Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
Цитолитическис лимфоциты 7
Неполитические Т-лимфоциты 7
Естественные киллерные клетки (ЕКК) 11
Лимфокинактивированные киллеры (ЛАК клетки) 13
Механизмы лизиса клеток-мишеней 17
Результаты и обсуждение 39
Описание системы 39
Характеристика механизмов цитотоксичности ЛАК клеток 41
Анализ цитотоксических белков ЛАК клеток 46
Апоптотическая активность белков ЛАК клеток. 54
Выводы: 65
Материалы и методы 66
Белки, ферменты и реактивы 66
Выделение мембран клеток 67
Аффинная хроматография 67
Хроматография 68
Электрофорез и Western блот 68
Вестерн блот анализ 70
Масс-спектрометрический анализ 71
Гельфильтрация 73
Определение цитолитической активности 73
Определение фрагментации ДНК 74
Благодарности 77
Список литературы 78
- Естественные киллерные клетки (ЕКК)
- Лимфокинактивированные киллеры (ЛАК клетки)
- Характеристика механизмов цитотоксичности ЛАК клеток
- Электрофорез и Western блот
Введение к работе
Одним из приоритетных направлений современной биологии является изучение молекулярных механизмов иммунитета.
Иммунная система защищает организм от инфекций. Различают два типа иммунитета - врожденный и адаптивный. Врожденный иммунитет является первой линией обороны против болезней. Клетки врожденного иммунного ответа способны распознавать ограниченный набор молекул на поверхности патогенов и поэтому врождённый иммунитет не может отвечать на некоторые заболевания. Однако его отличает быстрое время реакции на инфекцию. Система адаптивного иммунного ответа базируется на клональном отборе из большого репертуара лимфоцитов, несущих на себе высоко специфичные рецепторы против огромного количества чужих антигенов. Это позволяет иммунной системе распознавать практически любой чужеродный антиген. В адаптивном иммунном ответе антиген-специфичные лимфоциты пролиферируют и дифференцируются в эффекторные клетки для того, чтобы уничтожить патоген. Клетки адаптивного иммунитета способны не только уничтожить патоген, но и, базируясь на клональном отборе, образовать долгоживущую популяцию клеток памяти, способных на более быстрый и эффективный иммунный ответ при повторном заражении. Известно, что ключевую роль в уничтожении опасных для организма клеток, таких как зараженные вирусом клетки и раковые клетки, выполняют цитолитические лимфоциты. Описаны два вида цитолитических лимфоцитов: цитолитические Т-лимфоциты и естественные киллеры. Естественные киллеры являются важной частью врожденной иммунной системы, в то время как цитолитические Т-лимфоциты
являются высоко дифференцированной и эффективной частью адаптивного иммунного ответа. Однако для всех цитолитических лимфоцитов предполагается существование единых механизмов лизиса клеток.
При взаимодействии рецепторов цитолитических лимфоцитов с чужеродными антигенными детерминантами происходит активация эффектора. При этом повышается уровень экспрессии генов цитотоксических белков и происходит встраивание этих белков в мембрану или секреция их в зону контакта. При взаимодействии клеток-мишеней с цитотоксическими белками клетки гибнут.
На сегодняшний день известно огромное количество цитотоксических белков, выделяемых клетками иммунной системы. Наиболее известными из них являются такие белки как фактор некроза опухолей (TNF), TRAIL, Fas-лиганд, лимфотоксины, 7-интерферон, перфорин. Но трудно объяснить цитолитическое действие лимфоцитов лишь описанными белками.
Поэтому изучение цитотоксических белков и механизмов их действия может способствовать лучшему пониманию механизмов действия иммунной системы.
Естественные киллерные клетки (ЕКК)
В этом состоянии они находятся в GO фазе клеточного цикла, не делятся, практически не производят белков и показывают очень низкий уровень экспрессии генов и высокий уровень компактизации хроматина. Они несут маркеры CD8, CD45RA для цитолитических Т-лимфоцитов и CD4, CD62L, CD45RA, CD5 для регуляторних. После того, как цитолитический Т-лимфоцит встретит соответствующий его Т-клеточному рецептору антиген в контексте МНС 1 класса, он активируется. (20)Активированный Т-лимфоцит становится одной из самых быстро делящихся клеток организма, делясь 3 и более раз в сутки. Такая активность должна поддерживаться присутствием антигена, то есть зараженных вирусом клеток. Быстро амплифицируя свою численность, Т-лимфоциты переходят в терминальную стадию своей дифференцировки - эффекторная CD8 Т клетка или ЦГЛ. (21) Эти клетки представляют из себя очень эффективную систему для уничтожения клеток-мишеней. Для них характерна экспрессия на поверхности CD8, CD44, а также эффекторная молекула FasL и рецептор для неё - Fas. Рецептор для FasL необходим для того, чтобы сдерживать численность активированных Т-лимфоцитов после того, как инфекция будет элиминирована из организма, причём количество копий Fas растёт в зависимости от продолжительности нахождения клетки в активированном состоянии. Также внутри клетки обычно развиваются заметные гранулы, содержащие цитотоксичные молекулы гранзимы и перфорин, и регуляторный IFN-y. При контакте с клеткой, экспрессирующей МНС 1 класса со специфичным для данной Т-клетки пептидом, происходит лизис данной клетки. (22-24)
Существует два типа ЦТЛ, отличающихся морфологически: крупные клетки с хорошо развитым секреторным аппаратом, содержащие гранулы, и малые негранулярные лимфоциты. И те, и другие ЦТЛ обладают цитолитической активностью.
Таким образом ЦТЛ представляют собой высоко дифференцированные клетки, способные уничтожать клетки собственного организма, несущие чужеродный или изменённый свой антиген в контексте определённого МНС 1 класса. Естественные киллерыые клетки (ЕКК).
ЕКК развиваются в костном мозге из общего для лимфоцитов предшественника и циркулируют в кровотоке. Они больше, чем Т- и В-лимфоциты, имеют хорошо различимые гранулы в цитоплазме и функционально различаются по своей способности убивать некоторые лимфоидные раковые клеточные линии in vitro без предварительной иммунизации или активации. Механизм убийства клеток для ЕКК точно такой же, как и у цитотоксических Т-лимфоцитов при адаптивном иммунном ответе. Однако, ЕКК зависимое убийство клеток индуцируется инвариантным рецептором. Известная функция ЕКК в иммунной защите показана для ранней фазы инфекции некоторыми внутриклеточными патогенами, например, вирусом герпеса. (25)Первоначально ЕКК были выделены как клетки способные лизировать опухолевые клетки без предварительной активации и без участия антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС).
ЕКК активируются в ответ на интерфероны или цитокины, выделяемые макрофагами. Хотя ЕКК, способные убить чувствительные мишени, можно выделить из неинфицированного донора, их активность возрастает в 20-100 раз после инкубации с IFN-a, IFN-P или ЕКК активирующим фактором - IL-12, который является одним из цитокинов, выделяющимся на ранних стадиях при многих инфекциях. Активированные ЕКК клетки служат для сдерживания вирусной инфекции, пока адаптивный иммунный ответ не выработает специфичные Т-лимфоциты, способные уничтожить инфекцию.(25) IL-12 вместе с TNF-a может также индуцировать продукцию ЕКК клетками больших количеств INF-y, важного цитокина для контроля многих инфекций. Его секреция на ранних стадиях очень важна для борьбы со многими заболеваниями.
Большая часть ЕКК человека несет на своей поверхности два характерных поверхностных маркера: это низкоаффинный FC-рецептор для IgG — CD16, и CD56 — белок с молекулярной массой 200 кДа, обеспечивающий адгезию клеток. Кроме того, ЕКК экспрессируют CD8 и С02-антигены, присущие Т-клеткам (26-29) ЕКК клетки имеют два типа поверхностных рецепторов, контролирующих их цитотоксическую активность. Рецепторы первого типа - это активирующие рецепторы. Они индуцирует убийство клетки-мишени. Некоторые рецепторы передают этот активационный сигнал, например лектины С-типа, распознающие широкий спектр СН лигандов, представленных на большом количестве клеток, а также Toll рецепторы. Второй набор рецепторов ингибирует активацию и предотвращает убийство своих клеток. Эти ингибиторные рецепторы специфичны для МНС 1 класса аллелей. Изменённая экспрессия МНС 1 класса является общей чертой для клеток, заражённых внутриклеточными патогенами. (30) Эти рецепторы у людей способны узнавать различные аллели HLA-B и HLA-C (это аллели МНС 1 класса, кодируемые в локусах В и С человеческого МНС или HLA гена) ЕКК рецепторы принадлежат к суперсемейству иммуноглобулиновых генов. Их обычно называют р58 и р70 или KIR. В дополнение к этому, ЕКК клетки экспрессируют гетеродимер двух лектинов С-типа: CD94 и NKG2. Они распознают HLA-E молекулу, которая связывается с лидерными пептидами других молекул МНС 1 класса. Таким образом этот рецептор может быть чувствительным к присутствию нескольких различных аллелей МНС 1 класса.(31)
ЕКК клетки способны лизировать клетки собственного организма, заражённые вирусами, изменяющими либо подавляющими экспрессию молекул МНС 1 класса, тем самым понижая уровень ингибирующего сигнала для ЕКК клеток, или клетки, содержащие изменённые гликозилированные белки, что обычно происходит при вирусном заражении. Также, поскольку многие раковые опухоли несут на себе пониженный уровень молекул МНС 1 класса, (избегая, таким образом, распознавания клетками адаптивной иммунной системы) ЕКК играют важную роль в уничтожении раковых клеток, даже если раковые клетки не несут на себе специфичных антигенов. (32)
Лимфокинактивированные киллеры (ЛАК клетки)
Одной из наиболее удобных лабораторных систем для изучения цитотоксичности является система лимфокинактивированных киллеров (ЛАК клеток).
В 1982 году Розенбергом было открыто и описано действие интерлейкина-2 на цитотоксичность лимфоцитов периферической крови человека. (33) Длительная инкубация клеток с интерлейкином-2 позволяет получить лейкоциты с высокой цитотоксичностью, независимо от иммунного статуса донора. Это свойство и делает ЛАК клетки удобной лабораторной моделью для изучения цитолитического действия лимфоцитов. Происхождение ЛАК клеток до настоящего времени считается спорным. Маловероятно, что предшественником ЛАК клеток является какой-либо один тип клеток. ЛАК клетки являются гетерогенной популяцией. (34) IL-2 это один из наиболее важных цитокинов для развития Т-клеточного иммунного ответа. В организме он выделяется CD4 Т-клетками и некоторыми антиген-презентирующим и клетками при появлении инфекции в организме, и являются необходимым сигналом для активации Т-лимфоцитов. Это небольшой белок, состоящий из 133 а. к., действующий в виде мономера и имеющий малое время жизни в кровотоке. На Т-клетках имеется рецептор к нему, состоящий из 3 субъединиц. Субъединица у рецептора (CD 132) является общей для многих рецепторов цитокинов, например для рецепторов к IL-4, IL-7, IL-9 и IL-15. Эта субъединица экспрессируется на многих клетках иммунной системы, в том числе на большинстве В- и Т-лимфоцитов, ЕКК клетках, нейтрофилах и тучных клетках. Она способна передавать сигнал от IL-2 и самостоятельно, но имеет очень низкую афинность взаимодействия с цитокином. р субъединица (CD 122) экспрессируется на ЕКК клетках и покоящихся Т-лимфоцитах и принадлежит к семейству фибронектиновых генов 3 типа. При совместной экспрессии двух субъединиц афинность взаимодействия с IL-2 повышается, но остаётся низкой. Однако этого бывает достаточно для активации клеток, а субединица рецептора (CD25) экспрессируется на активированных Т- и В-лимфоцитах и на моноцитах. Её афинность к цитокину намного выше, поэтому активированные Т-клетки пролиферируют даже в присутствии малых количеств IL-2. Интересно, что субпопуляция CD25 и CD4 позитивных Т-лимфоцитов, имеющаяся в организме в отсутствие иммунной реакции, ответственна за подавление аутореактивных Т-лимфоцитов и контролирует аутоиммунные процессы. (35)
ЛАК клетки принципиально отличаются от ЕКК, так как они способны лизировать как ЕКК-чувствительные, так и ЕКК-резистентные клетки (27).Нельзя отнести ЛАК клетки и к ЦТЛ, действие которых ограничено белками главного комплекса гистосовместимости (27). ЛАК клетки обладают сильно развитой гранулярной системой. Морфологически и фенотипически они подобны большим гранулярным лимфоцитам, которые, в свою очередь, являются гетерогенной популяцией (27).
Выявлена зависимость экспрессии маркеров на поверхности ЛАК клеток от времени инкубации с большими дозами (1000 ед.) интерлейкином-2. На 3-4 сутки инкубации экспрессируются поверхностные антигены CD 16+, CD8+, CD3-, характерные для естественных киллерных клеток, на 6-7 сутки - CD3+, CD8+, CD16-, характерные для цитолитических Т-лимфоцитов. (36-39)
Изменение фенотипа вызывает изменение других параметров: цитолитической активности, специфичности к мишеням, секреции белков, обладающих цитотоксическим действием. Было показано, что цитолитическая активность ЛАК клеток значительно изменяется от времени инкубации с интерлейкином-2 (рис. 1), проявляя два максимума цитолитической активности, коррелирующие с изменением фенотипа ЛАК клеток.(40-41) Таким образом, ЛАК клетки представляют собой гетерогенную популяцию клеток, изменяющей свой фенотип и цитотоксичность в зависимости от времени инкубации с интерлейкином-2.
Характеристика механизмов цитотоксичности ЛАК клеток
При инкубации ЛАК клеток с трансформированными клетками К-562 смерть клеток наблюдается уже после 3 часов совместной инкубации. На рис.3 приведена активность ЛАК-клеток по отношению к клеткам-мишеням, содержащим и не содержащим Fas-рецептор на цитоплазматической мембране. Можно видеть, что не содержащие Fas клетки линии L-929 (рис. 3.2) лизируются в значительно меньшей степени, чем содержащие Fas-рецептор клетки линии К 562 Активность ЛАК клеток по отношению к Fas содержащим клеткам практически полностью подавлялась антителами к Fas L. Эти результаты свидетельствуют о том, что при контакте ЛАК клеток с клетками мишенями на мембране лимфоцитов активируется Fas L, индуцирующий апоптоз в чувствительных клетках.
Секреторные механизмы лизиса выявляются после длительной инкубации ЛАК-клеток с клетками — мишенями (18 ч) и обусловлены выделением ЛАК-клетками в зону контакта растворимых цитотоксических белков (99). Обычно в литературе секреторный механизм лизиса связывается с экзоцитозом лимфоцитами в зону контакта цитолитических гранул, содержащих специфические протеазы - гранзимы и порообразующий белок -перфорин (100). Из приведенных на рис.4 результатов можно видеть, что гранзимы действительно присутствуют в супернатанте ЛАК-клеток, тогда как перфорин, по-видимому, не секретируется ЛАК-клетками в данном случае.
Свойственная перфорину гемолитическая активность не была зарегистрирована, что коррелирует с литературными данными, свидетельствующими об активации перфорина в ЛАК-клетках на уровне транскрипции, а не трансляции (101).Секреторный механизм лизиса не ограничивается экзоцитозом гранул, как видно из результатов, приведенных на рис. 5. Цитотоксическая активность супернатанта ЛАК-клеток практически не снижается при связывании экзогенного кальция в присутствии 4 мМ EGTA, блокирующего экзоцитоз (рис. 5). В то же время активность гранзимов в супернатанте ЛАК-клеток в присутствии 4 мМ EGTA (рис. 4,2) составляла не более 5% от исходной, что очевидно связано с уменьшением секреции гранулярных белков.
В литературе принято считать, что цитотоксические белки в основном активируются на мембране средних и малых лимфоцитов, а цитотоксичность больших гранулярных лимфоцитов преимущественно связана с экзоцитозом цитолитических гранул (102). Мы показали, что ЛАК-клетки, среди которых наибольшую активность проявляют большие гранулярные лимфоциты, могут осуществлять, как контактный путь лизиса, так и секрецию цитотоксических белков, не заключенных в цитолитические гранулы. Было решено проверить, поступают ли эти белки во внеклеточное пространство путем непрерывной секреции через аппарат Гольджи. Это предположение согласуется с имеющимися в литературе электронномикроскопическими исследованиями, свидетельствующими о гипертрофии и активации аппарата Гольджи как в малых, так и в больших гранулярных лимфоцитах и о перемещении комплекса Гольджи в зону контакта с клетками-мишенями (103). Чтобы проверить, участвует ли в секреции комплекс Гольджи, мы использовали ингибитор Брефелдин А -антибиотик, блокирующий транслокацию белков в аппарат Гольджи.. В присутствии 5 мг/мл Брефелдина А лимфоциты не секретировали цитотоксических белков, как видно на рисунке 5. Цитотоксическая активность кондиционной среды ЛАК клеток снижалась до уровня спонтанной гибели раковых клеток. Таким образом, можно сделать выводы о том, что секреция цитотоксических белков ЛАК клеток проходит через аппарат Гольджи. Для ЛАК клеток нами было также показано, что выделение в супернатант цитотоксических белков зависит от взаимодействия FasL на поверхности лимфоцитов с Fas-рецептором на мембране клеток-мишеней. Супернатант ЛАК клеток полностью неактивен, если получать его в присутствии антител к Fas-рецептору .(рис.5) По-видимому, FasL-Fas взаимодействие играет важную роль в индукции секреции других цитотоксических белков.
Электрофорез и Western блот
Образцы, подвергшиеся иммунопреципитации наносили на электрофорез в 20-50 мкл буфера для нанесения (0,063 М Tris НС1 рН 6.8, 5% Р-меркаптоэтанол, 2% SDS, 10% глицерол), использованного для элюции иммунореактивного материала. Лиофилизованные образцы растворялись в 20-50 мкл буфера для нанесения. Супернатанты клеток, а также при превышении объема исследуемого материала 25 мкл, образцы осаждали 70% от насыщения сульфатом аммония. После центифугирования 20 минут при 14 000 об/мин, белковый осадок растворяли в 20-50 мкл буфера для нанесения. Перед нанесением на электрофорез образцы денатурировали кипячением в течение 5 минут. Электрофорез в SDS/PAGE и электроперенос: Разделение белков проводилось в денатурирующем 10-15 % SDS-полиакриламидном геле (толщина 0,75 мм) по Лэммли (105) в камере для вертикального электрофореза (Hoefer Scientific). Состав электродного буфера: 25 мМ Tris НС1 рН 8.3, 0,192 М глицин, 0.1% SDS. Электрофорез осуществляли при постоянном токе: 20 мА в концентрирующем геле, 25 мА - при разделении белков. Длина разделяющего геля 7 см. Составы гелей: В качестве стандартов молекулярных весов использовались LMW Calibration Kit for SDS electrophoresis (Amersham Biosciences). После окончания гель-электрофореза белки в геле окрашивали либо переносились на мембрану. Окрашивание осуществляли водным раствором 0.25% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Serva), содержащим 40% этанола, 7% уксусной кислоты в течение 1 часа или в течение ночи, затем гель несколько раз отмывали раствором 40% этанола, 7% уксусной кислоты для выявления полос белков.
Электроперенос осуществляли на мембрану PVDF (Hibond-P, Amersham Biosciences), предварительно смоченную в метаноле. Перенос проводили в аппарате для полусухого электроблоттинга Hoefer SemiPhor (Pharmacia Biotech) при постоянном токе 100 мА в течение 1 часа в Трис-глициновом буфере (20 мМ Tris, 0.2 М глицин, рН 8.5), содержащем 20 % метанола, или в буфере 10 мМ CAPS рН 11 с 10% метанола. Вестерн блот анализ. После электропереноса мембраны либо окрашивали, либо помещали в блокирующий раствор для последующего иммуноблоттинга. Окрашивание осуществляли двумя способами: раствором 0,1% Coomassie G-250, содержащим 50% метанола в течение 5 минут с последующей отмывкой водным раствором, содержащим 50% метанола, 5% уксусной кислоты и промывкой водой; раствором PONSO (Roanal), содержащим 5% уксусной кислоты в течение 5 минут с последующей отмывкой водой.
Вестерн блот анализ проводили по стандартной методике, рекомендуемой фирмой изготовителем мембраны и набора реагентов для анализа (Amersham Biosciences). Мембраны, содержащие исследуемые образцы, блокировали в буфере PBS (PBS + 0,05% Tween-20 (Loba Chemie), содержащем 1-5% BSA или нежирного молока в течение ночи. После трехкратной пятиминутной отмывки в PBS от блокирующего буфера мембраны инкубировали с поликлональными антителами кролика к рекомбинантному Tag7 мыши, рекомбинантному Hsp70 человека (разведение 1:10 000 в буфере PBS) в течение 1 часа. После трехкратной промывки мембран PBS их инкубировали в течение 1 часа со вторичными антителами козла к иммуноглобулинам кролика (разведение 1:10 000), конъюгированными с пероксидазой хрена. После трехкратной промывки мембран PBS, и однократной Н20 детекцию проводили с помощью люминесцентной ферментативной реакции, используя набор реагентов ECL+ и фотопленку Hyper Film (Amersham Biosciences), согласно рекомендациям фирмы изготовителя. Масс-спектрометрический анализ. Необходимые полосы белков вырезались из электрофоретического геля после 20 минутного вымачивания в воде и разрезались на мелкие кубики 1 мм х 1 мм. Промывка геля от SDS и кумаси: гель заливался двумя объемами 50% ацетонитрила на 15 минут. Гель обесцвечивался. Если этого не происходило, тот операция повторялась. Жидкость удалялась, и гель заливался 100% ацетонитрилом. При этом гель сжимался и полностью обесцвечивался. Удалялся ацетонитрил и гель размачивался в 0ДМ гидрокарбонате аммония. Через 5 минут (после набухания) добавлялся равный объем 100% ацетонитрила. Жидкость удалялась и гель сушился на SpeedVac 15 минут (до полного высыхания). Восстановление и алкилирование: Восстановление S-S связей проводилось в буфере 10 мМ DTT, 0,1 М гидрокарбоната аммония 45 минут при 56С. Жидкость удалялась, а гель охлаждался до комнатной температуры. Алкилирование проводилось в 55 мМ йодацетамида 0,1 М гидрокарбоната аммония 30 минут в темноте при комнатной температуре. Удалялся раствор, а гель дважды промывался ацетонитрилом/гидрокарбонатом аммония как описано выше. Гель высушивался на SpeedVac 15 минут. Трипсинолиз белков в геле: Высушенные кусочки геля заливались буфером для гидролиза (40 мкл): 50 мМ гидрокарбоната аммония, 5 мМ хлорида кальция, 12,5 мкг/мл трипсина. Реакция проводилась 45 минут при 4С. Удалялись остатки буфера, гель заливался 20 мкл 50 мМ гидрокарбоната аммония, 5 мМ хлорида кальция и оставлялся на ночь при 37С. Экстракция пептидов из геля: Кусочки геля заливались 30 мкл 25 мМ гидрокарбоната аммония, инкубировались 15 минут. Добавлялся равный объем (30 мкл) 100% ацетонитрил. Инкубировалось 15 минут. Затем жидкость удалялась. Пептиды экстрагировались дважды 5% муравьиной кислотой в течение 5 минут. Пептиды высушивались на SpeedVac. Пептиды растворялись в 3-5 мкл воды и высушивались на металлической подложке, затем на высохшую каплю наносилось 3-5 мкл матрикса DHB и высушивалось на воздухе.
