Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1. Характеристика липополисахарида и капсулы V cholerae 0139 17
1.2. Серологические методы диагностики возбудителя холеры 0139 серогруппы 31
1.3. Моноклональные антитела в изучении холерных вибрионов 38
Собственные исследования
ГЛАВА 2. Материалы и методы 45
2.1. Лабораторные животные 45
2.2. Бактериальные штаммы 45
2.3. Клеточные линии позвоночных 49
2.4. Питательные среды и реактивы 49
2.5. Гибридизация клеток 50
2.6. Клонирование гибридом 50
2.7. Культивирование гибридом in vitro и in vivo 51
2.8. Криоконсервирование гибридом 51
2.9. Очистка иммуноглобулинов 52
2.10. Конъюгирование иммуноглобулинов с ФИТЦ 53
2.11. Метод иммунофлюоресценции 53
2.12. Иммуноферментные методы 54
2.13. Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони 56
2.14. Реакция агглютинации 56
2.15. Методы получения препаратов ЛПС и оценки их чистоты 57
2.16. Метод получения белков наружной мембраны 57
2.17. Электрофорез в полиакриламидном геле 58
2.18. Метод тонкослойной хроматографии 59
2.19. Иммуноблоттинг 60
2.20. Методы статистической обработки результатов 60
ГЛАВА 3. Получение и характеристика моноклональных антител к липополи-сахариду V. CHOLERAE 0139 61
3.1. Характеристика препаратов ЛПС, выделенных из клеток холерных вибрионов 0139 серогруппы 61
3.2. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антигел к ЛПС V cholerae 0139 и их первичный скрининг 63
3.3. Изучение специфичности и активности МКА в серологических методах 68
3.4. Определение класса и подкласса моноспецифических иммуноглобулинов 74
3.5. Исследование эпитопной направленности МКА 75
3.6. Получение препаративных количеств МКА, их очистка 80
ГЛАВА 4. Антигенные свойства штаммов v. cholerae 0139 различного происхождения 83
4.1. Характеристика иммунохимической активности штаммов V cholerae 0139, выделенных от человека и из воды 83
4.2. Сравнительное изучение антигенной структуры
клинических и водных штаммов V cholerae 0139 92
ГЛАВА 5. Практическое применение моноклональных антител к ЛПС-0139 96
5.1. Иммунофлуоресцентный диагностикум на основе
МКА для идентификации штаммов V cholerae 0139 97
5.2. Исследование полисахаридных антигенов штаммов V. cholerae 0139, измененных по признаку агглютинабельности, и некультивируемых форм 101
Заключение 108
Выводы 119
Список литературы 121
- Характеристика липополисахарида и капсулы V cholerae
- Моноклональные антитела в изучении холерных вибрионов
- Культивирование гибридом in vitro и in vivo
- Характеристика препаратов ЛПС, выделенных из клеток холерных вибрионов 0139 серогруппы
Введение к работе
Традиционно возбудителем холеры считались только штаммы Vibrio cholerae 01 серогруппы. Однако в 1992 году в Индии и Бангладеш были зарегистрированы случаи заболевания холерой, вызванные вибрионами, не агглютинирующимися 01-сывороткой (Albert M.J. et al, 1993; Ramamurthy Т. et al, 1993), впоследствии обозначенными как V cholerae 0139 синоним Бенгал (Shimada Т. et al, 1993). Эпидемические проявления холеры, обусловленной холерными вибрионами 0139, ежегодно отмечают в Индии и Бангладеш с заносами и распространением по странам Азии. Зарегистрированы без распространения завозы холеры Бенгал в Великобританию, Германию, Данию, Казахстан, Киргизию, Россию, США, Японию (Москвитина Э.А. с соавт., 2003)
В результате молекулярно-генетических исследований были получены данные, указывающие на большое сходство холерных вибрионов 0139 с возбудителем холеры 01 серогруппы биовара eltor (Cholerae Working Group, 1993; Calia K.E. et al., 1994; Johnson J.A. et al, 1994; Waldor M.K., Mekalanos J.J., 1994 и др.). В то же время выявлены и важные отличительные особенности нового возбудителя холеры, а именно - продукция ранее неизвестного О-антигена и наличие полисахаридной капсулы (Hisatsune К. et al., 1993; Johnson J.A. et al, 1994; Weintraub A. et al., 1994 и др.).
Характеристике свойств вибрионов «Бенгал», в том числе липополисахариду и капсуле, посвящено большое количество публикаций. Так, установлено, что отличительной чертой ЛПС V cholerae 0139 является короткая О-боковая цепь и отличный от 01 серогруппы углеводный состав. Рядом авторов
8 показано наличие сходных повторяющихся единиц в структуре Оцепи ЛПС и
капсульном полисахариде (Waldor М.К. et al., 1994; Comstock L.E. et ai, 1995).
Выявлены общие антигенные детерминанты с другими микроорганизмами:
V.cholerae 022 и 0155, Aeromonas trota, V mimicus, Escherichia coh 055,
Salmonella greenside (Albert M.J. et al, 1995; Knirel Y.A. et al, 1996; Oscarson S. et
al, 1997; Landersjo С et al, 1998). Обнаружено, что капсула маскирует О-
антигенные цепи ЛПС, а также рецепторы к некоторым холерным фагам, на
основании чего был предложен метод идентификации капсульных и
бескапсульных штаммов при помощи умеренных холерных бактериофагов (20 и
Инаба), полученных Н.М. Остроумовой из штамма холерного вибриона 01
(Щелканова Е.Ю., 1998; Чеховская Г.В. с соавт., 2000). Применение молекулярно-
генетических методов позволило установить, что продукция 0139-антигена и
капсулы контролируется как общими, так и различными хромосомными генами
(Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1994; Вік Е.М. et al., 1995; Смирнова Н.И. с соавт.,
1995). Определена локализация на хромосоме генов rfb 0139 и cap,
контролирующих синтез 0139-антигена и капсулы, соответственно (Чеховская
Г.В., 1997). Имеются данные, указывающие на определенную связь между
продукцией капсулы и вирулентностью V cholerae 0139 благодаря ее участию в
защите от бактерицидного действия нормальной человеческой сыворотки, в
адгезии и колонизации кишечника человека и экспериментальных животных
(Waldor М. et al, 1994; Johnson I. et al, 1994; Смирнова Н.И. с соавт., 1995).
Показано, что капсула является протективным антигеном (Sengupta D.K. et al,
1996; Федорова В.А. с соавт., 1997).
9 Однако, с момента первоначального обнаружения V cholerae 0139 в 1992
году появились новые варианты возбудителя с измененными генетическими и
фенотипическими характеристиками. Изолированы и охарактеризованы штаммы
с новыми риботипами, СТХ-генотипами, измененной антибактериальной
чувствительностью (Mitra R. et al., 1996; Faruque S.M. et al, 1997,1999). В 1993 г.
в Аргентине впервые был выделен авирулентный штамм 0139 серогруппы,
лишенный генов холерного токсина ctxAB (Rivas М.С. et al., 1993).
Нетоксигенные холерные вибрионы 0139 были изолированы и из воды
поверхностных водоемов на территории Российской Федерации: в Московской,
Новосибирской, Ростовской областях, а также в Республике Калмыкия (Ганин
B.C. с соавт., 1997; Кюрегян А.А. с соавт., 1999, 2000, 2002; Ломов Ю.М. с соавт.,
2000; Кругликов В.Д. с соавт., 2002). В результате многочисленных исследований
установлено, что отсутствие в хромосоме структурных генов холерного токсина
является основной причиной авирулентности большого числа штаммов 0139
серогруппы (Albert M.J. et al, 1996). Показано, что штаммы, выделенные из
объектов окружающей среды, лишены 70 % тестируемых генов, связанных с
вирулентностью, тогда как клинические обладали полным набором этих
детерминант (Осин А.В. с соавт., 2003). Выявлены различия в ПЦР-генотипах
(Мишанькин Б.Н. с соавт., 2000), подвижности вибрионов, продукции
маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии и белка внешней
мембраны OmpU (Осин А.В. с соавт., 1999), субстратном спектре и структуре
нейраминидаз вибрионов 0139, выделенных из клинического материала и воды
поверхностных водоемов (Шиманюк Н.Я. и др., 1999; Дуванова О.В., 2001).
Ерошенко Г.А. с соавт. (2002) была разработана модификация метода
10 риботипирования для изучения генетического родства штаммов V cholerae и
созданы зонды на гены 16S и 32S рРНК, позволяющие дифференцировать
вирулентные и авирулентные штаммы 0139 серогруппы. В то же время,
обнаружены и сходные признаки: экспрессия внеклеточных протеаз, наличие
полисахаридной капсулы (Осин А.В. с соавт, 2000). Показана способность
авирулентных вибрионов 0139 агглютинироваться поликлональной сывороткой,
полученной к вирулентному штамму «Бенгал», что указывает на структурное
сходство О-антигенов, определяющих их серологическую специфичность.
Однако данных о более детальном исследовании антигенных детерминант,
входящих в состав клеточной поверхности вибрионов 0139 серогруппы,
выделенных из воды, в доступной литературе мы не обнаружили.
Наряду с типичными из объектов окружающей среды могут выделяться
штаммы холерных вибрионов атипичные по серологическим свойствам, в том
числе со сниженной агглютинабельностью холерными О-сыворотками (Стогова
А.Г. с соавт., 1989, Кожухов И.Г. с соавт., 1991; Ломов Ю.М. с соавт., 1994;
Подосинникова Л.С. с соавт., 2000; Кюрегян А.А. с соавт., 2002; Безсмертный
В.Е. с соавт., 2003 и др.). И если изучению ЛПС таких измененных вариантов V.
cholerae 01 серогруппы посвящено большое число работ (Shimada Т. et ah, 1973;
Hisatsune К., Kondo S., 1980, Сомова А.Г. с соавт., 1978; Гальцева Г.В. с соавт.,
1989; Седина С.Г., Цитцер А.О., 1990; Черепахина ИЛ. с соавт., 1994, 1996, 1999;
Алексеева Л.П. с соавт., 1998 и др.), то сведения о поверхностных
полисахаридных антигенах слабо- или инагглютинабельных штаммов V cholerae
0139 практически отсутствуют.
Использование поликлональных О-специфических сывороток не всегда позволяет выявить особенности антигенной структуры различных вариантов вибрионов 0139 серогруппы. В большей степени для этой цели пригодны моноклональные антитела (МКА). В отечественной литературе на момент начала нашего исследования отсутствовали сведения о получении МКА к ЛПС V. cholerae 0139. Нам представляется, что привлечение последних для более детального исследования антигенной структуры штаммов 0139, выделенных из воды, поможет установить их подлинное место среди представителей вида V cholerae.
Цель исследования;
Получение моноклональных антител к лииополисахариду V cholerae 0139 и их применение для изучения антигенной структуры штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения и разработки экспериментальных диагностических препаратов.
Задачи исследования:
Выделить и очистить препараты ЛПС из клеток штаммов V cholerae 0139, выделенных от человека и из воды, изучить их состав и иммунохимические свойства.
Получить гибридомы-продуценты МКА к ЛПС V cholerae 0139, охарактеризовать их свойства.
Использовать МКА к ЛПС для иммунохимического анализа поверхностных полисахаридов вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения.
4. Сравнить иммунохимические свойства штаммов V cholerae 0139,
выделенных из различных источников, в иммунологических реакциях
Изучить изменения антигенной структуры у инагглютинабельных и некультивируемых форм холерных вибрионов 0139 серогруппы с помощью МКА.
Исследовать возможность использования МКА в качестве диагностических реагентов, разработать на их основе препараты для детекции штаммов V. cholerae 0139.
Научная новизна и теоретическая значимость
Впервые создана панель гибридом-продуцентов моноклональных антител строго специфичных в отношении ЛПС и микробных клеток возбудителя холеры 0139 серогруппы. Показано отсутствие перекрестной активности МКА с микроорганизмами, имеющими антигенное родство с холерными вибрионами «Бенгал». Установлено, что МКА направлены к эпитопам полисахаридной части ЛПС-0139.
Получены приоритетные сведения, касающиеся структуры ЛПС штаммов V cholerae 0139, выделенных от человека и из воды поверхностных водоемов России. Установлено, что штаммы водного и клинического происхождения имеют сходный эпитопный состав ЛПС, однако клинические штаммы проявляют более высокую антигенную активность в иммуноферментных методах, что обусловлено более плотным экспонированием полисахаридных детерминант на клеточной поверхности. С помощью иммуноблота получены новые данные, свидетельствующие о способности ЛПС холерных вибрионов 0139 серогруппы,
13 выделенных от человека и из воды, образовывать комплексы с протеинами
разной молекулярной массы.
Показана возможность применения полученных МКА для изучения вариабельности антигенной структуры у инагглютинабельных штаммов и вибрионов в некультивируемом состоянии.
Практическая ценность работы
Получены и выведены в массовую культуру гибридомы, продуцирующие МКА к серовароспецифическим антигенным детерминантам ЛПС V cholerae 0139, которые хранятся в жидком азоте в РостНИПЧИ.
Гибридный клон D11/0139, продуцирующий моноклональные антитела к ЛПС V cholerae 0139, депонирован в специализированной коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии АН России под номером РККК(П) 674Д от 17 05.2002.
На основе МКА разработан экспериментальный диаі ностический препарат для идентификации штаммов V cholerae 0139 в реакции прямой иммунофлюоресценции и оформлена «Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов холерных 0139 моноклональных люминесцирующих сухих», одобренная Ученым советом Ростовского НИПЧИ (протокол № 4 от 27.06.2002) и утвержденная директором института. На базе института проведены испытания экспериментальных серий препарата на широком наборе штаммов.
По материалам диссертации составлены методические рекомендации «Дифференциация штаммов Vibrio cholerae 0139, выделенных из клинического материала и воды, в реакции преципитации с использованием моноклональных антител» и «Выявление некультивируемых форм холерных вибрионов с помощью
14 моноклональных антител к О-антигену в экспериментальных микрокосмах»,
одобренные Ученым советом Ростовского НИПЧИ (протокол № 8 от 17.06.2004
г.) и утвержденные директором института.
Основные положения,выносимые на защиту
Полученные гибридные культуры продуцируют моноклональные антитела к ЛПС, отличающиеся строгой специфичностью в отношении холерных вибрионов 0139 серогруппы и высокой активностью в серологических реакциях, используемых в лабораторной диагностике холеры.
Исследование фракции деградированного полисахарида V.cholerae 0139 в твердофазном иммуноферментном анализе показало, что МКА направлены к полисахаридной части ЛПС, а с помощью иммуноблота установлена их направленность к эпитопам структурных компонентов, локализованных в области с мол. массой ниже 16 кДа, что соответствует О-полисахариду и кору.
Штаммы V. cholerae 0139, выделенные от человека и из воды рек на территории России, имеют сходный эпитопный состав поверхностных полисахаридов, однако наблюдаются различия в плотности экспонирования ряда эпитопов у вибрионов этих групп, в связи с чем чувствительность иммуноферментных методов на основе моноклональных антител выше в отношении клинических штаммов по сравнению со штаммами, выделенными из воды.
С помощью высокоспецифичных МКА можно выявить изменения антигенной структуры у инагглютинабельных штаммов и вибрионов в некультивируемом состоянии.
15 5. На основе МКА созданы экспериментальные серии диагностических
люминесцирующих моноклональных иммуноілобулинов, отличающиеся высокой
чувствительностью и строгой специфичностью в отношении V cholerae 0139,
предназначенные для ускоренной идентификации возбудителя холеры 0139
серогруппы, и оформлена соответствующая научно-техническая документация.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на научных конференциях и
конкурсах молодых ученых РостНИПЧИ (2000-2003), представлены на
Проблемной комиссии по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ
«Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону, 2000-2002, 2005,
2006; VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера»,
Ростов-на-Дону, 2003; IV Межгосударственной научно-практической
конференции государств участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекций», Саратов, 2003; II Межвузовской Международной конференции молодых ученых «Обмен веществ при адаптации и повреждении», Ростов-на-Дону, 2003. Исследования выполнены в рамках плановой научной темы «Антигены поверхностных структур холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения» (№ гос. регистрации 01.200.2 12989).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано в соавторстве 16 научных работ, из них 5 - в центральной печати.
Структура диссертации
Работа изложена на 148 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка лигературы. Библиография включает 200 источников, в том числе зарубежных - 123. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками и 13 таблицами.
Характеристика липополисахарида и капсулы V cholerae
В 1992 году в Индии, штате Мадрас, и Южном Бангладеш были зарегистрированы случаи тяжелой диареи клинически неотличимой от холеры, но вызванной вибрионами неизвестной серогруппы (Cholera Working Group, 1993; Ramamurthy Т. et al, 1993). В течение короткого времени заболевание распространилось на другие части обеих стран и некоторые соседние страны региона (Chongsa-nguan М. et al, 1993; Nair G.B. et al, 1994; Faruque S.M. et al., 1997). В результате первоначальных исследований было показано, что бактерии, ответственные за эпидемии, по культуральным и биохимическим характеристикам сходны с V cholerae 01 eltor, но не агглютинируются холерными 01 диагностическими сыворотками. Более того, эти бактерии не принадлежали ни к одной из 138 серологических групп, известных на тот момент, в результате чего было сделано заключение, что они принадлежат к новой серогруппе, получившей обозначение V cholerae 0139 синоним «Бенгал», по месту первого обнаружения (Shimada Т. et al, 1993).
Широкомасштабное распространение холеры, вызванной холерными вибрионами 0139, а также тот факт, что V cholerae 0139 стала первой не 01 серогруппой, обладающей эпидемическим потенциалом, обусловило большое количество работ, посвященных новому варианту возбудителя холеры.
В результате было выявлено принципиальное отличие бенгальских штаммов от традиционного возбудителя холеры V cholerae 01, а именно продукция ранее неизвестного 0139-антигена и полисахаридной капсулы (Johnson J.A. et ai, 1994; Waldor M.K. et al, 1994;
Липополисахарид (ЛПС) является основным компонентом наружной мембраны всех грамотрицательных бактерий. С момента его открытия более ста лет назад, ЛПС стал одной из наиболее изучаемых структур бактериальной клетки. Подобный интерес обусловлен как его важной ролью в жизнедеятельности микроорганизмов, так и перспективами его использования для диагностики и борьбы с инфекционными заболеваниями животных и человека. ЛПС, как известно, обеспечивает целостность и стабильность мембраны, селективную проницаемость, межклеточные взаимодействия. Кроме того, он представляет собой бактериальный эндотоксин, обладающий широким спектром токсических свойств, выступает в роли иммуногена и антигена бактерии (Адамов А.К., 1981; Ткаченко В.В., 1982; Proctor R.A., 1984; Белов Л.Г., 1997). Изучение детального строения ЛПС делает возможным понимание механизмов его биологического действия, разработку оптимальных путей получения диагностикумов, вакцин и иммуностимуляторов.
В настоящее время химическая структура ЛПС многих видов грамотрицательных бактерий уже достаточно подробно расшифрована. Установлено, что для большинства микробов формула молекулы ЛПС может быть представлена как липид А - коровый олигосахарид - О-полисахарид (Яровая Л.М. и соавт., 1991; Книрель Ю.А., Кочетков Н.К., 1993; Покровский и соавт., 1993). Такой тип ЛПС был обозначен как типичный, полный, гладкий (smooth) или S-ЛПС, поскольку бактерии, синтезирующие S-ЛПС, как правило, формируют на твердых питательных средах колонии гладкого типа Однако, для ряда микроорганизмов, в частности, Yersinia, Haemophilus, Bordetella, Bacteroides и других, характерна шероховатая (rough) или R-форма ЛПС, лишенная 0 полисахарида (Jennings H.J. et al., 1980; Le Dur A. et al., 1980), и в большинстве случаев такие бактерии образуют колонии шероховатой формы.
Липид А - фосфорилированный дисахарид, построенный из двух остатков глюкозамина, несущих остатки высших жирных кислот. Он является наиболее консервативной частью липополисахаридной молекулы, так как его структурная композиция характеризуется значительным сходством у различных представителей семейства Enterobacteriaceae и микробов других семейств (RietschelE.T. a/., 1984).
Кор представляет собой кислый олигосахарид, связанный непосредственно с липидом А, включающий до 12 моносахаридных остатков. В его состав входят кислые и нейтральные моносахариды, фосфатные группы, а часто также и аминокомпоненты, например, этаноламин. Он присутствует в ЛПС всех изученных грамотрицательных бактерий независимо от того, имеется ли в молекуле полисахаридная цепь. Его структура также примерно одинакова у большинства грамотрицательных бактерий (Luderitz О. et al, 1982; Книрель Ю.А. ссоавт., 1993).
Моноклональные антитела в изучении холерных вибрионов
История получения моноклональных антител берет свое начало с работы G. Kohler и С. Milstein (1975), которые добились слияния короткоживущих лимфоцитов, продуцирующих антитела, и постоянно растущих клеток плазмоцитомы. Это открытие дало возможность получать «бессмертные», непрерывно культивируемые клоны гибридных клеток - продуцентов антител (гибридомы). Антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток, получили название моноклональных (МКА). Образуемые гибридомами МКА абсолютно идентичны друг другу по всем параметрам, в отличие от поликлональных сывороток, для которых характерны вариации специфичности, аффинности, авидности и других признаков популяций антител, входящих в ее состав.
В настоящее время получение МКА является ведущей областью медицинской биотехнологии. Количество созданных гибридом превышает тысячи и постоянно растет. Благодаря своим уникальным свойствам МКА нашли широкое распространение для решения многих актуальных задач в биологии и медицине. К настоящему времени основными областями использования МКА являются: - изучение вирусных, бактериальных, грибковых, паразитарных антигенов и разработка диагностических препаратов для обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний; - идентификация и очистка молекул и клеток, несущих специфический антиген; получение терапевтических реагентов, обеспечивающих сайт-специфическую доставку лекарственных веществ, или пассивная иммунизация свободными антителами; - углубленное исследование антигенных детерминант поверхностных структур клеток белковой, полисахаридной, нуклеопротеиновой природы (Семенов Б.Ф., 1985; Игнатьева Г.А. с соавт., 1989; Рыбальский Н.Г. с соавт., 1989).
Однако не совсем правомерно считать, что МКА могут полностью заменить поликлональные сыворотки. Последние могут быть использованы, например, когда определяемый антиген денатурирован или изменен каким-либо другим путем. Не оправдано также использование МКА для определения молекул у генетически различающихся видов без тщательного тестирования, гарантирующего, что эти молекулы не "ускользнули" из области специфичности МКА из-за генетического полиморфизма (Goding J.W., 1986). Поэтому выбор между поликлональными и моноклональными антителами должен определяться их свойствами, необходимыми для решения конкретных задач (таблица 1).
Следует отметить, что изначально внедрение гибридомной технологии в микробиологию осуществлялось медленно. Одна из причин состояла в том, что бактериологические методы идентификации культур успешно конкурировали с иммунологическими реакциями. Так, первые работы по получению МКА к холерному вибриону появились только в начале 80-х годов.
В. Gustafsson et al. (1982) получили МКА к коровой области ЛПС V. cholerae 01. Авторы исследовали активность препарата в методе слайд-агглютинации. Поскольку антитела относились к классу IgG, их агглютинирующая способность оказалась достаточно низкой, однако проблема была решена путем коагглютинации антител с белком A Staphilococcus aureus. Полученные МКА выявляли антигенную детерминату общую для всех представителей вида V cholerae. И если коммерческая сыворотка служила преимущественно диагностическим целям, то МКА сыграли важную роль в изучении химической структуры и иммунологических свойств ЛПС. Позднее этой группой авторов были получены МКА к А-, В- и С-антигенам V. cholerae 01, активность и специфичность которых была проверена в ИФА и реакции слайд ft 7 агглютинации. Чувствительность в ИФА составила 5x10-5x10 мкл л./мл, было показано отсутствие перекрестных реакций с гетерологичными микроорганизмами, что свидетельствовало о высокой диагностической ценности антител. На основе этих МКА также были получены препараты флюоресцирующих иммуноглобулинов для ускоренной диагностики холерных вибрионов 01 серогруппы (Gustafsson В. et al, 1983-1985).
Культивирование гибридом in vitro и in vivo
Клонирование и реклонирование гибридных культур осуществляли методом предельных разведений (Underwood P.A., Bean Р.А., 1988). Для этого гибридомы осторожно суспендировали в культуральной среде, и определяли концентрацию жизнеспособных клеток окрашиванием трипановым синим. Затем суспензию разводили так, чтобы в 1 мл содержалось 50 клегок, и разливали по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета с фидерными клетками (т.е. по 5 клеток на лунку), панель помещали в С 02- инкубатор. Образование клонов контролировали при помощи инвертированного микроскопа. В тех лунках, где образовывались моноклональные культуры, проверяли продукцию антител. Процедуру повторяли до тех пор, пока не переставали регистрироваться колонии, не продуцирующие антитела (5-7 клонирований).
После покрытия клетками 2/3 поверхности дна их аккуратно суспендировали и переносили в лунки объемом 2 мл, в которые накануне были внесены перитонеальные макрофаги. После разрастания гибридом их пересевали в планшеты с лунками объемом 5 мл, а затем в чашки Петри и культуральные флаконы емкостью 50-100 мл. Замену ростовой среды проводили по мере ее закислення в результате роста клеток (каждые 2-3 дня).
Культивирование гибридом in vivo проводили в организме мышей Balb/c. За неделю до инъекции клеток гибридомы проводили интраперитонеальную инъекцию 0,5 мл пристана (2,6,10,14-тетраметилпентадекана, 96%; «Janssen ft 7
Chemica»), Гибридомы вводили в количестве 10-10 клеток на мышь в культуральной среде. Асцитическая опухоль формировалась через 14-21 день. Гибридные клетки суспендировали в культуральной среде, определяли их концентрацию в тесте с трипановым синим, и центрифугировали при 800 об./мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали до концентрации 10 м.к./мл в охлажденной среде для замораживания, содержащей 40 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (КРС) и 10 % ДМСО. Суспензию клеток разливали по I мл в полипропиленовые ампулы, охлаждали на 1 С в минуту до -70С и переносили в жидкий азот.
При размораживании клеток ампулу помещали в водяную баню при 37С, добавляли 10-кратный объем культуральной среды, аккуратно перемешивали и центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 минут. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в среде, содержащей 15% фетальной сыворотки КРС и разносили в лунки культуральных панелей (Моноклональные антитела, 1983).
Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных супернатантов гибридом и асцитических жидкостей мышей осуществляли преципитацией сульфатом аммония (Reik L.M et al, 1987). К охлажденным супернатантам медленно, постоянно перемешивая добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до конечной концентрации 50% (при выделении IgG) и 40% (при выделении IgM). Пробы оставляли на магнитной мешалке в холодильнике на 1 час, после чего центрифугировали при 5 тыс. об./мин в течение 15 минут. Осадок иммуноглобулинов G ресуспендировали в минимальном объеме дистиллированной воды и диализовали против 500-1000 объемов фосфатно-солевого буфера (ФСБ) с трехкратной сменой в течение 18-24 часов. Осадок IgM перерастворяли в ФСБ и диализовали против дистиллированной воды, после чего повторно центрифугировали и ресуспендировали в 1,8% NaCl.
Характеристика препаратов ЛПС, выделенных из клеток холерных вибрионов 0139 серогруппы
С целью выяснения, чем обусловлены различия между препаратами ЛПС, выделенными из штаммов V. cholerae 0139 различного происхождения, нами был исследован углеводный состав ЛПС методом тонкослойной хроматографии с окраской нингидрином (Захарова И.Я, Косенко Л.В., 1982). Как известно, коровая часть ЛПС холерных вибрионов достаточно консервативна по своему составу (Книрель Ю.А., Кочетков Н.К., 1993), поэтому различия между штаммами мы попытались найти в полисахар идной части ЛПС. Однако исследование моносахаридного состава деградированных полисахаридов ЛПС не выявило каких-либо различий. Так, в соответствующих гидролизатах штаммов вибрионов 0139 серогруппы, выделенных от человека и из воды, обнаружена быстромигрирующая колитоза. В солянокислотных гидролизатах деградированных полисахаридов обнаружены глюкозамин, квинозамин, галактозаминуроновая кислота и неидентифицированный аминосахар с подвижностью меньшей, чем у квинозамина (рис. 5).
Отсутствие качественных различий в моносахаридном составе препаратов ЛПС позволяет предположить, что образование второй линии преципитации обусловлено разной плотностью экспонирования углеводных эпитопов у штаммов V cholerae 0139 различного происхождения. Кроме того, поликлональные сыворотки содержат пул антител к детерминантам разной химической природы, и различия в реакции преципитации могут быть связаны и с белковыми компонентами.
Для дальнейшего изучения особенностей антигенной структуры штаммов V cholerae 0139, выделенных от человека и из воды, мы получили МКА к ЛПС.
Раздел работы по получению набора гибридом, стабильно продуцирующих МКА к различным полисахаридным антигенным детерминантам возбудителя холеры 0139 серогруппы, включал в себя несколько этапов, первым из которых являлась подготовка родительских клеток. Иммунные спленоциты получали путем иммунизации мышей линии Balb/c клетками штамма V cholerae 0139 Р-16064, убитыми нагреванием (при 100С, в течение 30 минут) и мертиолатом натрия в конечном разведении 1:10000. Иммунизацию мышей проводили по двум схемам. По первой схеме каждому животному трехкратно с интервалом 2 недели вводили внутрибрюшинно в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) 0,1 мл инактивированной взвеси холерных вибрионов (108 м.к./мл). Вторая схема предусматривала еженедельное, в течение месяца, одновременное внутрибрюшинное и внутривенное введение иммуногена в дозе 108 м.к./мышь. Селезенку мышей извлекали на третьи сутки после заключительной инъекции антигена. Суспензию иммунных спленоцитов готовили путем растирания селезенки в гомогенизаторе при добавлении бессывороточной среды RPMI-1640. Перед этим в ТИФА проверяли титры антител в сыворотках иммунизированных мышей, значения которых колебались в пределах 1:5000-1:30000. Мышиные миеломные клетки NS0 перед гибридизацией поддерживали в логарифмической фазе роста.
Слияние селезеночных клеток мыши с миеломой NS0 проводили в соответствии с методикой Fazekas de St. et al. (1980), описанной в «Материалах и методах».
Первичный скрининг специфических антител, продуцируемых гибридомами, проводили на 14-21 день иммуноферментным методом. Для тестирования отбирали культуральную среду из тех лунок, где клетки покрыли 2/3 поверхности дна. В качестве антигена использовали бактериальную взвесь V cholerae 0139 P-16064 в дозе 10-10 м.к /лунку или раствор ЛПС 0139 из расчета 0,1-0,5 мкг/лунку. Постановку ТИФА осуществляли по схеме, приведенной в «Материалах и методах».
Отбор гибридных культур, продуцирующих МКА, проводили также методом непрямой иммунофлуоресценции. Для этого использовали фиксированные этиловым спиртом мазки, приготовленные из 1 млрд. взвесей суточных агаровых культур холерных вибрионов 0139 серогруппы. В качестве «вторых» антител применяли кроличьи антимышиные глобулины, меченные ФИТЦ, производства института им. Н.Ф. Гамалеи (Москва).
Проведение гибридизаций позволило получить и исследовать антителообразующую активность в общей сложности 510 первичных культур. Итоговые результаты гибридизации отражены в таблице 3. Как видно из таблицы, доля антителопродуцентов, выявленных при первичном тестировании, колебалась от 10,0 до 36,7 % в зависимости от способа инактивации иммуногена и схемы его введения. Наибольшее число гибридных культур, продуцирующих МКА, зарегистрировано, если мышей иммунизировали по первой схеме клетками V cholerae 0139, убитыми мертиолатом натрия. При этом с целью получения активированных лимфоцитов предпочтение следует отдать схемам с интервалами (л 7 2-3 недели между инъекциями и более низкой долей иммуногена порядка 10 -10 м.к./мышь, что подтверждается показателями титров антител в сыворотках иммунных мышей в ТИФА (1:10000-1:30000). Результаты опытов показывают также сравнительно низкую эффективность гибридизаций в случае взятия спленоцитов от мышей, иммунизированных микробными клетками, убитыми нагреванием, с интервалом 1 неделя, которая составила около 10,0 %.
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
