Содержание к диссертации
Список сокращений 6
Введение 8
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Краткая характеристика Leptospira interrogans 13
Классификация и таксономия лептоспир 13
Морфология, культуральные и биохимические свойства 16
Молекулярно-генетические особенности лептоспир 18
Анализ секвенированных геномов лептоспир 18
Основные факторы патогенности и антигенные детерминанты лептоспир 21
1.2. Иммунопрофилактика лептоспирозов 32
1.2.Г. Традиционные противолептоспирозные вакцины 32
1.2.2. Разрабатываемые вакцины для профилактики лептоспиро
зов 33
1.3. Проблемы получения основных компонентов для разработки генно-
инженерных субъединичных вакцин (антигенов) и возможные пути их
решения 39
1.3.1. Проблемы гетерологичной экспрессии, выделения и очистки бел
ков . Аффинные домены в технологии создания химерных белков 39
1.3.2.Проблема формулирования инъекционных препаратов и повышения их иммуногенности. Использование аффинной иммобилизации ан-
тигеновна полисахаридных сорбентах 47
Использование 1,3-|3-глюкана в качестве иммуносорбента 50
Способы получения препарата частиц глюкана из.дрожжей
и его свойства 54
1.3.2.3: Глкжансвязывающие модули и их применение в качестве аф
финных доменов. 56
Глава 2. Материалы и методы 60<
2.1. Материалы 60
Бактериальные штаммы 60
Плазмидные векторы 60
Олигонуклеотиды 61
Ферменты 61
2:1.5. Сыворотки 6Г
Лабораторные животные 62
Растворы 62
Антибиотики 65
Питательные среды V V66<
2.1.10: Иммуномакс 66
2.1.11. Лабораторное оборудование 66
2.2. Методы 67
Культивирование лептоспир 67
Определение концентрации лептоспир в счетной камере Петрова-Хауссера 67
Выделение хромосомной ДНК лептоспир 68
Выделение и очистка аналитических количеств плазмидной ДНК.. 68
Выделение и очистка препаративных количеств плазмидной ДНК. 69
Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами 70
Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле 70
Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля 71
Лигирование фрагментов ДНК 71
2.2.10. Трансформация клеток Е. coli 71
Приготовление компетентных клеток 71
Электропорация 72
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 72
Определение нуклеотидной последовательности ДНК 72
Фракционирование белков методом электрофореза в полиакри-ламидном геле в денатурирующих условиях
(ПААГ-ДСН) и иммуноблоттинг 73
Выращивание штамма-продуцента Е. coli и индукция синтеза рекомбинантных белков 1 74
Анализ физико-химического состояния рекомбинантных белков.. 75
Выделение и очистка химерных белков, содержащих целлюло-зосвязывающий или 1,3-р-глюкансвязывающий домен, методом аффинной иммобилизации на полисахаридных сорбентах 75
Постановка непрямого иммуноферментного анализа 76
Иммунизация лабораторных животных 77
Иммунизация кроликов 77
Иммунизация крыс 77
Взятие крови и приготовление сывороток 77
Определение концентраций цитокинов в сыворотках крыс 78
Приготовление препарата частиц глюкана 79
Глава 3. Результаты исследований 80
3.1. Получение бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных
иммуноглобулиноподобных доменов белка LigA Leptospira interrogans.. 81
3.1.1. Создание экспрессионных конструкций, кодирующих отдельные
иммуноглобулиноподобные домены белка LigA 81
Получение ГЩР-фрагментов гена UgA, кодирующих иммуноглобулиноподобные домены 82
Клонирование ГЩР-фрагментов с помощью векторов pQE6 и pQE16 84
3.1.1.3. Создание штаммов-продуцентов рекомбинантных доменов LigA 86
3.1.2. Создание бактериальных штаммов-продуцентов химерных белков,
состоящих из рекомбинантных иммуноглобулиноподобных доменов
белка LigA и целлюлозосвязывающего домена (CBD) 87
Создание экспрессионных конструкций, содержащих мини-гены рекомбинантных доменов белка LigA с целлюлозосвязывающим доменом (CBD) 87
Создание штаммов-продуцентов химерных белков Dl-CBD, D4-CBD, D5-CBD, содержащих рекомбинантный иммуноглобулиноподоб-ный домен LigA с целлюлозосвязывающим доменом 89
3.2. Создание бактериальных штаммов-продуцентов химерных белков,
состоящих из рекомбинантных иммуноглобулиноподобных доменов
белка LigA и 1,3-Р-глюкансвязывающего домена (GBD) 91
3.2.1. Создание экспрессионной конструкции, кодирующей рекомби
нантный 1,3-(3-глюкансвязывающий домен (GBD) Clostridium
Ihermocelhim 91
Клонирование фрагмента гена НсА, кодирующего 1,3-J3-глюкансвязывающий домен (GBD) 91
Получение экспрессионной конструкции, кодирующей рекомбинантный 1,3-р-глюкансвязывающий домен (GBD) и глицин-сериновый спейсер 93
Создание экспрессионных конструкций, кодирующих химерные белки Dl-GBD, D4-GBD, D5-GBD, содержащие рекомбинантный имму-ноглобулиноподобный домен белка LigA и 1,3-Р-глюкансвязывающий домен (GBD) 95
Создание штаммов-продуцентов химерных белков Dl-GBD, D4-GBD, D5-GBD, содержащих рекомбинантный иммуноглобулиноподоб-ный домен LigA с 1,3-Р-глюкансвязывающим доменом 96
3.3. Выделение и очистка химерных белков с использованием полисаха-
ридных сорбентов 98
Выделение и очистка белка D5-CBD методом аффинной иммобилизации на аморфной целлюлозе 98
Выделение и очистка белка D5-GBD методом аффинной иммобилизации на 1,3-Р-глюкане 99
3.4. Изучение антигенных и иммуногенных свойств полученных препа
ратов 100
3.4.1. Анализ антигенных свойств рекомбинантных белков с набором
сывороток больных лептоспирозом людей 101
3.4.1.1. Исследование антигенной'структуры полученных рекомбинант
ных белков методом иммуноблоттинга с сыворотками боль
ных 101
3.4.1.2. Изучение антигенной специфичности рекомбинантного антигена
D5-CBD. Определение титров LigA-специфических антител в сыворот
ках больных с использованием рекомбинантных антигенов 102
3.4.2. Исследование антигенных и имуногенных свойств белков D5-
CBD, D5-GBD. Получение кроличьих антисывороток к рекомбинантным
антигенам D5-CBD, D5-GBD и комплексам Б5-СВВ-целлюлоза и D5-
GBD-глюкан 104
3.4.2.1. Иммунизация кроликов рекомбинантными антигенами D5-CBD
и D5-GBD и комплексами В5-СВБ-целлюлоза и D5-GBD-niiOKaH 104
3.4.2.2. Определение титров специфических антител в полученных кро
личьих сыворотках 104
3.4.3. Сравнительное исследование иммуногенных свойств препаратов в
эксперименте на крысах 105
3.4.3.1. Исследование сывороточных цитокинов крыс, синтезируемых
при иммунизации разработанными препаратами 107
3.4.3.1. Определение титров специфических антител в сыворотках им
мунизированных крыс 119
Глава 4. Обсуждение результатов 121
Выводы 129
Благодарности 130
Список использованной литературы 131
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
BSA- бычий сывороточный альбумин
CBD - целлюлозосвязывающий домен
СМА - карбоксиметиласпартат
dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат
EDTA (ЭДТА) - этилендиаминтетраацетат
EGTA — этиленгликоль тетраацетат
GBD - глюкансвязывающий домен
GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий
фактор
GST - глутатион-Б-трансфераза
HbsAg — поверхностный антиген вируса гепатита В
IFN - интерферон
IL - интерлейкин
IMAC - металл-хелатная хроматография (immobilized metal-ion affinity
chromatography)
IPTG (ИПТГ) -изопропил P-D-тиогалактопиранозид
Lig - иммуноглобулиноподобные белки лептоспир (Leptospiral
immunoglobulin-like proteins)
M - моль
mM - милли-моль
MBP - мальтозосвязывающий домен
OMP - белки наружной мембраны (outer membrane proteins)
NTA - нитрилотриуксусная кислота
р - плазмида
PMSF - фенилметилсульфонил фторид
ТАЕ - трис - ЭДТА - ацетатный буферный раствор
ТЕ - трис - ЭДТА буферный раствор
TLR — Толл-подобный рецептор (Toll-like receptor)
TNFa - фактор некроза опухоли
vWF - фактор фон Виллебранда
а.о. - аминокислотные остатки
БАСА - Байрам-Али слайд агглютинация
БФС - бромфеноловый синий
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН - додецилсульфат натрия
ДТТ -дитиотрейтол
ед. - единицы активности фермента
ИФА — иммуноферментный анализ
кДа - килодальтон
ЛПС - липолисахарид
нИФА - непрямой иммуноферментный анализ
об./мин. - обороты в минуту
ОП - оптическая плотность
ОПкрит - критическая оптическая плотность
п.н. - пары нуклеотидов
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР — полимеразная цепная реакция
РМА - реакция микроагглютинации
РНК - рибонуклеиновая кислота
РНКаза - рибонуклеаза
Трис - гидрооксиметиламинометан
Введение к работе
Актуальность проблемы. Лептоспирозы относятся к числу повсеместно распространенных природно-очаговых инфекций человека и животных. Действующие природные и антропургические очаги этого заболевания расположены во многих странах мира, включая Россию [24-26].
Для специфической профилактики лептоспирозов в России применяется цельноклеточная инактивированная вакцина, содержащая инактивированные формальдегидом культуры лептоспир четырех основных серогрупп, использование которой обеспечивает развитие напряженного серовароспецифического иммунитета длительностью не более 12 месяцев [29]. Инактивированные вакцины, как правило, характеризуются сравнительно высокой реактогенностью и риском возникновения различных поствакцинальных осложнений. Кроме того, существует ряд технологических проблем, связанных с использованием крупномасштабного культивирования микроорганизмов при производстве биопрепаратов. В экономически развитых странах (Западная Европа, США) инактивированные вакцины используют только в ветеринарии [24], вакцина для профилактики лептоспирозов человека отсутствует.
Одним из перспективных направлений в области совершенствования иммунопрофилактики инфекционных заболеваний является разработка подходов к созданию профилактических препаратов нового поколения. Особые надежды возлагаются на создание субъединичных генно-инженерных вакцин, содержащих протективные антигены возбудителей болезни. Субъединичные вакцины имеют ряд преимуществ, важнейшими из которых являются низкая реактоген-ность и возможность создания препарата, обеспечивающего перекрестный (се-роваронезависимый) иммунитет [35]. Вместе с тем, основные сложности при разработке субъединичных вакцин связаны с недостаточными сведениями о протективных антигенах лептоспир и механизмах развития иммунного ответа макроорганизма [88,150].
Основная роль в формировании невосприимчивости к лептоспирозу отводится гуморальному иммунному ответу. Среди антигенов лептоспир наибо-
лее хорошо изученным является ЛПС, однако характеристики иммунного ответа, вызываемого ЛПС, имеют существенные расхождения среди разных групп исследователей [127, 185]. Стратегии идентификации консервативных антигенов разных сероваров лептоспир сводятся, в основном, к изучению белков наружной мембраны (ОМР) [60, 85]. Важнейшим открытием среди ОМР стало обнаружение иммуноглобулиноподобных белков Lig (Leptospiral immunoglobulin-like), представляющих семейство нефимбрильных адгезинов лептоспир, что придало огромный импульс исследованиям, направленным на создание кандидатных субъединичных препаратов [124, 148]. В настоящее время спектр основных иммуногенных белков патогенных лептоспир окончательно не определен, однако исследователи сходятся во мнении, что из всех известных на сегодняшний день антигенов лептоспир наибольшим вакцинным потенциалом обладает белок LigA [77, 149].
Однако, на этапе получения рекомбинантных антигенов - основных компонентов для разработки субъединичных генно-инженерных препаратов, зачастую возникают различные сложности, связанные с гетерологичной экспрессией, выделением и очисткой рекомбинантных антигенов, а также формулированием инъекционных препаратов. Таким образом, разработка подхода, направленного на преодоление указанных сложностей экспрессии, очистки и повышения иммуногенности рекомбинантных антигенов лептоспир для получения компонентов кандидатных субъединичных препаратов, представляет самостоятельный научный и практический интерес.
Цель работы: разработка технологии получения рекомбинантных антигенов лептоспир и получение препаратов рекомбинантных антигенов, иммобилизованных на полисахаридных сорбентах, а также изучение антигенных и иммуногенных свойств полученных препаратов.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
1. Создать рекомбинантные плазмиды, кодирующие иммуноглобу-
линоподобные домены адгезина LigA Leptospira interrogans sensn
lato и получить штаммы-продуценты, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых белков.
Разработать методику выделения, очистки и формулирования препаратов рекомбинантных антигенов с использованием разных по-лисахаридных сорбентов.
Исследовать антигенные свойства полученных препаратов рекомбинантных белков.
Изучить иммуногенные свойства полученных препаратов рекомбинантных антигенов и их комплексов с полисахаридными сорбентами.
Научная новизна. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие химерные белки, которые содержат консервативный иммуноглобули-ноподобный домен Lig А, соединенный с целлюлозосвязывающим (CBD) либо 1,3-Р-глюкансвязывающим (GBD) доменом-. На основе полученных плазмид* впервые удалось создать эффективные штаммы-продуценты отдельных структурных модулей белка LigA в составе соответствующих химерных белков с высоким уровнем синтезам клетках Е. coli.
Разработана эффективная система выделения, очистки и формулирования препарата рекомбинантного антигена методом его аффинной иммобилизации на частицах 1,3-|3-глюкана дрожжей, позволяющая получать белково-полисахаридный комплекс, напоминающий по структуре и составу известный иммуностимулирующий препарат зимозан.
Впервые исследованы антигенные свойства рекомбинантных автономных иммуноглобулиноподобных доменов и подтверждено сохранение их антигенной конформации. Кроме того, обнаружена групповая специфичность этих антигенов при,исследовании с сыворотками больных лептоспирозами.
Проведено оригинальное сравнительное исследование иммуногенных свойств химерных белков, иммобилизованных на аморфной целлюлозе и частицах 1,3-Р-глюкана, в сравнении с иммунизацией живой культурой и инакти-
вированной противолептоспирозной вакциной. Изучена динамика синтеза ци-
токинов in vivo при введении разработанных препаратов и получены цитокино-вые профили иммунного ответа крыс, а также определены титры специфических антител к использованным в эксперименте антигенам.
Научно-практическая значимость работы. Предложенный подход, позволяющий получать иммуногенные композиции на основе рекомбинантных антигенов лептоспир и углеводных сорбентов, может быть использован для разработки аналогичных препаратов, содержащие рекомбинантные антигены других микроорганизмов.
Также проведены сравнительные исследования антигенных и иммуно-генных свойств полученных белково-полисахаридных комплексов и индивидуальных антигенов. Полученные охарактеризованные препараты, рекомбинантных антигенов лептоспир могут быть использованы при разработке новых субъединичных кандидатных препаратов для профилактики лептоспироза, а также при создании новых диагностических тест-систем на основе ИФА.
На созданные в данной работе рекомбинантные плазмиды и антигены, штаммы-продуценты рекомбинантных белков, а также способ их выделения и очистки оформлены Ъ заявкинаполучение патента.
Апробация работы. Результаты работы доложены, на третьей международной конференции «Фундаментальные науки- медицине» в г. Новосибирске 2-8 сентября 2007 г, на Международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» в г. Судак (Крым, Украина) 19-30 сентября 2008 г., на международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (секция Нано-технологии в медицине) (3-е место) в рамках Международного форума по на-нотехнологиям в г. Москве 3-5 декабря 2008 г., на конкурсе молодых ученых в рамках четвертого съезда Общества биотехнологов России в г. Пущино 17-19 октября 2006 г. (3-е место), на второй всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» в г. Рязани 29 мая - 1 июня 2007 г., на заседании Ученого Совета НИИЭМ
им. Н.Ф. Гамалеи РАМН в рамках научного доклада 24 апреля 2008 г., на седь-
мой молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» в ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН 4 апреля 2007 г.
Апробация диссертации состоялась 19 февраля 2009 г. на совместной научной конференции отделов генетики и молекулярной биологии бактерий, медицинской микробиологии, природноочаговых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ. По результатам работы оформлены 3 заявки на получение патента.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы, содержащий ссылки на 29 отечественных и 189 иностранных источников. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 30 рисунками.
