Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Туляремия - зооиозная прнродио-очагопая инфекция. Эндемичные очаги туляремии характеризуются стабильностью проявления и широко распространены, и том числе па территории Российской Федерации и соседних стран [Tilrnvik A. el al., 2004; Топорков В.П. и др., 2007, Мещерякова И. С. и др., 2007; Безсмертний BE. и др., 2008; Wang Y. el al., 2011]. Возбудитель туляремии - Francisella lularenxis включен в высшую категорию А как потенциальный агент бнотеррорнзма [Dennis D. el al., 2001; Gallagher-Smilh M. el al., 2004]. Несмотря на достигнутые успехи в исследовании особенностей строения и биологии туляремипного микроба, факторы патогенное этого возбудителя, состав капсулы и протектпвные антигены окончательно не изучены [Mavlasova .1. el al., 2002; Sjosledl A., 2003; Eyles J.E., 2007; Oyslon P.C.F., 2008; Santic M., 2010; Broms .1. E. el al, 2011].
Лабораторная диагностика туляремии основывается па иммунологических (сероал-лергологнческая диагностика) и бактериологических методах, в настоящее время дополнена молекулярпо-геиетнческими методами [Лаб. диагност. ООН, 2009]. В области разработки новых способов детекции туляремипного микроба ведутся активные исследования [Spleltsloesser W. D. el al., 2005; Осипа 1-І. А. н др., 2007; Романова Л. В., 2008; Johansson А. el al., 2010; Ветчннип С. С. и др., 2011; Larson М. F. el al., 2011].
У возбудителя туляремии лппополисахарид (ЛПС) и белки внешней мембраны (ВМ) влияют па специфичность иммунного ответа макрооргапизма, обладают уникальной поли-эпитопной антигенной структурой и рассматриваются как основа для создания профилактических и диагностических препаратов [Хлебников B.C. и др., 1992, 1993; Аропова II. В., Павлович И. В., 2000; Ellis J. el al., 2002; Conlan J.W., 2004; Oyslon P.C.F., 2008, Beasley AS. el al., 2011, Zarella T.M. et al., 2011]. Большое внимание уделяется исследованию комплексных антигенов /". lularensis [Tarnvik A., Bergkmd L, 2003; Spleltsloesser W. D. et al., 2005; Pierson T. et al., 2011]. Получаемые по классическому методу A. Boivin (1933) лнпополиса-харидо-белковые комплексы (ЛПБК) позбудителя туляремии содержат до 10 % белка и характеризуются высокой серологической активностью [Родионова ИВ., Шипицнпа Г.К., 1967]. В зависимости от способа получения ЛПБК имеют различный сосгав, молекулярную массу и свойства. В частности, установлена высокая иммунобиологическая активность ЛПБК ВМ F. lularensis, полученного с помощью обработки бактериальных клеток ультразвуком с последующим ультрацептрифугнропанием, с содержанием 12-22 % белка (25 белковых фракций) и 40 % лнпмдои [Хлебников B.C. н др., 1991]. При обработке ВМ растворами детергентов с последующей гель-фильтрацией был получен высокоактивный ЛПБК (IV фракция, 15-35 кДа) с соотношением ЛПС:белок 1:1 [Хлебников B.C. и др., 1992, Кулепац-кий Д.П., 1994]. Показано, что в составе препаратов ЛПБК присутствуют иммунодомпиант-ные белки с молекулярными массами 17 и 43 кДа [Аверин С.Ф. и др., 1992; Кулевацкий Д.П., 1994] и белок-шапероп 63 кДа (GroEL) [Коровина О.В., 1993]. Комплекс ЛПС-17кДа
белок рассматривается и качестве прототипа химической туляремнйпой вакцины [Klilcbnikov V.S. el al., 1996], также как и одни из препаратов ЛПБК ВМ /". tularensis - С-комплекс [Жемчугов В.її., 2004; патенты РФ 2147234, 2221591]. При оптимизации схемы выделения С-комплскса туляреминпого микроба в условиях масштабированного культивирования штамма-нродуцента F. tularensis 15 ПИИЭГ был разработай метод его нзоэлекгрп-ческой преципитации [Шепелев И.А., 2005]. С использованием этою подхода нами был получен препарат ЛПБК туляреминпого микроба, отличающийся от остальных ранее описанных в литературе комплексных антигенов молекулярной массой, увеличением белкового компонента (более 60 %) и высокой нротсктнвпой активностью при экспериментальной туляремии. Этот препарат ЛПБК получил авторское название протсктивпый антигенный комплекс - ПАК [Кузнецова Е.М. и др., 2011].
Несмотря на достигнутые успехи и исследовании антигенных комплексов ВМ F. tularensis важными условиями при разработке современных эффективных медицинских иммунобиологических препаратов, остаются совершенствование приемов выделения антигенов в иммунологнчеекп активной форме. Изучение особенностей состава и свойств комплексных антигенов туляреминпого микроба разных подвидов позволит провести их детальную характеристику.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Получить диагностически значимые антигенные комплексы /". tularensis и сконструировать на их основе экспериментальные иммуподиагности-ческис препараты.
-
Оптимизировать способы получения пммуиохимимески активных антигенных комплексов туляреминпого микроба.
-
Провести сравнительный анализ полученных препаратов антигенных комплексов туляреминпого микроба разных подвидов.
-
Получить высокоактивные полпклональпые иммунные сыворотки к нротектнвно-му антигенному комплексу туляреминпого микроба и сконструировать па их основе экспериментальные иммуподиапюстикумы для детекции возбудителя туляремии.
-
Разработать па основе антигенных комплексов туляреминпого микроба экспериментальные препараты для детекции специфических антител.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Оптимизированы способы получения биомассы F. tularensis для последующего выделения биологически активных антигенов. Приоритетность работы в данном направлении подтверждена оформлением заявки №2010131275 на изобретение «Способ получения биомассы туляреминпого микроба» (приоритет от 26.07.10 г). Для получения пммуиохимимески активных антигенных комплексов туляреминпого микроба были усовершенствованы способы их выделения н количественного определения. Выделен и охарактеризован гликозилпроваипый белковый комплекс туляреминпого микроба, обла-
дающий иыражеппой нммуногенпостыо и высокой специфичностью, хроматографичсскп гомогенный, с молекулярной массой (57±1) кДа, состоящий из днух белковых субъединиц (43 и 14-17 кДа). Выделен протектмвньнї антигенный комплекс, установлен его компонентный состав: субьединицы с молекулярными массами более 23 кДа имеют белковую природу, 14-17 кДа - липопротеидпую. С помощью протеомпого анализа в составе иротектмипого антигенного комплекса впервые показано паличне следующих идентифицированных белков: белков-шаперопов (GroES и GroEL), ферментов (GAPDH, KalG, АсрР), белков ВМ (OmpII, FTL_0617) и регуляторных белков (EF-Tu, RplL). Установлено, что протсктмвпый антигенный комплекс является видосиецифичпым антигеном, регистрируется у F. lularensis независимо от подвидовой принадлежности штамма, формы ЛПС баїстерналмюй клетки и наличия капсулы.
Впервые на основе сравнительного анализа структуры и свойств препаратов протек-пивного антигенного комплекса, полученных из штаммов F. lularensis subsp. holarciica био-варов eryR, eryS, japonica, subsp. nearclica, subsp. mediciasialica. установлено, что все препараты обладают иммупогенностыо, сходны по химическому составу и содержат иммуиохи-мически активные субъедипицы (10-85 кДа). Антигенный комплекс из F. lularensis subsp. novicicla отличается от ПАК других подвидов более низкой (в 5 раз) иммуиохимической активностью, увеличением содержания углеводной части па (70±3) %, наличием субъсднннц с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием иммуиореактивных белков в области 57-85 кДа.
Сконструированы экспериментальные антнтельпые и антигенные туляремийные ди-агиостнкумы. Использование ПАК и глмкознлироваииого белкового комплекса в качестве маркерных антигенов и иммупоблоттмнге, ИФА и ДИА позволяет определять туляремийные антитела в крови вакцинированных н экспериментально зараженных лабораторных животных. Чувствительность экспериментальных аитительных диапюстпкумов для детекции возбудителя туляремии разных подвидов пммуподиагпостическими методами (ИФА, ДИА) составляет Itf'-IO" м.к./мл. Сконструированный иммуиосуспензнонный диагпостикум в реакции латекс агглютинации (РЛА) позволяет выявлять содержащие капсулу (Сар+) и бес-капсульпые (Сар") штаммы F. lularensis в отличии от коммерческого диапюстнкума для реакции непрямой гемагглютииацин (РИГА), выявляющего только Сар+-штаммы.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Применение антител к С-комплексу ту-ляремийпого микроба для детекции возбудителя туляремии методами иммуноапализа» и «Получение гликознлировашюго белкового комплекса внешних мембран клеток туляре-мийного микроба», одобренные Ученым советом РосМИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 17.04.2008 г. и протокол № 5 от 22.09. 2011 г., соответственно) и утвержденные директором института.
В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован бескап-сульпый штамм F. lularensis holarclica KM 9, производный вакцинного штамма F. lulareiisis 15 лнннн НИИЭГ, который может быть использован при создании диагностических туля-рсминных тест-систем для детекции Сар' штаммов.
Выделенные препараты ПЛК разных подвидов используются при выполнении научно-экспериментальных работ в лабораториях вакцинологпн и иммунопрофилактики, иммунодиагностики и молекулярної"! диагностики РосІІИПЧИ «Микроб». Научные данные об особенностях антигенного строения туляремпйиого микроба, полученные в результате работы, включены в теоретический материал при чтении лекции цикла «Микробиологии и лабораторная диагностика туляремии» па курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям н курсах усовершенствования по специальности «бактериология» в институте «Микроб».