Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1.. Характеристика биологических свойств в. pertussis, требования к качеству производственных штаммов 22
1.1. Изменчивость антигенной структуры коклюшных бактерий 23
1.2 2. Факторы вирулентности коклюшных бактерий, их роль в формировании противококлюшного иммунитета 27
1.2.1. Адгезины 29
1.2.1.1. Филаментозный гемагглютинин 29
1.2.1.2. Агглютиногены (фимбрии) 31
1.2.1.3. Пертактин 34
1.2.2. Токсины 35
1.2.2.1. Коклюшный токсин 35
1.2.2.2. Аденилатциклаза 39
1.2.2.3. Эндотоксине, pertussis 40
1.2.2.4. Дермонекротический токсин 42
1.2.2.5. Трахеальный цитотоксин 43
ГЛАВА 2. Характеристика комбинированных вакцин, используемых для профилактики коклюшной инфекции собственные исследования
Глава 3. Материалы и методы 69
3.1. Материалы 69
3.2. Методы 74
ГЛАВА 4. Оценка информативности надзора за качеством производственных штаммов и посевных серий коклюшных бактерий 80
4.1. Характеристика производственных штаммов В. pertussis по иммунобиологическим свойствам 81
4.2. Оценка стабильности биологических свойств коклюшных бактерий производственных штаммов 97
4.3. Молекулярно-генетическая характеристика коклюшных бактерий производственных штаммов 106
4.3.1. Серотипирование 108
4.3.2. Исследование ДНК изучаемых штаммов с помощью электрофореза в пульсирующем поле
4.3.3. ПЦР фрагментов RD (regions of difference) 114
4.3.4. Секвенирование бактериальных генов, являющихся маркерами факторов
вирулентности коклюшного микроба 116
ГЛАВА 5. Система измерения и оценки иммуногенной активности и безопасности коклюшного компонента комбинированных вакцин 130
5.1. Национальные стандарты для измерения и оценки активности коклюшного компонента комбинированных вакцин 132
5.2. Разработка новой серии ОСО иммуногенной активности коклюшной вакцины 143
ГЛАВА 6. Надзор за качеством коклюшного компонента комбинированных вакцин и ее эффективность 150
6.1. Оценка роли агглютиногенов в поддержании иммуногенной активности коклюшной вакцины 152
6.2. Сравнительная оценка иммуногенной активности и остаточной токсичности коклюшного компонента отечественных и зарубежных комбинированных вакцин 164
6.3. Изучение стабильности иммуногенной активности коклюшного компонента комбинированных вакцин 174
6.4. Изучение в лабораторных исследованиях формирования иммунного ответа к основным протективным антигенам коклюшного микроба - коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину и пертактину после введения АКДС и Бубо-Кок вакцин 184
Глава 7. Оценка стабильности технологического процесса с помощью контрольных карт шухарта 192
Глава 8. Заключение 217
Выводы 243
Список использованной литературы
- Филаментозный гемагглютинин
- Оценка стабильности биологических свойств коклюшных бактерий производственных штаммов
- Разработка новой серии ОСО иммуногенной активности коклюшной вакцины
- Изучение в лабораторных исследованиях формирования иммунного ответа к основным протективным антигенам коклюшного микроба - коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину и пертактину после введения АКДС и Бубо-Кок вакцин
Филаментозный гемагглютинин
На первом этапе разработки коклюшной вакцины для специфической профилактики коклюша пристальное внимание обращали на причины и факторы, влияющие на биологические свойства коклюшных бактерий при культивировании их в лабораторных условиях. Выявлены различные варианты коклюшных бактерий как при их выращивании в лабораторных условиях, так и при выделении от больных. По характеру изменений дифференцировали несколько типов вариант: фазовую изменчивость (от I к IV фазе) [63, 232, 257], антигенную модуляцию (от Х-формы к С-форме) при изменении условий культивирования коклюшных бактерий: ионного состава среды, рН, температуры культивирования, количественного соотношения в среде компонентов, под воздействием никотиновой кислоты [37, 217, 284, 353, 378, 432, 433].
Фазовая изменчивость является необратимым процессом, приводящим к стойкой утрате факторов вирулентности и экспрессии протективных антигенов по мере перехода культуры от I к IV фазе, так как при этом типе изменчивости 24 наблюдаются стойкие генетические изменения [79, 232, 235, 242, 257, 321, 322, 378, 397]. Только культуры I фазы являются наиболее полноценными по содержанию в них антигенов, присущих этому микроорганизму [ 232, 235, 257, 397]. Культуры, находящиеся в IV фазе, были невирулентными [38].
Изменения в антигенном составе коклюшных бактерий, выращенных в лабораторных условиях, по мнению Р.Н. Lesley и A.D. Gardner, являются систематическими и постоянными [257]. A.F.B. Standfast пришёл к заключению, что наблюдаемые в лабораторных условиях изменения иммунобиологических свойств штаммов могут произойти в любой последовательности [397]. Основываясь на анализе дальнейших исследований, Р.Н. Lacey первым высказал гипотезу, согласно которой микроорганизмы рода Bordetella могут находиться в трех различных фенотипических модуляциях X, I и С в ответ на сигнал окружающей среды. Культуры С-формы могли отличаться от исходного штамма (Х-формы) по одному или нескольким признакам: типоспецифическому составу, количественному содержанию различных факторов вирулентности, иммуногенности, токсичности. Фенотипические изменения обратимы при культивировании на оптимальных питательных средах.
C.D. Parker выдвинул гипотезу «быстрой эволюции ин витро», согласно которой небольшое количество генов (4-10) регулирует рост микроорганизмов и определяет их биологические свойства [321, 322]. В условиях in vitro окружающая среда в процессе культивирования оказывает селективное влияние на мутацию этих генов или рецепторов генов. Поэтому деградированные штаммы представляют собой мутанты, которые претерпевают необратимые изменения при культивировании. Мутация может произойти в любой последовательности в любом гене в зависимости от присутствующих в среде ингибиторов роста. Эта гипотеза объясняла, в определенной мере, наблюдаемую вариабельность штаммов коклюшных бактерий при многократном пересеве в лабораторных условиях, и различия по отдельным признакам одних и тех же штаммов, находящихся в разных лабораториях. По-видимому, вариабельность штаммов коклюшных бактерий является приспособительным механизмом к сохранению вида при попадании в неблагоприятные условия и объясняется, как предполагал CD. Parker, особенностью физиологии коклюшных бактерий [322].
Полученные сведения позволили определить первые требования к отбору производственных штаммов В. pertussis: для изготовления коклюшной цельноклеточной вакцины следует отбирать штаммы, популяция бактерий которых по характеристике соответствует I фазе, и требования к производству коклюшной вакцины [444, 445]. Широкое применение цельноклеточной коклюшной вакцины, изготовленной с учетом разработанных требований, позволило существенно снизить заболеваемость коклюшем и уменьшить частоту развития летальных исходов. В некоторых развитых странах заболеваемость снизилась до спорадических случаев [23, 133, 219,336].
В период массовой иммунопрофилактики детей против коклюша исследователи стали наблюдать изменение серотипов и генотипов коклюшных бактерий, циркулирующих среди населения. Ряд исследователей полагал, что смена серотипа циркулирующего возбудителя коклюша произошла под влияние вакцинации или инфекции [18, 103, 108, 338, 340, 342, 346, 396]. По мнению N.W. Preston, смена серотипа циркулирующих штаммов могла произойти из-за несоответствия штаммов коклюшных бактерий, входящих в состав коклюшных вакцин, циркулирующим, а также из-за потери отдельных агглютиногенов производственными штаммами при изготовлении вакцин [338, 339, 342, 343]. Высказанная N.W. Preston гипотеза о возможной роли серотипов в противококлюшном иммунитете была поддержана рядом исследователей [16, 122, 457], а рабочая группа ВОЗ рекомендовала внести в международные Требования к коклюшной вакцине положение об обеспечении в коклюшной вакцине содержания серотиповых антигенов - агглютиногенов 1, 2 и 3 [446, 447].
Молекулярно - генетические исследования последних десятилетий выя-вили, что за изменчивость, обусловленную изменениями условий окружаю-щей среды, у микроорганизмов рода Bordetella отвечает генетический локус bvgAS. Экспрессия bvgAS локуса может быть активирована при выращивании культур при температуре 37 С и относительном недостатке MgS04 или никотиновой 27 кислоты [284, 285]. Bordetella, выращенные в этих условиях, принято называть bvg+ фазо-специфическими бактериями, что соответствует Х-форме по Lacey. Мутационный анализ системы bvgAS способствовал разработке ряда подходов для изучения структуры вирулентного регулона и роли bvg-зависимого проведения внутриклеточного сигнала in vivo. Были обнаружены мутации по принципу изменения структуры или по принципу полного уничтожения (делеции) проведения сигнала. Такие bvg-фазовые варианты соответствуют С-форме по Lacey. Бактерии В. pertussis, находящиеся в bvg-фазе, характеризуются экспрессией ряда белков наружной мембраны с неизвестной функцией [180]. Специально проведенные исследования показали, что bvg+ фаза является необходимой и достаточной для колонизации респираторного тракта В. pertussis и В. bronchiseptica [141, 270]. Эти исследования также показали, что bvg- фаза В. bronchiseptica была необходима и достаточна для выживания бактерий в условиях выращивании на средах со сниженной концентрацией питательных веществ, что свидетельствует о существовании резервуара такого рода бактерий в окружающей среде [141]. Для В. pertussis и В. parapertussis, которые более требовательны к условиям выращивания, такой резервуар менее возможен. Промежуточная фаза bvgi, соответствующая фазе I Lacey [178], является «консервативным» состоянием, общим для В. pertussis и В. bronchiseptica, может играть роль в процессе респираторной трансмиссии этих культур [173]. Система BvgAS контролирует целый спектр фенотипических фаз роста в ответ на изменения условий окружающей среды [142, 150, 151, 401]. С филогенетической позиции Bvg-регуляторные гены составляют две категории: некоторые локусы экспрессированы у В. pertussis, В. parapertussis (hu, ov) и В. bronchiseptica, продукты этих локусов очень сходны и зачастую взаимозаменяемы между различными подвидами Bordetella. Другие генетические локусы, присутствующие в геномах подвидов Bordetella, экспрессированы индивидуально.
Оценка стабильности биологических свойств коклюшных бактерий производственных штаммов
При изучении колоний выявлено, что наряду с характерными мелкими полупрозрачными колониями, клетки которых содержали более высокий уровень агглютиногенов, встречались колонии среднего и крупного размера матового цвета, в которых агглютиногены выявлялись на более низком уровне или в некоторых из них отдельные агглютиногены вообще не выявлялись. Возможно, это было обусловлено мутацией штаммов при культивировании на лабораторных питательных средах и/или следствием лиофильного высушивания культур, часть клеток которых оказалась дефектной из-за несбалансированного роста микроорганизмов.
Для синхронизации роста клеток было апробировано и впоследствии рекомендовано: засеянную культуру, перед помещением в термостат для культивирования, на 6-8 ч помещать в горизонтальном положении в холодильник при температуре (5±3) С. При таких условиях выросшие колонии большинства штаммов морфологически были более однородны. Эта рекомендация была включена в «Инструкцию по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий», МУК 4.2.2317-08 и регламенты производства коклюшной вакцины. По-видимому, в период выдерживания засеянных культур при более низкой температуре происходила гибель дефектных и стабилизация выживших клеток. Был проведен скрининг выросшей популяции культур разных штаммов с разным сроком лиофильной сушки для оценки ее однородности и содержания агглютиногенов в популяции одной колонии. Исследования продемонстрировали, что в зависимости от срока хранения штаммов, у разных штаммов наблюдалось снижение уровня агглютиногенов в разной степени. Наиболее однородной оказалась популяция культуры В. pertussis 18323. Этот штамм характеризуется стабильными вирулентными свойствами и предназначен только в качестве тест-культуры при испытании иммуногеннои активности коклюшной суспензии и коклюшного компонента комплексных вакцин. Следует отметить, что при исследовании количественного содержания агглютиногенов в разное время использовали разные серии адсорбированных сывороток и методы исследования: реакцию агглютинацию на стекле и/или развёрнутую реакцию агглютинации. Последнюю проводили макро- или микрометодом. Тем не менее во всех случаях проявлялась закономерность полученных результатов.
Полученные нами данные согласуются с данными J. Cameron (107), T.N. Standbridge, N.W. Preston (396), свидетельствующими, что лабораторные штаммы при культивировании на разных питательных средах могут формировать различные по морфологии колонии. При этом культуры из разных колоний отличались по типоспецифическому составу от исходных штаммов. Посредством последовательного пересева одиночных колоний можно было получить культуру со сниженным количественным содержанием отдельных агглютиногенов или полной их утратой. И, наоборот, при пересеве на оптимальные среды культуры могли последовательно восстановить утраченные агглютиногены (102,103,108, 345, 396).
Изменчивость штаммов коклюшных бактерий при культивировании в лабораторных или производственных условиях отмечалась многими исследователями. P. Novotny, К. Cownley (316) при изучении влияния условий культивировании В. pertussis на формирование структуры и стабильности наружной мембраны показали, что количественные и качественные соотношения компонентов, в том числе агглютиногенов, в ней во многом определяются физиологическим состоянием клетки коклюшного микроба.
Сбалансированный рост коклюшных бактерий наблюдался только после внутренней стабилизации клеток, когда происходило «распределение энергии и вещества среди всех синтезируемых компонентов», и при температуре роста (36±0,5) С на оптимальных питательных средах. Выросшие в этих условиях клетки имели высокое содержание агглютиногенов, гладкую поверхность слоев при просмотре в электронном микроскопе тонких срезов и стабильную защитную активность в процессе изготовления вакцины и при ее хранении. Изменение оптимальных условий культивирования коклюшных бактерий (изменение состава 96 среды, степени аэрации, температуры, времени выращивания и др.) приводило к несбалансированному росту клеток. При этом наблюдали снижение или потерю агглютиногенов и появление сморщивания поверхностных слоев при просмотре тонких срезов. Защитная активность суспензии таких клеток уменьшалась. При оптимальных условиях роста происходило восстановление этих свойств. При этом агглютиногены всегда восстанавливались в последовательности 1 — 2 — 3 и всегда утрачивались в обратной последовательности. Восстановление агглютиногена 3 всегда совпадало с увеличением уровня защитной активности. Исследователи пришли к выводу, что агглютиногены являются важным компонентом в вакцине, так как их высокое содержание в клетке, особенно агглютиногена 3, свидетельствует о формировании более сложной, стабильной, сбалансированной структуры наружной мембраны и высокого стабильного уровня защитной активности. Вакцины из таких микроорганизмов обладали более низкой токсичностью в тесте изменения массы тела мышей (316).
Следовательно, количественное содержание агглютиногенов 1, 2 и 3 может рассматриваться как признак качества коклюшной вакцины. Снижение количественного содержания или утрата специфических агглютиногенов 1, 2 и 3 в коклюшной вакцине, является тревожным признаком и требует внимательного исследования и оценки качественных показателей коклюшной вакцины.
Таким образом, разработка отечественных, сначала лабораторных, а затем и промышленных серий адсорбированных сывороток к агглютиногенам 1, 2 и 3 и применение их для контроля антигенной структуры производственных штаммов и посевных серий позволили установить, что одни и те же штаммы при высушивании и использовании в производстве могли иногда существенно различаться по количественному содержанию в популяции культуры коклюшных бактерий агглютиногенов 1, 2 и 3. Проведенный анализ показал, что популяция коклюшных бактерий, выращенных в лабораторных условиях, не однородна по типоспецифическому составу. В процессе хранения штаммов в лиофили-зированом состоянии, независимо от срока их хранения, культура коклюшных бактерий, включая тест-штамм 18323, становится более гетерогенной, в клетках коклюшных бактерий снижается уровень агглютиногенов, что отражается на показателях иммунобиологических свойств производственных штаммов.
С целью снижения отрицательного влияния гетерогенности культуры на качество коклюшной вакцины и, тем самым, повышения её иммуногенной активности нами, при изготовлении посевной серии, был предложен отбор колоний не только по морфологическим характеристикам, но и по способности микробных клеток экспрессировать агглютиногены. Целенаправленный отбор морфологически однородных типичных колоний (не менее 10-ти) с высокой способностью экспрессировать агглютиногены позволяет получать более однородную посевную серию с лучшей характеристикой экспрессии коклюшными бактериями агглютиногенов 1, 2, 3. Если однократного отбора было недостаточно для получения популяции штамма, экспрессирующей высокий уровень АГГ, присущих штамму, то процедуру повторяют (табл.9). В таблице приведены, в качестве примера, результаты отдельных исследований по селекции посевной серии штаммов
Разработка новой серии ОСО иммуногенной активности коклюшной вакцины
Содержание АГГЗ стало выявляться типоспецифической сывороткой в разведении 1:5600 (lg 3,75). Коклюшные вакцины по количественному содержанию агглютиногенов не отличались от посевных серий, используемых для их изготовления, что свидетельствовало о стабильности технологического процесса. Увеличение содержания агглютиногенов 1, 2 и 3 в коклюшной вакцине повлекло за собой повышение иммуногенной активности. Среднегеометрическое значение активности вакцины составило 11,7 МЕ/мл. Последующая селекционная работа с культурами производственных штаммов и использование на производстве отобранных колоний для получения биомассы коклюшной вакцины, по данным за 2010 г., способствовала дальнейшему повышению уровня экспрессируемых агглютиногенов. Титр сыворотки, выявляющей АГГ1 составил 6400 (lg 3,8), АГГ2 - 2000 (lg 3,3), АГГЗ - 5000 (lg 3,7). Среднее значение показателя иммуногенной активности вакцины стало составлять более 16 МЕ/мл.
Несколько иная картина наблюдалась на филиале «НПО «Микроген» в г. Уфа. На рисунке 10 представлены схемы, построенные по Сводным протоколам коклюшной вакцины, представленным филиалом за 2000 г., 2005 г. и 2009-2010 гг. В 2000 г. для производства коклюшной вакцины использовали производственные штаммы 38, 262, 305, 312, 475, 703. Для изготовления вакцины использовали посевные серии, приготовленные на предприятии. На представленной схеме видно, что в 2000 г. содержание агглютиногенов в посевной серии и коклюшной вакцине практически во всех сравниваемых парах было различным (разная высота столбцов в одной паре). Наименее выраженные различия в парах и наибольший уровень (1:1280 - lg 3,11) отмечался при определении содержания агглютиногена 1. Количественное содержание агглютиногенов 2 и 3 как в посевных сериях, так и приготовленной из них вакцине, было значительно ниже. Невысокий уровень содержания агглютиногенов сказался на иммуногенной активности, значения которой в основном колебались около нижнего допустимого лимита - 8 МЕ/мл. Разное содержание агглютиногенов в посевной серии и вакцине указывает на нестабильность технологического процесса. Результаты проведенного анализа причины вариабельности количественного содержания агглютиногенов и иммуногенной активности коклюшной вакцины показали, что это было связано с качеством питательных сред, используемых для поддержания посевных серий штаммов (среда КУА с кровью вместо среды Борде-Жангу). При анализе однородности популяции посевных серий производственных штаммов, высушенных в разные время на предприятии НПО «Иммунопрепарат», была выявлена неоднородность колоний в разной степени и количественного содержания в них агглютиногенов 1, 2 и 3. На предприятие нами была выслана стандартная операционная процедура (СОП), в которой подробно была описана методика отбора отдельных колоний по признаку экспрессии в процессе подготовки штаммов к высушиванию и пересевах культуры (отбор колоний 1-го пассажа) в производственных условиях. Кроме того, ГИСК им. Л.А. Тарасевича направил на предприятие посевные серии В. pertussis, прошедшие селекцию и содержащие более высокий уровень агглютиногенов. В результате проведенной на предприятии работы по устранению выявленных нарушений при изготовлении коклюшной вакцины, исследования иммунобиологических свойств посевных серий производственных штаммов (морфологических, серотиповых и иммуногенных) были выбраны для производства вакцины штаммы 38, 267, 395, 312, 476, и исключены штаммы 262 и 703.
Использование на производстве посевных серий новой сушки, повышение качества среды КУА отразилось на количественном соотношении агглютиногенов в KB и показателе иммуногенной активности в АКДС вакцинах. Возможно, СОП также сыграла положительную роль при работе с производственными штаммами и посевными сериями. В 2005 г. значительно увеличен уровень агглютиногенов как в посевных сериях, так и в коклюшной вакцине. Содержание агглютиногенов 1 и 3 достигло и превысило уровень, который выявляется типоспецифической сывороткой в разведении 1:1280 (lg 3,11). Содержание агглютиногена 2 в 2- случаях из 6 не достигало указанного уровня. Следует отметить, что количественное содержание агглютиногенов в коклюшной вакцине выше по сравнению с посевными культурами. Это хороший признак улучшения качества среды КУА: для измерения агглютиногенов используется культура 2-3 пассажа, в коклюшной вакцине - обезвреженная биомасса 5-7 пассажа. Общее увеличение уровня агглютиногенов в КС сопровождалось повышением иммуногенной активности. Показатели активности коклюшной вакцины составляли от 9,6 до 12,2 МЕ/мл.
Положительная тенденция улучшения качества коклюшной вакцины видна на рисунке за 2009-2010 гг. Как видно из представленных данных все серии коклюшных суспензий содержали присущие каждому производственному штамму агглютиногены в титре не ниже 1280, показатели иммуногенной активности держались на высоких значениях и колебались около 10 МЕ/мл.
В 2002 г. производство коклюшного компонента после длительного перерыва возобновлено на филиале «Пермское НПО «Биомед» ФГУП «НПО «Микроген». Для изготовления коклюшной вакцины были использованы посевные серии В. pertussis 39, 267, 305 и 475 из коллекции предприятия (рис. 11). Все используемые штаммы коклюшных бактерий содержали низкий уровень агглютиногенов. Показатели иммуногенной активности посевных серий, определяемые по выживаемости, колебались в широких пределах. Хотя в коклюшной вакцине уровень агглютиногенов 1, 2 и 3 был выше их показателей у отдельных штаммов, они не достигали нижнего необходимого уровня - 1:1280. Показатели иммуногенной ак тивности, как и ожидалось, находились на уровне нижнего регламентированного лимита: 8,6-8,9 МЕ/мл. Это могло быть связано как с гетерогенностью популяции использованных посевных серий, что подтвердилось при их исследовании в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, так и с недостаточно стандартными по качеству используемых на предприятии питательных сред БЖ и КУА. На предприятие были высланы посевные серии из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича, содержащие высокий уровень агглютиногенов 1, 2 и 3, использование которых исправило неудовлетворительную ситуацию изготовления коклюшной вакцины. Иммуноген ная активность коклюшного компонента в АКДС вакцине, изготовляемого в 2005 г., существенно повысилась и стала составлять 10-12,5 МЕ/мл (рис. 12). Увеличение активности коклюшной вакцины было связано со значительным увеличением содержания агглютиногенов в посевной серии и вакцине, полученной из неё. Содержание агглютиногенов 1 и 3 в 4-х группах из 6 превышало показатель 1:1280. Повысилось и содержание агглютиногена 2, но не так выраженно: он определялся типоспецифической сывороткой в разведении 1:600 (lg 2,78) и 1:900 (lg 2,95). Согласно Сводным протоколам ситуация на «Пермском НПО «Биомед» вновь ухудшилась в 2009-2010 гг., о чем свидетельствуют показатели содержания агглютиногенов в посевных сериях и вакцинах, изготовленных из них. В 2009-2010 гг. для изготовления вакцины использовали штаммы 39, 267, 305 и 475 в двух комбинациях: 39, 267, 305 и 267, 305, 475. Две группы отличались между собой только по штаммам с серотипом 1, 2 и 3 (штамм 39 использовали в первой, а 475 - во второй группе). Как видно из рисунка 13 по содержанию АГГ1 первые пары в двух
Изучение в лабораторных исследованиях формирования иммунного ответа к основным протективным антигенам коклюшного микроба - коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину и пертактину после введения АКДС и Бубо-Кок вакцин
Изготовление МИБП - сложный технологический процесс, зависящий от многих факторов: производственных штаммов, качества и стандартности используемых питательных сред, реактивов и реагентов, стандартности технологических процессов, профессиональной подготовки и обученности сотрудников, точности выполнения ими технологических процедур и т.д.
В настоящее время при производстве коклюшной вакцины правильное выполнение этапов технологического процесса оценивают по результатам внутрипроизводственного контроля показателей качества полуфабриката, проведенного в соответствии с основными критическими точками в соответствующих регламентах производства. Неблагополучное состояние технологического процесса часто проявляет себя только в критических случаях, когда качественные показатели полуфабриката не соответствуют заложенным требованиям. Неблагополучие может проявиться, когда препарат уже приготовлен. Карты Шухарта являются тем инструментом, который позволяет в реальном времени своевременно выявлять факторы, влияющие на качество препарата, их ликвидировать и тем самым создавать условия для изготовления качественной продукции. Использование карт Шухарта приводит к значительной экономии средств, поскольку карты позволяют ликвидировать причины сбоя производства сразу, по мере их возникновения, не доводя производство до полного изготовления препарата
Информативность статистических методов исследования стабильности технологического процесса производства коклюшного компонента нами была оценена по материалам Сводных протоколов предприятия ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова и филиала ФГУП «НПО «Микроген» в г. Уфа. Предприятия для изготовления вакцины использовали штаммы, ежегодно рассылаемые специализированной лабораторией ГИСК им. Л.А. Тарасевича; производство коклюшного компонента осуществляли по единому технологическому процессу. Как было установлено, технологический процесс не всегда проходил стабильно. Мы предположили, что на вариабельность показателя иммуногенной активности могло оказать влияние различие штаммов по количественному содержанию агглютиногенов 1, 2 и 3. Однако, после целенаправленной селекции этих штаммов по количественному содержанию в популяции микробных клеток агглютиногенов 1, 2 и 3 иммуногенная активность коклюшного компонента повысилась, но вариабельность (величина размаха) данного показателя не была уменьшена. По-видимому, это связано с другими причинами, главными из которых является качество питательных сред и используемых лабораторных животных и их чувствительность.
Из двух сравниваемых предприятий на уфимском ФГУП «НПО «Микроген» ситуация была более критичной: за 7 лет технологический процесс производства коклюшного компонента проходил стабильно и стандартно только в течение одного года. Это означало, что в определенный период времени возрастал риск возникновения внутрипроизводственного брака. Об этом свидетельствовали появление трендов на R- и Х-картах; большой процент серий, расположенных ниже средней величины иммуногенной активности, которая колебалась в разные годы от 9,6 до 10,9 МЕ/мл; значения показателей активности многих серий приближались к нижнему лимиту (8,0 МЕ/мл). Единичные показатели колебались в достаточно широких пределах: от 8,0 до 16,2 МЕ/мл: количество серий с активностью коклюшного компонента от 8,0 до 9,9 МЕ/мл составляло 50,4 %, с активностью более 10,0 МЕ/мл - 49,6 %.
В процессе инспекционных обследований, проводимых в этот период времени, было установлено, что на уфимском предприятии на некоторых участках технологического процесса произошла смена персонала, была проблема с поставкой необходимых диализных мешков с определенным размером пор, используемых при приготовлении диализата дрожжей (среда КУА); проблема с качеством используемых лабораторных животных и их чувствительностью.
Карты Шухарта предназначены для контроля за стабильностью течения технологического процесса в реальном времени. Если бы на предприятиях в период 2002 - 2008 гг. использовали статистические методы анализа, то все возникающие проблемы на производстве могли бы быть вовремя выявлены и решены. В этом случае предприятия не находились бы в состоянии нестабильного производства.
Общепринятая схема производства какой-либо продукции - это ее изготовление и проведение контроля качества. Результатом является выявление бракованной продукции. Такой подход не экономичен и вызывает материальные потери, т.к. он основан на проверке уже созданной бракованной продукции. Использование в технологическом процессе статистических методов управления позволяет предупредить потери. Это достигается сбором информации о самих технологических процессах, ее анализе и своевременным действиям по отношению к выявленным изменениям и нарушениям, а не к продукции.
Использование на производстве контрольных карт Шухарта позволит реализовать выполнение главной задачи статистического управления процессами - обеспечение стабильности в технологической цепи, что может гарантировать выпуск продукции, соответствующей установленным требованиям.
Использование на предприятиях органами обеспечения качества (ООК) контрольных карт Шухарта и проведение с их помощью постоянного наблюдения за технологическим процессом даст возможность ООК выявлять отклонения в технологическом процессе от стабильного состояния и своевременно ликвидировать особые причины, что позволит предотвратить их накопление и влияние на качество препарата.
В связи с этим ООК предприятия целесообразно для оценки состояния технологического процесса, своевременного выявления признаков отклонений в нем и предотвращения внутреннего брака МИБП взять на вооружение применение контрольных карт Шухарта и методов статистического управления технологическими процессами. Использование эффективного метода статистического управления производством даст возможность стабилизировать производство АКДС вакцины и понизить внутрипроизводственные потери.
Материалы проведенного сравнительного анализа послужили основой для разработки Методических рекомендаций «Оценка стабильности технологического процесса производства медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) с помощью контрольных карт Шухарта» (41). Методические рекомендации были разосланы по всем предприятиям, выпускающим продукцию МИБП.
