Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1. Краткая характеристика F. tularensis 10
1.1. Распространение и эпидемиология 10
1.2. Биологические свойства 12
1.2.1. Классификация рода Franclsolla 12
1.2.2. Морфология и культуральные свойства 13
1.2.3. Биохимические свойства 15
1.2.4. Основные факторы патогенное 15
1.2.5. Основные антигенные детерминанты F. tularensis 16
2. Профилактика туляремии 20
2.1. Живые вакцины 2 0
2.2. Инактивированные вакцины 23
2.3. Рекомбинантные живые вакцины 25
2.4. ДНК вакцины 26
2.5. Субъединичные генно-инженерные вакцины 27
3. Использование технологии химерных белков для создания субъединичных генно-инженерных вакцин 29
3.1. Целлюлозосвязывающий домен 33
3.2. Применение целлюлозы как иммуносорбента 35
CLASS 2. Материалы и методы 3 CLASS 7
1. Материалы 37
1.1. Бактериальные штаммы 3 7
1.2. Плазмидные векторы 37
1.3. Олигонуклеотиды 37
1.4. Ферменты и другие реактивы 38
1.5. Лабораторные животные 38
2.1. Выделение хромосомной ДНК 38
2.2. Выделение и очистка аналитических количеств плазмиднои ДНК 39
2.3. Вьщеление и очистка препаративных количеств плазмиднои ДНК 4 0
2.4. Гидролиз ДНК специфическими зндонуклеазами 41
2.5. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле 41
2.6. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля 42
2.7. Лигирование фрагментов ДНК 42
2.8. Трансформация клеток Е. coll 42
2.8.1. Подготовка компетентных клеток 42
2.8.2. Электропорация 43
2.9. Полимеразная цепная реакция 43
2.10. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 44
2.11. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE - SDS) 44
2.12. Выращивание штамма-продуцента и индукция синтеза рекомбинантных белков 45
2.13. Определение локализации белков в лизатах штамма-продуцента 46
2.14. Иммобилизация и выделение белков, содержащих целлюлозосвязывающий домен 46
2.15. Иммунизация лабороторных животных 47
2.16. Иммуноблоттинг 47
3. Результаты и обсуждение 48
1. Создание бактериальных штаммов-продуцентов белка TUL4 из Г. tularensis 48
1.1. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию и секрецию белка TUL4 в периплазму клеток Е. coli 49
1.1.1. Клонирование гена белка TUL4 51
1.1.1.1. Получение ПЦР фрагментов гена белка TUL4 51
1.1.1.2. Клонирование гена белка TUL4 в векторе pGEM-T 58
1.1.1.3. Секвенированиє нуклеотидных последовательностей гена белка TUL4 59
1.1.2. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка TUL4 62
1.1.3. Создание бактериальных продуцентов белка TUL4 64
1.2. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию белка TUL4 в цитоплазме клеток Е. coli 65
1.2.1. Создание экспрессионного вектора, содержащего ген зрелого белка TUL4 65
1.2.2. Создание бактериального продуцента гена зрелого белка TUL4 67
1.3. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию химерного белка TUL4-CBD в цитоплазме клеток Е. coli 68
1.3.1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка TUL4 в составе химерной конструкции с целлюлозосвязывающим доменом. 68
1.3.2. Создание бактериальных продуцентов генов белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD 72
2. Оптимизация экспрессии химерных белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD 73
2.1. Оптимизация времени индукции 73
2.2. Оптимизация индукции с помощью плазмиды pACYC-RIL 74
2.3. Индукция белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD в различных штаммах Е. coli 76
3. Изучение локализации химерных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD в лизатах штамма Е. coli DH5a 78
4. Выделение и очистка белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD 79
4.1. Изучение связывания химерных белков CBD-sp-TUL4 и TU"L4-sp-CBD с различными видами целлюлозы 79
4.2. Выделение и очистка химерных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-SP-CBD 80
5. Определение антигенных свойств белка TUL4-sp-CBD 83
5.1. Получение кроличьих антисывороток к комплексу тиіі4-р-СВ0-целлюлоза 83
5.2. Исследование антигенных свойств 83
Выводы 86
- Профилактика туляремии
- Использование технологии химерных белков для создания субъединичных генно-инженерных вакцин
- Выделение хромосомной ДНК
- Оптимизация экспрессии химерных белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD
Введение к работе
Актуальность проблемы. Туляремия является актуальной проблемой для здравоохранения в связи с широким распространением природных очагов в странах умеренного климатического пояса, а также возможной ролью возбудителя в качестве потенциального агента биотерроризма [16, 17, 110]. Для специфической профилактики туляремии в Российской Федерации применяется живая вакцина (на основе Francisella tularonsis 15 НИИЭГ), использование которой позволило снизить заболеваемость этой инфекцией до спорадических случаев или небольших вспышек [92, 125, 17].
Данная вакцина, как всякая живая вакцина, не лишена определенных недостатков, важнейшими из которых являются введение человеку чужеродной генетической информации и длительное персистирование вакцинного штамма в организме вакцинированых. В настоящее время выявлено значительное сходство геномов вакцинного и дикого штаммов F. tularensis [96] . Поэтому применение живой вакцины для вакцинации людей не желательно, особенно в условиях нарастающей тенденции снижения уровня естественного иммунитета у населения.
Одним из перспективных направлений в области совершенствования и разработки эффективных способов защиты от туляремии является создание иммунопрофилактических препаратов нового поколения на основе протективных компонентов F, tularensis. Такими препаратами, например, могут быть субъединичные вакцины [31, 44, 28, 104]. Данные вакцины имеют ряд преимуществ, важнейшими из которых являются исключение возможности возникновения манифестной инфекции, слабая реактогенность и возможность получения стандартного препарата антигена. Вместе с тем, сложности в создании субъединичных вакцин связаны с недостаточными сведеньями о протективных антигенах F. tularensis и иммунных механизмах ответа макроорганизма.
Возбудитель туляремии является внутриклеточным патогеном и основная роль в формировании невосприимчивости к туляремии отводится Т-клеточному иммунитету. Основными Т-зависимыми антигенами туляремии являются компоненты внешней мембраны, среди которых наиболее изученным является белок TUL4[20, 138, 139].
На основе данных антигенных компонентов в последние годы были получены перспективные вакцинные препараты - это рекомбинантный или очищенный белок TUL4, инкапсулированный в иммуностимулирующие комплексы (ISCOMs) [140, 68], липополисахарид-белковый комплекс наружных мембран F. tularensls [93], препарат ОМ-«С», представляющий собой комплекс наружных мембран, выделенный из вакцинного штамма F. tularensls 15 [9].
В настоящее время спектр основных иммуногенов F. tularensls окончательно не определен, а вышеупомянутые препараты представляют собой сложную и, как следствие, заведомо трудно стандартизуемую смесь белков, липополисахаридов, жирных кислот и других компонентов клетки F. tularensis. Поэтому использование таких препаратов для вакцинации людей менее предпочтительно, по сравнению с препаратами индивидуальных белков, липополисахаридов или их смеси. Следует также отметить, что получение этих препаратов связано с необходимостью культивирования патогенных штаммов туляремии.
Получение стандартных белковых препаратов трудоемко, а многочисленные очистки приводят к снижению протективной активности.
Становится ясно, что для создания эффективных профилактических препаратов против туляремии необходим принципиально новый подход, направленный на получение стандартных рекомбинантных белков, обладающих высокой протективностью, в том числе, за счет использования соответствующих адъювантов или иммуносорбентов.
Цель работы. Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4 на основе технологии целлюлозосвязывающих доменов для генно-инженерных субъединичных противотуляремийных вакцинных препаратов.
В соответствии с поставленной целью в процессе выполнения диссертационной работы предстояло решить следующие основные задачи:
Клонирование гена белка TUL4, а также отдельных участков гена белка TUL4 в составе гибридных генов {белков};
Создание бактериальных продуцентов белка TUL4 и рекомбинантных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4;
Изучение локализации белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 в лизатах клеток штамма-продуцента;
4. Разработка технологии очистки и получения препарата белка, пригодного для иммунизации;
5. Исследование антигенных свойств препарата белка TUL4.
Научная новизна. Впервые получен в препаративных количествах высокоочищенный рекомбинантный белок TUL4-sp-CBD, потенциальный компонент генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины.
Впервые для обеспечения синтеза белка TUL4 в клетках Escherichia coli были сконструированы гибридные плазмиды, контролирующие синтез химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4. Данные химерные белки состоят из нуклеотидной последовательности зрелого белка TUL4, Gly-Ser спейсера и целлюлозосвязывающего домена из Anaerocellum thermophilum. Белки TUL4-sp-CBD и pCBD-sp-TUL4 отличаются N- и С-концевым расположением последовательности белка TUL4.
Впервые были получены эффективные бактериальные продуценты белка TUL4 в составе химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 в клетках Е. coli штамма М15 (pREP4) и DH5a. Уровень экспрессии химерных белков составляет 30% от тотального.
На основе использования свойств целлюлозосвязывающего домена, входящего в состав химерных белков, была разработана эффективная схема очистки рекомбинантных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 на целлюлозе. Степень чистоты препаратов составляла более 95%.
Препарат белка, содержащий комплекс TUL4-sp-CBD и целлюлозу индуцировал выработку антител к исследуемому белку у лабораторных животных- Специфичность антител подтверждена с помощью метода иммуноблоттинга.
Практическое значение работы. Технология получения химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4, а также способ очистки и иммобилизации белков на целлюлозном сорбенте могут найти применение при создании профилактических препаратов против туляремии. Препарат, содержащий комплекс TUL4-sp-CBD-целлюлоза, может быть использован для диагностических целей или для изучения свойств белка TUL4.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной конференции «Молекулярная медицина и безопасность» 26-28 октября, 2004 г., г. Москва; на международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» 8-10 сентября, 2004 г. , г. Новосибирск; на V молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» 30 марта, 2005 г., г. Москва; на всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» 19-22 мая, 2005 г., г. Суздаль.
Профилактика туляремии
Профилактика заболевания туляремией осуществляется с помощью неспецифических и специфических мероприятий. Основные меры неспецифической профилактики - это мероприятия направленые на оздоровление природных очагов, обеспечение санитарного состояния источников воды, складов продовольствия и т.д., а также санитарно-просветительская работа среди населения. Не менее важную роль занимает специфическая профилактика -вакцинация против туляремии. Вакцинация - это самое эффективное и экономически выгодное средство защиты против инфекционных болезней, известное современной медицине. 2.1. Живые вакцины. Живые вакцины получают на основе ослабленных штаммов микроорганизмов со стойко закрепленной авирулентностью (безвредностью). Вакцинный штамм после введения размножается в организме привитого и вызывает вакцинальный процесс. Преимуществом живых вакцин является наличие в препарате полного антигенного состава патогена, который обеспечивает высокую и стойкую иммуногенность и протективность вакцинного препарата даже после его однократного введения. Отрицательной стороной данных вакцин является то, что они трудно дозируются и поддаются биоконтролю. При применении живых вакцин возможно возникновение реверсии вирулентных форм, что может стать причиной заболевания вакцинируемого. В настоящее время существуют ограничения применения многих живых вакцин у людей с ослабленным иммунитетом (особенно у ВИЧ инфицированных и больных гепатитом С) . Тем не менее, несмотря на недостатки, живые вакцины применяются в практике, как единственные наиболее эффективные препараты против многих заболеваний. Примером таких вакцин является противотуберкулезная и противотуляремийная вакцина. Живая вакцина, протяв туляремии. Первые попытки создания живой вакцины против туляремии начались еще в 30-е годы прошлого столетия в СССР. Ослабление штамма туляремии осуществлялось Н.А. Гайским и Б. Я. Эльбертом с помощью многочисленных пассажей вирулентного штамма на средах, содержащих антисыворотку к туляремии или с помощью высушивания штаммов [92]. В 1934 году была впервые показана защита лабораторных животных от вирулентного штамма F. tularonsis с помощью иммунизации ослабленным штаммом F. tularcnsis 15. Предположили, что такая иммунизация может быть применима для людей [154] .
В 1942 году в СССР стал применяться ослабленный штамм туляремии в качестве вакцины от данного заболевания. Эффективность данной вакцины демонстрировалась на добровольцах, а потом и на тысячах людей. Новый штамм F. tularcnsis 15 стал активно применяться в качестве вакцины против туляремии. В результате к I960 году в СССР более 60 миллионов людей были привиты штаммом F. tularcnsis 15 [136]. Таким образом, наиболее важным и приоритетным открытием стало создание Н.А. Гайским и Б.Я. Эльбертом живой туляремийной вакцины, до настоящего времени являющейся главным средством профилактики туляремии. Через некоторое время штамм 15 стал слабовирулентным для мышей [118], но его удалось восстановить. Таким образом, необходим был постоянный контроль за состоянием вакцинного штамма. В это же время был получен вакцинный штамм 155. Оба штамма (15 и 155), полученные в институте микробиологии и эпидемиологии им. Н. Ф. Гамалеи в Москве, использовались в качестве живых вакцин. В 1956 году штамм 15 был передан в США [125]. Американские исследователи с помощью специальных питательных сред дифференцировали по цвету и морфологии отдельные колонии клеток штамма 15. Оказалось, что штамм 15 на средах образовывал колонии либо серого, либо голубого цвета. Вариант с голубыми колониями показывал наибольшую вирулентность и иммуногенность у мышей, чем вариант с серыми колониями [49], и защищал мышей от ингаляционного заражения штаммом Schu. Таким образом, американские ученые, путем нескольких пересевов штамма 15, создали другой живой вакцинный штамм, который назвали LVS. Были проведены опыты на добровольцах. Опыты показали, что 3 из 18 привитых LVS штаммом человека заразились штаммом Schu при аэрогенном пути заражения, в то время как 8 из 10 не привитых LVS человек заразились штаммом Schu [130, 131] . В США также были проведены эксперименты, показывающие преимущества аэрозольной вакцинации LVS по сравнению со стандартной - подкожной [78]. Эффективность LVS против лабораторной туляремийной инфекции была показана, и правительство США лицензировало LVS вакцину, как пригодную для иммунизации лабораторного персонала и военных [38]. Поскольку в настоящее время природа вирулентности и протективности F, tularcnsxs слабо изучена, то большая часть исследований направлена на решение этих задач с помощью расшифровки геномов различных штаммов туляремии. На сегодняшний день определенные успехи в расшифровке геномов штаммов F. tularensis уже достигнуты. Так в 2000 году был полностью секвенирован геном патогенного штамма F. tularensis Schu [89], а в декабре 2004 года геном был полностью аннотирован. Содержание G-C в геноме Schu составляет 33,2. В настоящий момент изучаются продукты 18 04 обнаруженных рамок считывания. Из 1804 рамок считывания 1289 кодируют белки. Около 30% белков не имеют аналогов в других бактериях, и авторы считают, что многие из этих белков - факторы вирулентности [89, 119]. Было обнаружено, что гены плазмид рОМ1 и pNFLlO, которые были предварительно исследованы у LVS и у F. novicida [116], отсутствовали в геноме штамма Schu [89]. В 2005 г. в Швеции также был расшифрован геном высокопатогенного штамма i7. tularensis (авторы не указывают название штамма) [143]
В имеющемся кратком обзоре этой статьи (полный текст статьи находится в печати), авторы определили нуклеотидные последовательности, связанные с патогенностью бактерии. Используя различные методы для того, чтобы предсказать метаболические пути бактерии, неожиданно было найдено большое количество прерванных путей, которое объяснило специальные требования бактерий к условиям культивирования. По последним данным известно, что геном вакцинного штамма LVS (15) также был расшифрован и показано, что в этом штамме представлены практически все основные факторы патогенности возбудителя, что ставит под сомнение возможность дальнейшего использования живой вакцины против туляремии для вакцинации людей [96]. Таким образом, основными недостатками живой туляремийной вакцины являются: 1. Умеренная реактогенность; 2. Наличие факторов патогенности природного возбудителя; 3. Неизвестная природа аттенуации и защитного эффекта организма; 4. Необходимость постоянного контроля производства и хранения. В этой связи, актуальной является разработка новых вакцин и диагностических препаратов против туляремии. В качестве возможных вариантов создания новых вакцин наиболее перспективным является создание субъединичных вакцин, лишенных многих недостатков живых вакцин. 2.2. Инактивированные вакцины. В настоящее время применяют инактивированные вакцины, изготовленные из убитых микроорганизмов, либо их метаболитов, а также из отдельных антигенов, полученных биосинтетическим или физико-химическим путем. По сравнению с живыми вакцинами такие вакцины лишены многих балластных веществ, что значительно уменьшает частоту побочных эффектов, часто развивающихся после иммунизации живыми вакцинами. Также, такие вакцины полностью исключают случаи возникновения манифестной инфекции. Среди инактивированных вакцин можно выделить корпускулярные и субклеточные. Для приготовления корпускулярных вакцин вирулентные микроорганизмы убивают либо термической обработкой, либо воздействием химических агентов (формалин, ацетон). Подобные вакцины содержат полный набор антигенов. Спектр возбудителей, используемых для приготовления данных вакцин, разнообразен: наибольшее распространение получили бактериальные и вирусные вакцины. Попытки создания корпускулярной вакцины против туляремии были начаты еще в 1930 году, когда Ли Фошей доказал, что иммунная сыворотка может применяться при заболевании туляремией. Эти исследования стимулировали Фошея создать инактивированную (убитую) вакцину против туляремии [60, 58].
Использование технологии химерных белков для создания субъединичных генно-инженерных вакцин
Для повышения уровня экспрессии и стабильности чужеродных белков в бактериальной системе, а также для простоты тестирования и эффективной системы очистки данных белков существует ряд генно-инженерных подходов. Одним из перспективных подходов является fusion-технология - технология слитных (химерных) белков, в основе которой лежит метод, основанный на соединении в одной рамке трансляции двух генов (гена белка-носителя и гена исследуемого продукта), приводящий к синтезу в бактериальной системе химерного белка [153]. В качестве первого белка-носителя в генно-инженерной практике была использована р-галактозидаза Е. coll. В то время это был наиболее хорошо изученный белок, для которого были созданы простые хромофорные субстраты для тестирования и разработаны аффинные сорбенты [51, 48]. Этот белок-носитель имел целый ряд технологических недостатков: большие размеры, низкая стабильность, невысокий уровень экспрессии, склонность к агрегации. В дальнейшем в генно-инженерную практику были введены другие белки-носители: глютатион трансфераза, А-белок, тиоредоксин, дигидрофолатредуктаза, мальтоза и т.д. [63, 84, 91, 133]. Все эти белки-носители имели меньшие по сравнению с Р-галактозидазой размеры, эффективную систему тестирования. Уровень экспрессии для всех описанных белков был достаточно высок (10-30%). Тенденция к минимизации белка-носителя способствовала развитию технологии tag-аффинных систем [153], основанных на специфическом молекулярном узнавании. Tag и представляют собой небольшие по молекулярному весу аффинные домены различной химической природы (Табл. 5, стр. 32) , проявляющие свою специфичность при использовании молекулярных взаимодействий различного типа: 1, Антиген-антителоVag и FLAG-пептиды и моноклональные антитела к ним [51, 54]; 2. Стрептавидин-биотин-взаимодействие - in vivo биотилинируемый пептид и стрептавидин - пептид (миметик) [134, 91]; 3. Иммобилизованный металл-хелатная хроматография - пептид из 6-ти гистидиновых остатков [153]; 4. Лиганд-рецепторное взаимодействие - стафилококковый А-белок Fc-домен имунноглобулинов и стрептококковый G-белок - сыворточный альбумин [153, 132]. Как видно из таблицы 5 (стр. 32} все tag4и имеют различный молекулярный вес, различную природу происхождения и характеризуются различными условиями элюирования. Благодоря этому при помощи различных типов tag-лигандных взаимодействий удается решать основные задачи гетерологическои экспрессии для различных белков: 1.
Получение белков в растворимой форме; 2. Иммобилизации; 3. Очистки. По размерам tag n подразделяются на маленькие и большие. Размер tag"а в значительной мере определяет особенности технологии, в которой используется данный tag. К маленьким tag"ам относят poly-Arg-, FLAG-, poly-His-, с-myc, S-, and Strep Ilag [132, 54, 134, 135, 90, 91], Рассмотрим применение небольших по размеру tag oB на примере металл-хелатной хроматографии. Ыетгмл-хела.тная хроматография. Наибольшую популярность из перечисленных методик приобрела металл-хелатная хроматография, использующая в качестве аффинного домена последовательность из 6-ти гистидиновых аминокислотных остатков. Данный домен является наиболее коротким из используемых tag oB, практически не вносит изменений в свойства и активность исследуемых белков. При помощи векторов pQE фирмы Quagene, имеющих все 3 фазы трансляции и многосайтный полилинкер, удается просто и технологично присоединить последовательность шести гистидинов в Ы- и С- концевую область изучаемых белков. Моноклональные антитела к полигистидину позволяют эффективно тестировать продукты экспрессии методом иммунноблоттинга. Необычайным преимуществом металл-хелатной иммобилизации с помощью гистидиновых остатков является то, что она может протекать как в нативных, так и в денатурирующих (б М GnCl и 8 М мочевина) условиях, что позволяет работать и с хорошо растворимыми в водных растворах белками и с белками, синтезирующимися в нерастворимой форме в виде телец-включений. К недостаткам данной технологии следует отнести неудобный вариант детекции - иммунноблоттинг, высокая стоимость металл-хелатного сорбента и невозможность данных tag oB выполнять функцию носителя, что позволяет применять данный вид хроматографии только для аналитических задач. Tag и большого размера - это хитинсвязывающие, кальмодулинсвязывающие и целлюлозосвязывающие домены [158, 164, 145, 165, 155, 108]. Они обычно применяются для улучшения экспрессии и растворимости встраиваемых белков, в том числе и белков-антигенов. 3.1. Целлюлозосвязывающие домены. Исследуя целлюлолитические ферменты, было выяснено, что они содержат три функционально различных структурных элемента: каталитический домен, субстратсвязывающий домен и соединяющий их линкер [2 6]- Наличие двух типов доменов впервые удалось продемонстрировать в 70-ых годах, когда было установлено, что в процессе аффинной хроматографии на целлюлозе некоторые формы грибных целлюлаз не элюируются растворимым субстратом, а расщепляют его, оставаясь в прочно адсорбированном состоянии. Это показало, что связывание с целлюлозой обеспечивается у них самостоятельным фрагментом молекулы, не входящим в активный центр [120]. Данный субстратсвязывающий модуль получил название - целлюлозосвязывающий домен {ЦСД) [25, 2 6]. ЦСД встречаются у многих организмов: базидиомицетов, несовершенных и анаэробных грибов, водорослей, аэробных и анаэробных микроорганизмов [80, 3] . Размер ЦСД варьирует от 35 до 140 а.о. ЦСД имеют различную (N-, С- концевую, центральную, сблоченную} локализацию внутри гликозилгидролаз. ЦСД из различных организмов проклонированы и охарактеризованы как отдельные домены; для некоторых из них определена третичная структура [26]. Целлюлозосвязывающие домены обладают рядом свойств, благодаря которым они представляют широкий интерес для конструирования белков-носителей.
Данные свойства можно разделить на несколько групп: 1. ЦСД имеют различный размер - от грибных доменов размером 30-40 а. о. до бактериальных доменов размером 200-300 а. о. ; 2. Все ЦСД специфичны как к аморфным (разрыхленные), так и к кристаллическим {плотно упакованные) формам целлюлозы- Это свойство обеспечивает ЦСД способность сорбироваться на различных целлюлозосодержащих носителях; 3. Для различных ЦСД сила связывания с субстратом варьируется от необратимой сорбции до относительно слабого взаимодействия [80, 26] . Поэтому, подобрав ЦСД с определенными физико-химическими свойствами, можно решать различные биотехнологические задачи. В связи с этим, ЦСД из термофильных гликозилгидролаз, в частности, из Anaerocellum thQrmophilum, представляют собой большой интерес. Он обеспечивает прочное взаимодействие с целлюлозой в широком диапазоне: 1) рН4-11; 2) температуры 0-75С; 3) концентрации солей, ЭДТА, слабых детергентов. 1 мл целлюлозы связывает до 10 мг ЦСД. Дополнительным преимуществом является связывание целлюлозы с ЦСД в присутствии хаотропных агентов (6М мочевина). Это позволяет проводить в одну стадию процедуру растворения, связывания, очистки и ренатурации исследуемого химерного белка на твердой фазе со значительно большим выходом, чем в растворе в 3 раза; 4. ЦСД автономны в составе целлюлаз, однако сохраняют свои свойства после отделения от остальной молекулы, а также в составе химерных белков; 5. Целлюлоза является дешевым и экологически безопасным субстратом; 6. ЦСД отсутствуют в клетках Е. coli. Все перечисленные свойства позволяют получить fusion ЦСД с различными белками с сохранением их основных свойств и активности. Например, при использовании fusion технологии с ЦСД была осуществлена эффективная экспрессия рекомбинантного белка HvNHX2 (вакуолярный Ыа+/Н+ антипортер из ячменя) - ЦСД [2]. Актуальным является использование ЦСД в практике создания субъединичных вакцин с целью не только одновременной очистки, концентрации, иммобилизации, но и с целью защиты антигена от клеточных протеаз штамма-продуцента.
Выделение хромосомной ДНК
Аналитическое количество плазмидной ДНК выделяли щелочным методом [15]. В 5 мл среды LB вносили на кончике бактериологической петли штамм-продуцент Е. coll М15, несущий нужную плазмиду. В среду добавляли антибиотики -ампицилин и канамицин до конечных концентраций 25 мкг/мл и 150 мкг/мл соответственно. Пробирку со средой инкубировали при 37С в течении 14-18 часов при интенсивном покачивании. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием, осадок подсушивали и выдерживали 20 мин при -2 0 С. Осадок рєсуспензировали в 250 мкл буфера I (50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-HCl рН 8, 10 мМ ЭДТА), добавляли 5 мг/мл лизоцима и инкубировали 5 мин. при комнатной температуре. Далее добавляли (медленно по стенке) 500 мкл буфера II (0.2 Н КаОН, 1% SDS) и аккуратно перемешивали до просветления раствора {не более 10 мин.). Добавляли 250 мкл буфера III (5М ацетата калия) и резко встряхивали. Содержимое пробирки переносили в 1,5 мл пробирку и центрифугировали 10 мин. при 10000 об/мин, супернатант переносили в чистую пробирку. Добавляли 0,7 объема (700 мкл) изопропанола, перемешивали и выдерживали 20 мин. при -20С. ДНК осаждали с помощью центрифугирования в течении 10 мин при 14000 об-/мин и растворяли в 200 мкл дистиллированной воды. Потом добавляли 200 мкл 5 М ацетата аммония и выдерживали 20 мин при -20С. Далее раствор центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин, перенесили супернатант в чистую пробирку, добавляли 3 мкл РНК-зы и выдерживали 10 мин при комнатной температуре. Добавляли 400 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и после центрифугирования в течении 5 мин. при 14000 об/мин. отбирали верхнюю фазу в чистый эппендорф. Добавляли 1000 мкл этанола и 20 мл 5 М ацетета аммония, перемешивали и оставляли при температуре -20 С на 20 мин. ДНК осаждали с помощью центрифугирования в течении 10 мин при 14000 об/мин и растворяли в 20-30 мкл дистиллированной воды. 2.3. Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК. Препаративные количества плазмидной ДНК вьщеляли щелочным методом [15]. 100-250 мл среды LB заражали штаммом продуцентом Е. coli М15, несущим нужную плазмиду.
В среду добавляли антибиотики -ампицилин и канамицин до конечных концентраций мг/мл и мг/мл соответственно. Пробирку со средой инкубировали при 37 С в течении 14-18 часов при интенсивном покачивании. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием, осадок подсушивали и выдерживали 20 мин при -2 0 С. Осадок ресуспензировали в 4 мл буфера I (50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-НС1 рН 8, 10 мМ ЭДТА), добавляли 100 мкл лизоцима с концентрацией 10 мг/мл и инкубировали 5 мин во льду. Далее добавляли (медленно по стенке) 8 мл буфера II (0,2 Н NaOH, 1% SDS) и аккуратно перемешивали до просветления раствора (не более 10 мин) . Добавляли 4 мл. буфера III (5 М ацетата калия) и резко встряхивали. Содержимое пробирки центрифугировали в течении 10 мин при 10000 об/мин. К супернатанту добавляли 12,5 мл изопропанола и инкубировали 20 мин при -20С. ДНК осаждали с помощью центрифугирования в течении 10 мин при 10000 об./мин и растворяли в 4 00 мкл дистиллированной воды. Раствор переносили в 1,5 мл пробирку, добавляли 4 00 мкл ацетата аммония и выдерживали 20 мин при -20 С. Далее раствор центрифугировали 10 мин при 13000 об./мин, переносили супернатант в чистую пробирку, добавляли 600 мкл изопропанола, перемешивали и инкубировали 20 мин при -20 С. ДНК осаждали с помощью центрифугирования в течении 10 мин при 10000 об/мин и растворяли в 200 мкл дистиллированной воды. Добавляли 200 мкл насыщенного раствора LiCI, тщательно перемешивали и инкубировали 20 мин при -20С. Далее центрифугировали в течении 10 мин при 10000 об/мин и отбирали верхнюю фазу в чистый эппендорф. Добавляли 3 мкл РНК-зы и выдерживали 10 мин при комнатной температуре. Добавляли 400 мкл хлороформа, тщательно перемешивали, и после центрифугирования в течении 5 мин при 14000 об/мин отбирали верхнюю фазу в чистую пробирку. Добавляли 1000 мкл этанола и 20 мл 5 М ацетата аммония, перемешивали и оставляли при температуре -20 С на 20 мин. ДНК осаждали с помощью центрифугирования в течении 10 мин при 14000 об/мин и растворяли в 50-100 мкл дистиллированной воды. 2.4. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами. Для гидролиза ДНК использовали буферные смеси с низкой, средней и высокой ионной силой, согласно рекомендациям фирм-производителей. Время инкубации составляло от 1 до 1,5 часов при 37 С. 2.5. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле. Разделение фрагментов ДНК проводили согласно Маниатису и др. [15] методом электрофореза в горизонтальных агарозных гелях с концентрацией агарозы от 0,8% до 2,5%. Электрофорез проводили при комнатной температуре в трис-ацетатном буфере (0,04 М трис-ацетат рН 8,1, 0,002 М ЭДТА) при напряженности электрического поля 10 В/см в течение 30-60 мин. Пробы наносили в 2-3 мкл 30%-ного водного раствора глицерина, содержащего красители-маркеры ХС (0,11) и ВРВ (0,1%). Гели окрашивали в трис-ацетатном буфере с содержанием 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Гели с разделенными фрагментами фотографировали в УФ-свете на цифровую камеру фирмы «HP» с использованием оранжевого светофильтра. 2.6. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля. Препаративное разделение фрагментов ДНК проводилось в 0,8 агарозном геле. Агароза использовалась не ниже класса GTG. Элюция фрагментов ДНК осуществлялась путем фильтрации кусочка агарозного геля, содержащего нужный фрагмент ДНК.
В качестве фильтра использовалась стерильная стекловата. Для эффективной фильтрации через стекловату использовалось низкоскоростное центрифугирование. 2.7. Лигирование фрагментов ДНК. Для лигирования фрагментов ДНК использовали ДНК-лигазу фага Т4 производства "Fermentas MBI" (Литва). Реакция лигирования проводилась в буфере, содержащем трихлорид гексааминокобальта. Состав буфера: 250 мМ трис-HCl рН 7,2, 25 мМ КС1, 5 мМ МдС12, 10 мМ ДТТ, 1 мМ трихлорида гексааминокобальта. Реакция лигирования заканчивалась после инкубации в течение 45-60 мин при комнатной температуре. Соотношение и концентрацию вектора и клонируемого фрагмента определяли по таблице оптимизации лигирования. 2.8. Трансформация клеток Е. coli. Трансформацию осуществляли методом электропарации согласно инструкции к прибору для трансформации (BIO-RAD, США). 2.8.1. Подготовка компетентных клеток. Инокулировали 100 мл среды LB для электропорации 1 мл свежей ночной культуры клеток и выращивали при 37С с аэрацией на качалке (250-300 об/мин) до достижения оптической плотности, равной при Dsso = 0,5-0,6. После этого клетки переносили в стерильные пробирки для центрифугирования, охлаждали во льду 30 мин и центрифугировали 15 мин при 4 С и 4000 об/мин. После тщательного удаления супернатанта осадок ресуспендировали в 100 мл (общий обьем) стерильной охлажденной до +4 С бидистиллированной деионизированной воды и центрифугированли 15 мин при 4 С и 4 000 об/мин. Тщательно удалив супернатант, осадок ресуспендировали в 50 мл бидистиллированной деионизированной воды и центрифугировали 15 мин при 4 С и 4000 об/мин. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл 10%-ного стерильного охлажденного глицерина и центрифугировали при 4 С и 4000 об/мин. После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в конечном обьеме 10% глицерина, исходя из того, что 50 мл культуры расходуется на 10 проб, а 80 мкл конечного раствора необходимо на одну пробу.
Оптимизация экспрессии химерных белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD
Для оптимизации индукции белков CBD-spUL и TUL4-sp-CBD в клетках штамма продуцента мы варьировали время индукции (2-3 часа). В результате проведенных экспериментов оказалось, что увеличение времени индукции на 1 час не вызывает повышения уровня экспрессии. Очевидно, что изменение времени индукции не является решающим фактором, влияющим на уровень экспрессии белка TUL4. По данным литературы известно, что хромосомная ДНК клеток F. tularensis является AT богатой, а количество GC составляет примерно 30% [89]. Для клеток Е. coli характерным является наличие примерно 60% GC. Таким образом, многие кодоны туляремийной ДНК не оптимальны для Е. coli, и трансляция какого-либо гена из F. tularensis в клетках Е. coli, возможно, будет мало эффективной. Для решения подобных проблем существуют различные подходы. Например, можно создать полностью синтетический ген, содержащий наиболее оптимальные для Е. coli кодоны, однако, если размер гена достаточно большой, то данный подход является технологически и экономически трудоемким. С другой стороны, если неоптимальные кодоны расположены в начале или конце гена, то данный подход весьма эффективен, так как приходиться синтезировать только небольшую область гена. Другой подход заключается в введении в штамм-продуцент плазмид, кодирующих t-PHK для редко встречающихся кодонов. Следующим этапом нашей работы была проверка улучшения зкспрессии гена рекомбинантного белка TUL4 с помощью плазмиды pACYC-RlL (Stratagene, USA), кодирующей t-PHK для редко встречающихся в Е. coli кодонов AGA, AGG, АТА и СТА. 2.2. Оптимизация индукции с помощью плазмиды pACYC-RIL. Анализ нуклеотиднои последовательности генов CBD-spUL и TUL4-sp-CBD выявил, что в их генах присутствуют редко встречающиеся в клетках Е. coli кодоны AGA, AGG, АТА и СТА, которые, возможно, снижают эффективность трансляции гена, и как следствие, приводят к слабому уровню продукции белка (схема 10, стр. 75). Как видно из схемы 10, кодоны AGA, AGG, АТА и СТА расположены практически во всех областях рекомбинантного гена белка TUL4. Данная особенность расположения кодонов не позволяет нам применить метод, заключающийся в создании синтетической части гена белка TUL4.
Таким образом, применение плазмиды pACYC-RIL для возможного увеличения продукции химерного белка TUL4 является обоснованным. Нуклеотидная последовательность гена белка TUL4-sp-CBD содержит 20 редко встречающихся кодонов AGA, AGG, АТА и СТА (схема 10, стр. 75) . Трансформация штаммов продуцентов Е. coli М15 [pREP4/ pTUL4-sp-CBD] и Е. coli М15 [pREP4, pCBD-spUL] плазмидой pACYC-RILf кодирующей t-PHK для редко встречающихся кодонов AGA, AGG, АТА, СТА, заметно увеличила количество продуцируемого белка (Рис. 10, стр. 72). Анализируя полученные данные, можно предположить, что плазмида pACYC-RIL. сыграла ключевую роль в повышении экспрессии химерных белков TUL4. В результате применения плазмиды pACYC-RIL нам удалось заметно повысить уровень экспрессии белка TUL4-sp-CBD и CBD-spUL4. Уровень продукции химерных белков увеличился в два раза и составляет примерно 30% от тотального белка. Поскольку нами была показана эффективность плазмиды pACYC-RIL в штамме Е. coli М15 (pREP4) , то присутствие данной плазмиды в других штаммах Е. coli также может играть ключевую роль в повышении индукции белка TUL4. Следующим этапом нашей работы было изучение экспрессии генов CBD-spUL и TUL4-sp-CBD в клетках Е. coli штаммов DH5a и МсЮОЭ вместе с плазмидой pACYC-RIL. 2.3. Индукция белков CBD-spUL и TUL4-sp-CBD в различных штаммах Е. coli. Нами был проанализирован уровень продукции химерных белков CBD-spUL и TUL4-sp-CBD в различных штаммах Е. coli. В исследованиях использовали штамм Е. coli DH5a и МсЮОЭ. Данные штаммы содержали плазмиды pCBD-spUL и pTUL4-sp-CBD вместе с pACYC-RIL. Наиболее оптимальной экспрессия белков CBD-spUL4 и TUL4-sp-CBD оказалась в штамме Е. colx DH5a, трансформированном плазмидой pACYC-RIL (Рис. 11}. Было изучено состояние химерных белков CBD-SpUL и TUL4-sp-CBD в лизатах клеток Е. coli штамма DH5a (Рис, 12). 12 3 4 5 6 7 CBD-spUL4 TUM-sp-CBD Рис. 12. Анализ состояния химерных белков CBD-spUL4 и TUL4-sp-CBD в лизатах клеток Е. coli DH5a. Электрофорез по Лэммли растворимых (супернатант) и нерастворимых (осадок) клеточных белков клонов, экспрессирующих химерный белок. 1, 2 - штамм Е. coli DH5a - супернатант, осадок; 3, 4 -штамм Е. coli DH5a [pTUL4-sp-CBD] - супернатант, осадок; 5, б - штамм Е. coli DH5a [pCBD-spUL4] - супернатант, осадок; 7- контроль молекулярной массы 37 кДа. Анализ сотояния белков CBD-spUL4 и TUL4-sp-CBD в лизатах клеток Е. coli штамма DH5oi показал, что химерные белки синтезируются в растворимой форме. Растворимая форма белка позволяет очистить белок с помощью целлюлозного сорбента без дополнительных и достаточно трудоемких методик, а именно без применения хаотропных агентов (в случае нерастворимой формы белка). Таким образом, помимо высокого уровня продукции белка TUL4 в штамме-продуценте, рекомбинантные белки синтезируются на 90 % в растворимой форме. Дальнейшим этапом нашей работы является использование свойства ЦСД аффинно взаимодействовать с целлюлозой и связыватся с этим сорбентом для очистки, концентрации и иммобилизации рекомбинантных белков CBD-spUL4 и TUL4-sp-CBD. 4. Выделение и очистка белков CBD-spUL4 и TUL4-sp-CBD. Одной из задач получения стандартного белкового вакцинного или диагностического препарата является его эффективная очистка от белковых и небелковых компонентов штамма-продуцента.
Для вакцинных препаратов степень очистки должна составлять 95% и выше. Важным параметром является очистка белкового препарата от примесей липополисахаридов, которые являются пирогенами и при введении в организм животного и человека вызывают септический шок. Использование в составе химерных белков CBD-spUL4 и TUL4-sp-CBD ЦСД позволяет эффективно выделить и очистить белок от примесей штамма продуцента. Используемый в данной работе ЦСД из термофильного микроорганизма Anaerocellum thermophilvm характеризуется высокой константой связывания целлюлозы и обеспечивает стабильное взаимодействие с целлюлозной матрицей в широком диапазоне ионной силы (10 мМ - 4 М). Это позволяет проводить в одну стадию процедуру растворения, связывания, очистки и ренатурации исследуемого химерного белка на твердой фазе со значительно большим выходом, чем в растворе (в 3 раза). Выделение и очистка химерных белков проводилась совместно с Н.В. Лавровой. 4.1. Изучение связывания химерных белков CBD-spUL4 и TUL4-sp-CBD с различными видами целлюлозы. Целлюлоза представляет собой перспективный высокотехнологичный сорбент для очистки препаративных количеств белка, поскольку она имеет низкую стоимость и обладает многообразием форм (кристаллическая, аморфная, растворимая и различные продукты-модификации) , среди которых можно выбрать оптимальную для очистки (иммобилизации)и формирования препарата конкретного белка. В результате проведенных исследований была проверена прочность связывания с целлюлозой белка TUL4-sp-CBD, по сравнению с отдельно ЦСД. Оказалось, что присоединение к ЦСД белка TUL4 не влияет на прочность связывания ЦСД с целлюлозой. Анализ взаимодействия различных целлюлоз с комплексом TUL4-sp-CBD показал, что данные целлюлозы практически одинаково связываются с CBD (Рис. 13). Для иммунизации подходят только те целлюлозы, которые имеют небольшой размер, а именно аморфная целлюлоза, полученная по методике, предложенной А.Е. Гурвичем [8] и сферическая целлюлоза с размером гранул 5-10 мкм (The collaborative group celluflow c-25, USA).
