Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные пробиотики в лечебной практике (обзор литературы) 8
Глава 2. Материалы и методы исследования 28
Глава 3. Жидкий консервант для бактерий сенной палочки... 44
Глава 4. Результаты изучения стабильности и биологических свойств препарата "споробактерин жидкий" в процессе хранения 59
Глава 5. Материалы изучения эффективности "споробактерина жидкого" при лечении дисбактериозов кишечника 76
Глава 6. Обсуждение результатов исследования 86
Выводы 99
Указатель литературы 101
- Современные пробиотики в лечебной практике (обзор литературы)
- Материалы и методы исследования
- Жидкий консервант для бактерий сенной палочки...
- Результаты изучения стабильности и биологических свойств препарата "споробактерин жидкий" в процессе хранения
- Материалы изучения эффективности "споробактерина жидкого" при лечении дисбактериозов кишечника
Введение к работе
Исследования современной биологической и медицинской науки в области взаимоотношений макро- и микроорганизмов позволили внедрить в практику биопрепараты - пробиотики. Основу этих препаратов составляют живые микробные культуры. Пробиотики широко стали использоваться в медицине и ветеринарии для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, нарушений обмена, после антибактериальной, лучевой, гормональной и химиотерапии в пред- и послеоперационном периодах и т.д. (Н.М. Грачева с соавт., 1994; Л.А.Литяева с соавт., 1994; П.И. Жданов, 1997; О.В. Бухарин, 1999; S.C.Kyriakis, V.K. Tsiloyiannis,1999 и др.).
В последние годы в медицинской практике различных стран применяются пробиотики на основе рода Bacillus (Н.М. Грачева с соавт., 1999; И.Б.Сорокулова с соавт., 2002; Н.И. Урсова, 2002; MR. Spinosa, Т. Braccini, 2000). Так, в странах Западной Европы широкое распространение получили пробиотики "бактисубтил" (фирма «Marion Merrell», Франция) и его аналог "флонивин" (фирма «Галеника», Югославия). В основе препарата - штамм В. cereus IP 5832 из коллекции Института Пастера (Париж). Известен также пробиотик "цереобиоген" («Xing Jian», Китай), действующее начало которого - штамм В. cereus DM-423. Основой препарата "энтерогермин" (фирма, «Sanofi Withrop», Италия) является культура B.subtilis. Пробиотик "биоспорин" (Украина, Россия) содержит два штамма бактерий рода Bacillus - В. subtilis 3 и В. licheniformis 3.
В.И. Никитенко с соавт. (1986) был создан препарат "споробактерин сухой" (лиофилизат в ампулах), содержащий штамм В. subtilis 534. Он с 1992 года рекомендован МЗ РФ для использования в клинической практике для терапии дисбактериозов, кишечных инфекций, профилактики и лечения хирургической инфекции. Препарат выпускал ГУП «Иммунопрепарат», находящееся в г. Уфе, однако с 1995 года предприятие прекратило его выпуск. Следует отметить, что «споробактерин сухой» хорошо зарекомендовал себя в медицинской практике, но лекарственная форма - лиофилизат в ампулах имеет ряд недостатков. Известно, что процесс лиофилизации негативно влияет на жизнеспособность бацилл, а высокая остаточная влажность также отражается на стабильности препарата.
Кроме того, данная форма препарата неудобна для больных. При вскрытии ампулы часто в препарат попадает стекло, тяжело разводить препарат перед употреблением водой, трудно его дозировать. Разведенный препарат должен быть сразу использован и не может храниться, и при назначении его маленьким детям значительная часть просто выбрасывается. Лиофильное высушивание снижает лечебно- профилактическую активность препарата и значительно удорожает производство. Вышеизложенные причины обусловили выполнение настоящей работы по созданию жидкой формы препарата споробактерина.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования является разработка новой лекарственной формы пробиотика "споробактерин жидкий" и определение ее бактериологической эффективности при лечении дисбактериозов кишечника.
Для реализации этой цели были решены следующие задачи:
Создание новой лекарственной формы пробиотика «споробактерин жидкий».
Изучено влияние консервантов-стабилизаторов на специфическую активность штамма Bacillus subtilis 534.
Изучена возможность контаминации препарата микроорганизмами различных видов.
Исследованы стабильность и биологические свойства препарата "споробактерин жидкий" в процессе хранения при различных температурах.
Исследована эффективность препарата "споробактерин жидкий" при лечении дисбактериозов кишечника.
Научная новизна.
Впервые создана новая форма лекарственного препарата "споробактерин жидкий", что подтверждается патентом Российской Федерации на изобретение № 2217154 (приоритет от 12.09.2001 г.). До настоящего времени лекарственного средства, позволяющего сохранять живые бактерии в жидкости два года и более, в мировой практике не было известно.
Установлено, что 7% раствор натрия хлорида обеспечивает сохранение жизнеспособности бактерий сенной палочки и их биологических лечебных свойств в процессе хранения при комнатной температуре в течение года и более, а при температуре до +10 С — не менее двух лет.
Препарат "споробактерин жидкий" сохраняет свою стабильность после неоднократного замораживания, герметичность упаковки флаконов при этом не нарушается. Это облегчает транспортировку данного биологического препарата.
Гипертонический раствор натрия хлорида и взвесь бактерий штамма Bacillus subtilis 534, составляющие основу "споробактерина жидкого", обладают бактерицидным действием по отношению к микроорганизмам различных видов, чем способствуют уменьшению вероятности возникновения контаминации готового препарата в процессах изготовления и хранения.
Разработаны методы контроля препарата «споробактерина жидкого» и технология его производства. "Споробактерин жидкий" оказывает выраженный лечебной эффект при дисбактериозах кишечника у взрослых и детей.
Научно-практическое значение.
Новая форма препарата "споробактерин жидкий" прошла государственные испытания. После них данное лекарственное средство рекомендовано для лечения дисбактериозов после перенесенных бактериальных инфекций или применения антибиотиков; острых бактериальных кишечных инфекций, в том числе острой дизентерии, сальмонеллезов; хирургической инфекции мягких тканей и остеомиелита; профилактики и лечения осложнений, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами при хирургических и акушерско-гинекологических операциях.
Материалы работы, использованы при разработке Фармокопейной статьи предприятия ФСП 42-0216-073 5-01 и Экспериментально-производственного регламента на "споробактерин жидкий". Организовано промышленное производство препарата. Лицензия Министерства здравоохранения Российской Федерации № 42/218/2002 от 11 апреля 2002 года выдана ООО "Бакорен" из города Оренбурга. В настоящее время "споробактерин жидкий" распространяется по лечебным учреждениям и через аптечную сеть на территории Российской Федерации.
Основные положени диссертации, выносимые на защиту:
Разработанная новая форма лекарственного препарата "споробактерин жидкий" во флаконах, представляющая собой взвесь биомассы живых бацилл Bacillus subtilis 534 в 7% растворе натрия хлорида, стабильна, устойчива к контаминации посторонними микроорганизмами, может храниться при температуре до +10 С не менее двух лет, переносит неоднократные замораживания без потери лечебных свойств.
Использование препарата "споробактерин жидкий" у взрослых и детей с дисбактериозами способствует нормализации качественного и количественного состава микрофлоры кишечника и дает возможность купировать диспепсические явления.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты исследований представлены и обсуждены на заседании проблемной комиссии по микробиологии Оренбургской государственной медицинской академии в 2004 году. Материалы диссертации доложены на III научно-практической конференции врачей Приволжско-Уральского военного округа (Оренбург, 2002) и на 5-ом Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2003».
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных научных работ и получен патент Российской Федерации на изобретение № 2217154 «Препарат споробактерин жидкий» (2003 г.).
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, выводов и указателя литературы, включающего 251 источник, в том числе работы 164 отечественных и 87 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 2 цветными фотографиями и 9 таблицами.
Исследования проводились в Оренбургской государственной медицинской академии (ректор - доктор медицинских наук, профессор С. А. Павловичев) и лаборатории ООО "Бакорен" (директор — В. Г. Никифоров). Работа выполнена в рамках темы открытого плана НИР ОГМА «Разработка новой формы препарата «споробактерин жидкий» и определение его эффективности при лечении дисбактериозов кишечника» (№ гос. регистрации - 01.200.2 02735).
Современные пробиотики в лечебной практике (обзор литературы)
Большое число полезных микроорганизмов, населяющих пищеварительный тракт, другие полости, кожу, слизистые и др., является важным фактором, обеспечивающим физиологическую деятельность организмов человека и животных (В. В. Поспелова с соавт., 1990; Б.А.Шендеров, 1998; О. В. Бухарин с соавт., 1999; С. Dunne, 2001).
Исключительно важную роль играют микроорганизмы в процессах пищеварения и обмена веществ. Они продуцируют большое количество ферментов: амилазы, диастазы, протеазы, липазы, целлюлазы и др., а также активируют действие ферментов кишечника. Выделяя уксусную, молочную, пропионовую, изовалериановую кислоты, бактерии задерживают размножение патогенной гнилостной и газообразующей микрофлоры, ликвидируют метеоризм, нормализуют моторную функцию кишечника (Е.А.Беюл, И.Б.Куваева, 1986; В.Н.Красноголовец, 1989; G. Evaldson and other, 1982; D. С. Savage, 1984; M. Knoke and other, 1989; S. M. Singer, T.E.Nash, 2000; J.A.Madden, J.O. Hunter, 2002). Микроорганизмы синтезируют незаменимые аминокислоты, витамины группы В, С, К, Д, Е, способствуют всасыванию и выведению ионов натрия, калия, кальция, железа, магния, меди, марганца, фосфора, хлора, воды, инактивации гистамина и др. Детоксицирующая способность нормальной микрофлоры кишечника по некоторым данным вполне сопоставима с детоксицирующей функцией печени (И. Н. Блохина, В. Г. Дорофейчук, 1979; Н. М. Грачева с соавт., 1999).
Особо важное значение индигенная микрофлора кишечника имеет в механизмах формирования иммунитета и других неспецифических реакций макроорганизма.. Она оказывает универсальные иммуномодулирующие эффекты, включая как иммуностимуляцию, так и иммуносупрессию, а также адьювантные, митогенные и иммуногенные действия (Е. А. Лыкова, 2000; L.Biancone and other, 2002; L. Prokesova, P. Mlckova, 2002).
В норме в просвете пищеварительного тракта на принципах синергизма и антагонизма сосуществует множество видов микроорганизмов (О.Н.Минушкин с соавт., 1999; G. L. Simon, S. L. Gorbach, 1986; J. Н. Yuisinst-Veid, 1991). На основании количественных показателей микрофлора толстого кишечника подразделяется на главную, в состав которой входит около 90-92% общего числа бактерий (бифидобактерии и бактероиды), сопутствующую (лактобациллы, эшерихии и др.) - около 8-10% от общего числа. Кроме этих аутохтонных (индигенных) бактерий в кишечнике обитают и представители остаточной и транзиторной флоры - как условно-патогенные бактерии (стафилококки, грибы, протей, цитробактер, энтеропатогенные эшерихии, клебсиеллы), так и сапрофиты (сенная палочка, микрококки и др.) - менее 1% от общего числа микроорганизмов (М.В.Панчишинна, С. В. Олейник, 1983; Б. В. Пинегин с соавт., 1984; А.З.Смолянская с соавт., 1984; П. А. Ленцнер, X. П. Ленцнер, 1988; M.J.Hopkins and other, 2001; Е. Malinen and other, 2002).
Материалы и методы исследования
Лабораторные микробиологические исследования выполнялись в Оренбургской государственной медицинской академии и лаборатории отдела бактериологического контроля ООО «Бакорен» (г. Оренбург) в 1997 - 2001 годах.
На первом этапе лабораторных микробиологических исследований нам было необходимо подобрать жидкую оптимальную среду для сохранения живых бактерий Bacillus subtilis 534 в течение года или более. Были приготовлены водные растворы глюкозы с концентрациями 5%, 10%, 20%, 40%, мочевины - 5%, 15%, 30%, лактозы - 5%, 10%, 20%, 40%, натрия хлорида - 0,5%, 0,9%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%. Они стерилизовались в стеклянных флаконах с ватно-марлевыми пробками при (128 ±1) С в течение (30 + 5) мин.
Бактерии штамма Bacillus subtilis 534 в течение 24 часов выращивались при температуре (37 + 1,0) С на пробирках со скошенным мясопептонным агаром. Микроорганизмы смывались приготовленными растворами. По оптическому стандарту мутности (20 ЕД), созданному в ГИСК им. Л.А.Тарасевича, готовились взвеси с содержанием бактерий 2 - 3 х 10 КОЕ/см (колониеобразующих единиц в одном см). С соблюдением асептики взвеси по 5 см3 разливались в стерильные стеклянные флаконы емкостью 10 см3. Флаконы закрывались стерильными резиновыми пробками и завальцовывались алюминиевыми колпачками. Образцы препарата хранили в картонных коробках при комнатной температуре, которая колебалась в диапазоне от 18 до 25 С.
Выживаемость определяли методом серийных разведений через сутки, десять суток, месяц путем подсчета количества жизнеспособных бактерий штамма Bacillus subtilis 534. В эти сроки исследовалось по 6 флаконов (всего 480 штук) с опытными образцами, содержащими различные концентрации избранных химических веществ.
Содержимое флакона тщательно взбалтывали. В стерильную пробирку вносили 0,5 см3 изучаемой взвеси и 4,5 см3 0,9%-ного раствора натрия хлорида (разведение 10"1). Далее из полученной микробной взвеси готовили ряд последовательных десятикратных разведений в (0,5 см3 микробной взвеси и 4,5 см3 0,9%-ного раствора натрия хлорида). Из разведений 10"6 и 10" высевали по 0,1 см микробной суспензии на четыре чашки Петри со средой Гаузе N2 (по 2 чашки на каждое разведение) и тщательно растирали шпателем по поверхности. После (18+4) ч инкубации при температуре (37+1) С производили подсчет выросших колоний и вычисляли содержание живых бактерий в одной дозе препарата. При подсчете учитывали чашки, на которых выросло не менее 15 колоний.
Жидкий консервант для бактерий сенной палочки...
Создание консерванта для сохранения стабильного количества живых клеток бактерий в течение длительного срока (года и более) является непростой задачей. Для жизнедеятельности микроорганизмов нужны питательные вещества. При их отсутствии бактерии, как правило, в течение относительно короткого промежутка времени гибнут. В то же время при наличии питательных веществ и повышении температуры на несколько градусов выше комнатной живые микроорганизмы начинают интенсивно размножаться.
В последние годы все более широкое распространение получают пробиотики в форме жидких биодобавок (Т. И. Корнилова с соавт., 2002; И. С. Хамагаева с соавт., 2002; М. Е. Sanders, J. Huis in"t Veld, 1999; E.J.Schiffrin, S. Blum, 2001 и др.). Они выпускаются в виде йогуртов, кефиров, других молочных продуктов, бальзамов, настоек и пр. Количество живых бактерий в биодобавках постоянно меняется как в процессе производства, так и при хранении. Содержание живых бактерий значительно ниже, чем указано на упаковке, и намного меньше доз микроорганизмов, эффективно используемых для лечения различных заболеваний (J. М. Hamilton-Miller and other, 1999). Для лекарственного препарата это недопустимо. В его составе содержание живых бактерий строго стабильный, регламентируемый и контролируемый параметр.
В Российской Федерации в настоящее время в качестве лекарства зарегистрирован только один пробиотик в жидкой форме - "биофлор" (Н.И. Урсова, 2002). Его состав достаточно сложен. Наряду с живыми бактериями кишечной палочки штамма М-17 "биофлор" содержит аутолизат кишечной палочки, экстракты мяты, свеклы, петрушки, укропа, чеснока, сои, прополис, макро-, микроэлементы и др. При этом срок егохранения - один год. Жидких форм лекарственных препаратов, содержащих сенную палочку, пригодных для использования в медицине, пока предложено не было.
Для экспериментов нами приготовлены стерильные водные растворы глюкозы с концентрациями 5%, 10%, 20%, 40%, мочевины - 5%, 15%, 30%, лактозы - 5%, 10%, 20%, 40%, натрия хлорида - 0,5%, 0,9%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%. Бактерии штамма Bacillus subtilis 534 в течение 24 часов выращивались при температуре (37 + 1,0) С на пробирках со скошенным мясопептонным агаром. Бактерии смывались приготовленными растворами. По оптическому стандарту мутности, созданному в ГИСК им. Л.А.Тарасевича, готовились взвеси с содержанием 2-3 х 109 КОЕ/см3 бактерий штамма В. subtilis 534. (2,0 + 1,0) миллиардов живых клеток в одном см3.
Результаты изучения стабильности и биологических свойств препарата "споробактерин жидкий" в процессе хранения
С целью изучения стабильности новой формы препарата "споробактерин жидкий" на предприятии "Бакорен" в г. Оренбурге в январе - марте 1998 года изготовлено десять экспериментально-производственных серий. Количество флаконов в каждой серии - 320 - 490 штук. В каждый флакон было расфасовано по (5,0 + 0,2) см3 препарата. В одном см3 "споробактерина жидкого" содержалось (2,0 ±1,0) миллиардов жизнеспособных клеток штамма Bacillus subtilis № 534. Готовый препарат (по 150 флаконов каждой серии) хранился в закрытых коробках из гофрированного картона при комнатной температуре, которая в условиях города Оренбурга варьировала от +18 до + 35 С. Еще по 150 флаконов каждой из десяти серий было помещено в картонных коробках в холодильники, где температура колебалась от 0 до + 10 С.
Сразу после изготовления, через 6, 12, 24 и 36 (только при хранении в холодильниках) месяцев флаконы отбирались для контроля из расчета по три образца каждой серии по каждому параметру. Определялись внешний вид препарата, герметичность флаконов, состояние упаковки, маркировки, вкус, запах, объем, рН, число бактерий в см , наличие контаминации посторонними бактериями и грибами, безвредность, антагонистическая активность к S. aureus «Никифоров», S. aureus «Филиппов», P. mirabilis 24а, Е. coli 157. Выявлялись возможность роста в аэробных условиях, подвижность бактерий, окраска по Граму, образование спор, внешний вид колоний, продукция каталазы и ферментация глюкозы, чувствительность к антибиотикам бензилпенициллину, тетрациклину и полимиксину. Полученные данные сравнивались с результатами контроля препарата "споробактерина сухого" (серия № 17, шесть ампул по каждому параметру), изготовленного в ГУП "Иммунопрепарат" в г. Уфе. Показатели качества препарата «споробактерина жидкого» во флаконах всех десяти серий после двух лет хранения при комнатной температуре в условиях города Оренбурга (+18 + 35 С) отражены в таблице 3.
В течение всего срока наблюдения в процессе хранения при комнатной температуре во всех контрольных флаконах содержалась мутная жидкость белесоватого цвета соленого вкуса со специфическим запахом мясопептонного агара. При отстаивании образовывался осадок белого цвета, который к 6 месяцам темнел и приобретал светло-бежевый оттенок. Почти во всех образцах осадок разбивался при встряхивании полностью, инородных включений в жидкости не обнаружено. Обращало на себя внимание, что при температуре близкой к 30 С в отдельных образцах образуются пленки бактерий сенной палочки белого или светло-бежевого цвета, которые практически не разбивались при встряхивании. Это отмечено в серии № 7 (по одному образцу после 6 и 24 месяцев хранения) ив серии № 9 (один образец после 6 месяцев, два образца -после 12 месяцев, один образец - после 24 месяцев хранения). При этом статистически достоверной тенденции уменьшения количества жизнеспособных бактерий сенной палочки после года хранения при комнатной температуре не отмечено (р 0,05). Через два года число сенной палочки в препарате снизилось с 2,44 + 0,12 млрд. в см3 сразу после изготовления до 1,89 + 0,15 млрд. в см3 (р 0,01). При этом оно оставалось в пределах заданного технического параметра, и было выше, чем его нижняя граница в один млрд. в см3.
Материалы изучения эффективности "споробактерина жидкого" при лечении дисбактериозов кишечника
Результаты лабораторных исследований, описанные в предыдущих главах, позволили составить отчеты об исследованиях, разработать опытно-производственный регламент, временную фармакопейную статью предприятия и др. После контроля производственных серий препарата «споробактерина жидкого» по приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации были проведены государственные испытания, которые закончились успешно. В результате ООО «Бакорен», находящемуся в г. Оренбурге, 11 апреля 2002 года выдана лицензия № 42/218/2002 на производство данного лекарственного средства. Это дало возможность проведения собственных клинических исследований.
Нами наблюдались 21 взрослый больной и 20 детей в возрасте от 1 одного до 15 лет. У 37 больных регистрировались умеренные нарушения функции желудочно-кишечного тракта: периодические боли в животе, жидкий стул, запоры, метеоризм и др. Из анамнеза было известно, что у 4 взрослых больных имелись явления пищевой и лекарственной аллергии, одна пациентка страдала бронхиальной астмой. У 11 детей отмечены проявления экссудативного диатеза или детской экземы. 29 человек ранее лечились различными живыми бактериальными препаратами: бифидумбактерином, колибактерином, бификолом, лактобактерином, бактисубтилом или фловинилом. Временное улучшение отмечалось только у 14 из них.
Для лечения дисбактериозов «споробактерин жидкий» назначался через рот взрослым и детям старше трех лет по одному см 2 раза в сутки, 12 детям в возрасте от одного года до трех лет - по 0,5 см два раза в сутки за 15-30 минут до еды. Больные по их усмотрению принимали препарат цельным или разбавляли его кипяченой водой. Курс лечения варьировал от 15 до 20 дней. Пациентам рекомендовалось соблюдение диеты, при аллергодерматозах на кожу наносился детский крем.
Оценка клинической эффективности и переносимости препарата осуществлялась путем систематических клинических осмотров, регистрации состояния функции желудочно-кишечного тракта и кожных покровов. Динамика клинических симптомов у взрослых больных с дисбактериозами при лечении «споробактерином жидким» представлена в таблице 6.
До начала лечения периодические боли в животе отмечали 12 из 21 взрослого пациента, метеоризм регистрировался у 13. После курса терапии «споробактерином жидким» боли исчезли у 8 и значительно уменьшились у 4 больных (р 0,01), вздутие живота и частое отхождение газов прекратились или стали меньше беспокоить у 12 человек (р 0,05). Только у одного наблюдаемого явления метеоризма не прекратились.
![Использование липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения раневой инфекции в эксперименте [Электронный ресурс]](/i/i/4326/211478.png "Использование липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения раневой инфекции в эксперименте [Электронный ресурс] Снатенков Евгений Александрович")
