Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ В настоящее время Vibrio choterae 0139, ставший причиной крупных эпидемических вспышек в ряде стран Юго-Восточной Азии в начале 90-х годов XX века [Albert et al, 1993; Chongra-nguan et al, 1993, Levisalles, 1993; Ramamurthy et al, 1993; Albert, 1994, 1996], является, наряду с V cholerae 01, признанным вторым этиологическим фактором холеры [Kaper et al, 1995; Faruque et al, 1998; Смирнова. Кокушкин, 2001; Смирнова, 2002] Хотя в данный момент на эндемичных территориях эпидемиологическая ситуация характеризуется преобладанием заболеваний холерой, связанной с V cholerae 01, вспышки холеры, вызванной вибрионом 0139 серогруппы, продолжают достаточно часто регистрироваться и по сей день [Raut et al, 1999; Basu el al, 2000; Kamble et al. 2000]. При этом, активная миграция населения, обусловленная развитием международных торговых отношений и туризма, а также межнациональными конфликтами, значительно повышает риск повсеместного распространения данной инфекции и завоза ее в Россию, а ухудшение социально-экономических условий жизни в нашей стране служит дополнительным фактором, способствующим развитию эпидемических осложнений Учитывая также возрастание угрозы биотерроризма, проведение исследований, посвященных разработке эффективных тестов для детекции V cholerae 0139, представляется несомненно актуальным
Как известно, наряду со способностью синіезировать уникальный по структуре О-антиген [Johnson et al, 1994; Waldor et al, 1994; Bik el al, 1995; Comstock et al, 1995; Kaper et al, 1995; Nandy et al, 1995; Knirel et al, 1997; Смирнова, 2002], Г cholerae 0139 характеризуется наличием капсулы [Weintraub et al, 1994; Смирнова с соавт , 1995; Comstock et al. 1995, Kaper et al, 1995: Смирнова, 2002]. Ввиду потенциальной диагностической и протективной значимости, обе поверхностные структуры новою возбудителя стали предметом пристального внимания многих исследователей Несмотря на использование разнообразных подходов при изучении антигенной специфичности, иммуно- и биохимических свойств капсульного антигена (КАГ) и липополисахарида (ЛПС) V cholerae 0139, остаются открытыми ряд вопросов, связанных с выявлением различий в иммунореактивности отдельных компоненюв Э1их субстанций, в частности, липида А ЛПС, и особенностей эпитопной композиции названных антигенов. Немаловажное значение имеет изучение антигенных свойств адгезинов вибрионов, играющих важную патогенетическую роль при холерной инфекции
Особенности антигенной структуры V cholerae 0139 обусловили
неэффективность диагностикумов, предназначенных для выявления V cholerae
Ol [Albert et al. 1993, Levisalles, 1993], что предопределило необходимость
разработки специфичных, высокочувствительных и экспрессных способов
детекции данною возбудителя, среди которых ведущее место заслуженно
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ і БИБЛИОТЕКА I
4 занимают иммуподиагностические методы На сегодняшний день для иммунодиагностики холеры, вызванной V cholerae 0139, предложено большое количество поли- и моноклональных препаратов [Мазрухо с соавт, 1994; Щуркина с соавт. 1995; Hasan et al, 1995; Qadri et al, 1995; Ишина, Мазрухо,
1997. Мазрухо. Ишина, 1997, 1998; Федорова с соавт, 1998; Chaicumpa el al,
1998, Ишина, 1999J, однако задача повышения их эффективности и
совершенствования технологии получения специфических иммунореагентов
представляется весьма важной Так. поликлональные диапюстикумы
основываются на использовании адсорбированных сывороток против V cholerae
0139 [Мазрухо с соавт , 1994; Shimada et al. 1994; Щуркина с соавт. 1995].
которым присущи такие недостатки, как ниікая активность после проведения
адсорбции гетсрологичными микроорганизмами, значительное количество
фоновых неспецифических реакций, нестандартность серий и тд. [Финдлей,
Эванз, 1990; Г.горов с соавт, 1991; Кэтти. 1991] Одним из путей улучшения
качества таких сывороток является отработка методик получения
моноспецифических сывороток [Кэтти, 1991: Егоров с соавт, 1991; Janeway,
1 ravers, 1997; Ройт с соавт, 2000], например, в результате использования для
иммунизации биопродуцентов химически изолированных антигенов, взамен
приготовленных кипячением термостабильных О-антигенов, иммунизация
которыми приводит к получению антител с широкой кросс-реактивностью
[Мазрухо с соавт , 1994: Shimada el al, 1994: Ломов с соавт., 1995; Щуркина с
соавт, 1995; Чеховская с соавт., 2000]. Альтернативным способом повышения
качества иммунодиагностических препаратов служит применение
моноклональных антител (МКА). обладающих высокой активностью, строгой
специфичностью, стандартностью [Кеннет с соавт . 1983; Финдлей, Эванз. 1990;
Егоров с соавт.. 1991; Кэтти, 1991]. За рубежом применяется несколько
моноклональных диагностических тест-систем для детекции V cholerae 0139
[Hasan et al, 1995; Qadri et al., 1995; Chaicumpa et al, 1998], однако в нашей
стране аналогичные препараты пока находятся на стадии разработки [Маркина с
соавт., 2001; Алексеева с соавт., 2002, 2003] Высокоактивные и специфичные
антитела могут быть также использованы в качестве тонкого инструмента
иммунохимической характеристики препаратов КАГ и ЛПС, термостабильных
О-антигенов и изучения особенностей экспрессии соответствующих лигандов в
цельной микробной клетке. Кроме того, как поли-, так и моноклональные
иммунореагенты могут найти применение при экспериментальном и
производственном выращивании штаммов-продуцентов антигенов
соо і ветствующей химической холерной вакцины для контроля экспрессии
основных иммуногенов холерного вибриона 0139 (КАГ. ЛПС, холерного
токсина (XT), нейраминидазы (НД), адгезинов) на зіапах масштабированного
культивирования. Оптимальным было бы внедрение с этой целью быстрых.
t. ., 1--
5 чувствительных, технически простых методов, таких как, например, дот-иммуноанализ (ДИА), с использованием гомологичных поли- и моноклональных антител, взамен недостаточно информативной и малочувствительной реакции двойной иммунодиффузии (РИД) [Ouchterlony, 1953].
Вышеизложенное определило цель и основные задачи настоящего исследования.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - иммунохимическая характеристика антигенной структуры капсульных и бескапсульных форм V cholerae 0139 серогруппы и разработка экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем для детекции возбудителя и выявления отдельных диагностически значимых и протективных антигенов с использованием поли- и моноклональных антител.
1. Получить высокоактивные поликлональные серовароспецифические антисыворотки и стабильные при различных вариантах культивирования и хранения гибридные клеточные линии, синтезирующие МКА к отдельным эпитопам КАГ и ЛПС капсульных и бескапсульных вариантов V cholerae 0139.
2 Изучить иммунохимические свойства и молекулярную организацию КАГ, ЛПС и термостабильных О-антигенов V cholerae 0139, используя поли- и моноклональные антитела, и выявить особенности экспрессии антигенных детерминантов у инкапсулированных и лишенных капсулы V. cholerae 0139, а также у холерных вибрионов других cepot рупп
-
Охарактеризовать иммунореактивность липида А V cholerae 0139 в зависимости от наличия или отсутствия капсулы у вибрионов гомологичной серогруппы, а также у некоторых других энтеропатогенных бактерий.
-
Изучить серологическое родство адгезина CFA/I Escherichia coli J53 с факторами адгезии холерного вибриона и ряда других возбудителей кишечных инфекций.
-
Разработать на основе полученных антител экспериментальные диагностические иммуноферментные поли- и моноклональные тест-системы для детекции V cholerae 0139.
-
Показать возможность использования и преимущества дот-иммуноанализа на основе гомологичных антител для контроля синтеза основных иммуногенов V cholerae 0139 (КАГ, ЛПС, холерного токсина, нейраминидазы, адгезина) на зіапе глубинного культивирования штаммов-продуцентов антигенов соответствующей холерной химической вакцины.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые создана клонотека гибридом, синтезирующих МКА к уникальным эпи топам КАГ и ЛПС V cholerae 0139, экспрессия которых различна в химически изолированных антигенах, нативных клетках вибрионов 01, 022 и 0139 сероірупп, в том числе у бескапсульных и
инкапсулированных форм V choierae 0139 Впервые с использованием панели поли- и моноклональных антител определена локализация и структура отдельных иммунореактивных компонентов КАГ и ЛПС V choierae Ol39 серовара. Впервые выявлены и охарактеризованы конкретные эпитопы гликопептидной природы, являющиеся общими для холерных вибрионов 01, 022 и OI39 ссрогрупп Новыми являются данные об иммунореактивности липидного компонента ЛПС, в том числе в зависимости от наличия или отсутствия бактериальной капсулы, и возможности использования липида А V choierae 0139 и антител к нему в качестве дополнительного таксономическою критерия в дифференциации возбудителей холеры Ol и не Ol серогрупп. Впервые в препаратах термостабильных О-аптигенов V choierae 01 и 0139 обнаружены локализованные на антигенах полипептидной природы кросс-реактивные эпитопы, возможно обусловливающие перекрестную реактивность получаемых к ним антисывороток. Новыми являются данные об особенностях иммунореактивности препаратов ЛПС V choierae 0139, выделенных различными методами. Экспериментально доказано наличие серологического родства адгезина CFA/I Е coll J53 и собственных адгезинов холерного вибриона и некоторых возбудителей кишечных инфекций Впервые с помощью МКА установлена способность ряда энтеропатогенных бактерий экспрессировать серологически идентичные эпитопы, предположительно ассоциированные со структурами адгезии и инвазии этих микроорганизмов.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ состоит в создании на основе разноэпитоппых МКА и полиююнальных антител к ЛПС V choierae 0139 экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции данного возбудителя холеры независимо от отсутствия или наличия у него капсулы. Разработана многокомпонентная система быстрого и эффективного контроля в ТИФА и ДИА продукции основных иммуногенов V choierae 0139 на этапе экспериментального и производственного масштабированного культивирования штаммов-продуцентов антигенов новой химической холерной вакцины По материалам диссертации составлены «Методические рекомендации по определению в дот-иммуноанализе содержания капсульного антигена и липополисахарида Vibrio choierae 0139 серовара на этапах экспериментального производства химической холерной вакцины» и «Методические рекомендации по определению адгезина CFA/I у рекомбинантных штаммов холерного вибриона в дот-иммуноанализе». одобренные ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протоколы № 5 от 20 июня 1997 і. и № 1 от 12 марта 1997 г., соответственно) и утвержденные директором института Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций по обшей иммунологии и лабораторной диагностике инфекционных болезней на курсах специализации врачей и биологов по особо
7 опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунолої ии и эпидемиологии при РосНИПЧИ «Микроб».
