда для культивирования бифидобактерий с его использованием» от 26.11.2004 г.
Научно-практическая значимость работы.
Оптимизированы промышленные способы производства ферментативных белковых гидролизатов с дифференцированными для лакто- и бифидобактерий степенью конверсии белка и аминокислотным составом.
Разработан способ реакторного получения ферментативного дрожжевого гидролизата с индуцированными условиями ведения процесса, последовательной активацией эндогенных и экзогенных ферментов, обеспечиваю-щий получение продукта с высокой ростстимулирующей активностью в-Отношении лакто- и бифидобактерий.
Сконструированы рецептуры питательных сред для культивирования производственных штаммов лакто- и бифидобактерий, обеспечивающие высокую скорость роста и стабильность основных биологических свойств'бак-тсриальиых популяций.
Дана сравнительная характеристика производственных штаммов лакто- и бифидобактерий, используемых в иммунобиологической и молочной
10 .;;...
промышленности, по совокупности биологических свойств, определяющих
расширение спектра традиционных регламентированных требований: анта
гонистической, кислотопродуцирующей, адгезивной активности, аитибиоти-
корезистентности, устойчивости к биологическим жидкостям желудочно-
кишечного тракта. и.-гУ
5 Изучены скорость роста и стабильность основных биологических
свойств бактериальных популяций подобранных штаммов лакто- и бифидо-
бактерий, полученных в новых питательных средах.
.'і. ' Внедрение результатов исследования в практику.
\ .'
По материалам исследований составлена и утверждена нормативно-
техническая документация: :..:.-
1. Регламент производства № 1195-02 Лактобактерин сухой
2. Регламент производства № 1165-02 Бифидумбактерин сухой
Основные положения, выносимые на защиту. ...
1 Ростстимулирующее действие на накопление биомасс лакто- и бифи-
добактсрий оказывает степень конверсии белковых субстратов. Максималь
ный ростстимулирующий эффект на штаммы лактобактерий оказывают тид-
ролизаты с глубокой степенью конверсии белка, содержащие (0,85±0,05) %
аминного азота, на штаммы бифидобактерий - гидролизаты со средней степенью конверсии белка, содержащие (0,425±0,025) % аминного азота.
Оптимизированные способы направленного гидролиза многосубстрат-пых белковых основ обеспечивают эффективные кинетические параметры процесса и максимальный выход продукта с заданными степенью конверсии белка и аминокислотным составом. '"" V;
Разработанная двухстадийная модель биотрансформации дрожжевого сырья с индуцированными условиями автолиза и последовательной активацией ферментативного профиля дрожжей обеспечивает максимальный выход ферментативного дрожжевого гидролизата с высоким содержанием аминокислот, производных нуклеиновых кислот и витаминов группы В.
4 Сконструированные питательные среды обеспечивают высокую ско
рость роста и стабильность основных биологических свойств производствен
ных штаммов лакто- и бифидобактерий.
5 Бактериальные популяции производственно-ценных штаммов
L. plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90Т-С4, В. bifidum 1 и В. adolescentis МС-
42, полученные в новых питательных средах, обладают высокой специфиче
ской активностью и стабильностью основных биологических свойств.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской на
учной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и при
менения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвящен
ной 95-летию Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова
ГУП «Иммунопрепарат» (Уфа, 2000), Всероссийской научной конференции
молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека,
клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004), Международном на
учно-практическом семинаре «Вопросы вакцинопрофилактики и иммунокор-
рекции» (г. Ташкент, 2004), заседании Ученого совета Уфимского НИИ вак
цин и сывороток им. И. И. Мечникова филиала ФГУП «МПО «Микроген» МЗ
и СР РФ «Иммунопрепарат» (протокол № 4 от 24.11.2004 г.). :. ;,;;
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных
работ, получено положительное решение № 2002132307 о выдаче патента-на
изобретение (2004 г.). \":,
і ,'*. ' Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена
на 185 страницах, иллюстрирована 40 таблицами, 16 рисунками и 4 технологическими схемами производства. Работа состоит из введения, обзора лите-ратуры, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографического списка, включающего 133 отечественных и 78 иностранных источников.
