Содержание к диссертации
Введение
Часть I Обзор литературы 13
Глава 1 Типы клеточной смерти. Внутриклеточные посредники регуляции жизнеспособности клеток.
1.1) Некроз и апоптоз 13
1.2) Регуляция апоптоза. Семейство белков Вс1-2 17
1.3) Роль белка Р53 при апоптозе 20
1.4) Сигнальная функция внутриклеточных ионов Саг* 21
1.5) Сигнальная функция активных форм кислорода, окислительный стресс в мозге 23
1.6) Серин-треониновые протеинкиназы (MAPKs, РКА, РКВ, РКС) 3 30
Глава 2 Na/K-АТФаза и глутаматные рецепторы
2.1) Na/K-АТФаза как ионный насос и участник сигнальных каскадов 36
2.2) Рецепторы глутаматергической системы 47
2.3) Функциональная взаимосвязь между глутаматными рецепторами и Na/K-АТФазой 53
Глава 3 Биологические модели, использованные в работе
3.1) Клеточная культура нейробластомы человека SH-SY5Y 55
3.2) Линия мышей с ускоренным старением SAMP 57
Часть II Материалы и методы 60
1) Культура клеток нейробластомы человека SH-SY5y 60
2) Получение суспензии выделенных нейронов быстростареющих мышей SAMP 61
3) Определение нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR) 62
4) Приготовление клеточных лизатов 66
5) Определение белка в клеточных лизатах 67
6) Разделение белков электрофорезом и Вестерн блоттинг 68
7) Определение уровня внутриклеточного кальция, активных форм кислорода
и типа клеточной смерти методом проточной цитометрии 71
8) Статистическая обработка данных 79
Часть III Результаты 80
Глава 1 Участие Na/K-АТФазы в сигнальных механизмах клеток нейробластомы человека SH-SY5Y 80
1) Определение изоформного состава Na/K-АТФазы в клетках SH-SY5Y 80
2) Уровень внутриклеточного кальция и АФК в клетках нейробластомы SH-SY5Y при действии уабаина 81
3) Активация уабаином внутриклеточных белков-посредников в клетках нейробластомы
SH-SY5Y 84
3.1) Активация уабаином р42/44 МАРК (Erkl/2) протеинкиназы 85
3.2) Активация протеинкиназы В (РКВ, Акт киназа) под действием уабаина 86
3.3) Активация уабаином про- и антиапоптозных белков 87
3.4) Определение типа клеточной смерти при действии уабаина на клеточной культуре РС-3 94
3.5) Уабаин препятствует дифференцировке клеток нейробластомы 5Н-5У5У под воздействием ретиноевой кислоты (РК) 97
Глава 2 Сигнальные механизмы с участием NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы человека БН-5У5У 98
1) Определение субъединиц NMDA-рецепторов в клетках SH-SY5Y 98
2) Действие NMDA на уровень внутриклеточного кальция и АФК 99
3) Активация протеинкиназ р42/44 МАРК и РКВ при действии NMDA 101
Глава 3 Взаимодействие ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов в нейронах мышей линии SAMP 103
Часть IV Обсуждение 107
1) Участие Na/K-АТФазы в сигнальных механизмах клеток 6Н-5У5У 107
2) Сигнальные механизмы с участием NMDA-рецепторов в клетках 5Н-5У5У 117
3) Взаимодействие ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов в нейронах мышей линии SAMP 120
Часть V Выводы 122
Часть VI Список литературы 124
Слова благодарности (Acknowledgments) 143
- Регуляция апоптоза. Семейство белков Вс1-2
- Определение нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR)
- Уровень внутриклеточного кальция и АФК в клетках нейробластомы SH-SY5Y при действии уабаина
- Сигнальные механизмы с участием NMDA-рецепторов в клетках 5Н-5У5У
Введение к работе
В клеточной биологии в настоящее время отмечается активный интерес к изучению молекулярных механизмов передачи информации из внешней среды во внутриклеточное пространство, регулирующих клеточный метаболизм и жизнеспособность. Весь комплекс молекулярных событий, происходящих в клетке после связывания сигнальной молекулы со своим рецептором, составляет предмет изучения биохимической науки, посвященной клеточной сигнализации (cell signaling). Особенно активно эта область стала развиваться с 50-х годов XX века, когда произошло открытие Сазерлендом циклического монофосфата (сАМР), отмеченное Нобелевской премией. Эта работа привела впоследствии к созданию теории вторичных мессенджеров (посредников) и представлению о сигнальных каскадах реакций. Изучение клеточной сигнализации лежит в основе современной эндокринологии, иммунологии, нейрохимии и других наук, и имеет целью не только разобраться в глубинных процессах функциональных клеточных изменений, но и научиться управлять этими процессами.
Сигнальные молекулы могут иметь разное строение и происхождение, однако все они работают по единому принципу, связываясь со своим специфическим рецептором по аналогии «ключа» и «замка». Поэтому они могут действовать только на те клетки, и только в том месте, где есть их специфический рецептор. Рецепторы в большинстве случаев представляют собой интегральные мембранные белки, поли пептидная цепь которых пронизывает толщу мембраны, поэтому сигнальные молекулы, включая большинство гормонов (за исключением стероидных и тиреоидных, действующих через ядерные рецепторы), как правило, не проникают внутрь клетки, а специфически взаимодействуют с рецепторами, локализованными во внешней клеточной мембране.
В неврологии с пониманием механизмов внутриклеточной сигнализации связывают надежды на лечение таких заболеваний как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, хорея Гентингтона и многих других. Изучение сигнальных
механизмов в мозге должно основываться на знании специфических функций и
особенностей метаболизма нейрональной клетки. Как известно, основной функциональной особенностью неирональных клеток является способность к электрическому возбуждению, а биохимически нервные клетки и мозг в целом отличаются, например, высокой интенсивностью окислительных процессов и большим потреблением энергии.
В основе электрического возбуждения нервной клетки лежит существование электрохимического градиента, вызванного неравномерным распределением ионов Na+, К+ и Са2* по обе стороны клеточной мембраны. Деполяризация мембраны приводит к открыванию ионных каналов, и ионы Na+ устремляются внутрь клетки, а ионы К+ - устремляются наружу (Шмидт Т., 1996). Очевидно, что способность нервной клетки к возбуждению ограничивалась бы моментом, когда
ионные концентрации внутри и снаружи клетки выровняются, если бы не
ї существовало механизма, восстанавливающего ионный градиент и позволяющий
нервной клетке функционировать длительное время. Такой механизм оказался представлен мембранным ферментом Na/K-АТФазой, открытый в 1957 году J. Skou (Skou 1957). Работа Na/K-АТФазы заключается в одновременном переносе ионов Na+ изнутри клетки наружу и ионов К+ снаружи во внутриклеточное пространство с затратой энергии АТФ - поэтому Na/K-АТФазу называют также ионным насосом. Однако впоследствии выяснилось, что Na/K-АТФаза способна не только перекачивать ионы, но и передавать информационные сигналы внутрь клетки, являясь рецептором для группы кардиотонических стероидов (КТС) типа уабаина (Scheiner-Bobis G. & Schoner W., 2001; Xie Z. & Askari A., 2002). Существует 2 изоформы фермента, различающиеся по чувствительности к КТС -чувствительные и резистентные к ним.
КТС синтезируются в организме в небольших количествах, действуя на высокочувствительные к ним изоформы Na/K-АТФазы (а2 и аЗ), они запускают сигнальные механизмы без изменения ионного гомеостаза клетки (Scheiner-Bobis, Schoner, 2002). Эти сигнальные механизмы реализуются в активации транскрипционных факторов NF-кВ и АР-1, экспрессии генов и синтезе белка
(Peng, 1996; Huang, 1997). Сигнальные свойства Na/K-АТФазы открыты недавно и к настоящему моменту изучены далеко не полностью.
Электрохимический градиент, создаваемый Na/K-АТФазой, используется системами нейромедиаторов, в частности, глутаматергической системой, для инициации процессов возбуждения или торможения. Глутамат и связанная с ним система глутаматных рецепторов инициируют возбуждающие стимулы, ответственные за распознавание объектов, анализ и запоминание информации, обучение и выработку стратегии поведения. В глутаматергических синапсах обнаруживается более десяти различных рецепторов с разными свойствами и различным сродством к глутамату. Предполагается, что дифференцированная активация рецепторов при высвобождении глутамата лежит в основе синоптической пластичности, играющих важную роль как в процессах обучения, так и в развитии двигательных нарушений при некоторых патологиях, сопровождающихся развитием окислительного стресса (например, болезнь Паркинсона или хорея Гентингтона).
Глутаматные рецепторы по современной классификации делятся на 2 подтипа: ионотропные (iGluR) и метаботропные (mGluR). Первые из них связаны с ионными каналами, активация которых обеспечивает электрическую активность нейронов, а вторые передают информацию на внутриклеточные сигнальные системы, что приводит к модификации клеточного метаболизма.
Особенно важную роль в жизнедеятельности нейронов играют глутаматные рецепторы NMDA-класса. NMDA-рецепторы в норме участвуют в процессах долговременной потенциации и запоминания. При чрезмерной активации NMDA-рецепторов наблюдается избыточная продукция активных форм кислорода (АФК) и развитие окислительного стресса, в связи с чем глутамат относят к экзайтотоксическим соединениям.
По ряду биохимических особенностей мозг особенно чувствителен к окислительному стрессу (Halliwell, Gutteridge, 1999). Так, известно, что при
ишемии в тканях мозга нарастает концентрация свободного глутамата, что приводит к длительной активации ионных каналов, высвобождению ионов кальция из внутриклеточных депо, а затем и к гибели клетки. Такой механизм гибели клеток характерен как для ишемии мозга, так и для многих видов травмы и эпилепсии.
Метаботропные глутаматные рецепторы делятся на 3 группы (mGluR I, m6luR II и mGluR III), отличающиеся тем, с какими б-белками в мембране они связаны и, соответственно, какие сигнальные системы в клетке включаются лри их активации. В настоящее время накоплен ряд данных, свидетельствующих о модулирующей роли mGluRs в функционировании экзайтотоксических медиаторов, в частности для разных групп mGluRs показана усиливающая и защитная роль при состояниях окислительного стресса, вызванного внешними факторами.
В последнее время получен ряд данных, свидетельствующих о функциональных взаимодействиях различных глутаматных рецепторов друг с другом и с Na/K-АТФазой через внутриклеточные белки-посредники и активные формы кислорода. Было установлено, что активация нейронов повышающимися концентрациями NMDA приводит к прогрессивному ингибированию Na/K-АТФазы, которое может предотвращаться антагонистом NMDA-рецепторов МК-801, а в присутствии цистеина утраченная активность Na/K-АТФазы может быть восстановлена.
Известно, что активация NMDA-рецепторов приводит к входу в нейрон ионов кальция и к активации протеинкиназы С (РКС) (Boldyrev, 2002). Na/K-АТФаза является одной из мишеней этой киназы, причем более чувствительной к действию РКС является уабаин-резистентная аі-изоформа, и в результате ее фосфорилирования чувствительность Na/K-АТФазы к уабаину повышается (Fedorova, 2003). Эндогенный уабаин-подобный гликозид препятствует связыванию МК-801 с NMDA-рецепторами (kernes 2001). Показано, что известный токсический эффект уабаина не связан с вызываемой им деполяризацией
мембраны или снижением ионных градиентов, а отражает непосредственное участие Na/K-АТФазы в антиоксидантной защите клеток (Veldhuis2003; Boldyrev et al, 2003). Эти и другие факты подтверждают наличие взаимодействия Na/K-АТФазы и глутаматных рецепторов NMDA-класса и вовлечение Na/K-АТФазы в систему передачи информации через клеточную мембрану внутрь клетки. Возможно, управляя сигнальными функциями Na/K-АТФазы, можно научиться снижать окислительный стресс, вызванный гиперактивацией NMDA-рецепторов.
Существующие представления о роли глутаматергической системы и Na/K-АТФазы при передаче информационных сигналов и активаторов внутриклеточных сигнальных каскадов с участием протеинкиназ, ионов кальция и активных форм кислорода послужили теоретической основой для настоящей работы. Она посвящена исследованию сигнальных функций Na/K-АТФазы и глутаматных рецепторов и их функциональной взаимосвязи.
В работе использованы 2 биологические модели: культура клеток нейробластомы человека 5Н-5У5У и первичная культура изолированных нейронов мозжечка 2-недельных мышей линии SAtA? (Senescence Accelerated Шее, prone). В некоторых опытах на клетках РС-3 проводилась оценка типа клеточной смерти при ингибировании Na/K-АТФазы уабаином. Выбор в качестве объекта клеточной культуры нейробластомы БН-бУбУ связан с тем, что она является распространенной моделью нервных клеток и часто используется в нейрохимической литературе. Опухолевые клетки являются удобным объектом для изучения как имеющие нервное происхождение - именно такой культурой и является клеточная линия нейробластомы 5Н-5У5У. Второй объект исследования - животные 5АМР - характеризуются повышенным стационарным уровнем АФК (окислительный стресс), поэтому экзайтотоксические механизмы в их мозге представлены в наиболее выраженном виде. Мы предполагали, что сопоставление данных, полученных на культуре клеток и на свежевыделенных нейронах позволит получить более объективную информацию о реальных процессах клеточной сигнализации в нервной ткани.
В соответствии с этим, первая часть работы посвящена изучению сигнальных каскадов с участием Na/K-АТФазы и глутаматных рецепторов NMDA-класса на клеточной культуре нейробластомы 5Н-5У5У. Вторая часть работы выполнена на нейронах быстростареющих мышей и посвящена взаимодействию ионотропных NMDA-рецепторов с различными классами метаботропных глутаматных рецепторов.
Целью исследования явилось изучение участия Na/K-АТФазы, глутаматных рецепторов NMDA-класса и метаботропных глутаматных рецепторов в проведении внутриклеточных сигналов; выяснение их роли в регуляции клеточного метаболизма и значения для жизнеспособности
неирональнои клетки, а также выявление механизмов взаимодействия этих
систем.
Задачи исследования:
Определение изоформного состава Na/K-АТФазы и субъединиц NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы SH-SY5Y.
Оценка влияния Na/K-АТФазы и NMDA-рецепторов на внутриклеточный уровень ионов кальция и активных форм кислорода (АФК) в клетках нейробластомы SH-SY5y.
Выявление внутриклеточных белков-посредников, участвующих в механизмах клеточной сигнализации, реализующихся при участии Na/K-АТФазы и NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы SH-SY5Y.
Оценка жизнеспособности клеток нейробластомы SH-SY5Y при блокаде Na/K-АТФазы уабаином и действии токсических концентраций NMDA.
Выявление типа клеточной смерти (некроз или апоптоз) при ингибировании Na/K-АТФазы уабаином на клеточной линии РС-3.
6) Сопоставление уровня АФК и темпов гибели нейронов мозжечка быстростареющих мышей линии SAMP (Senescence Accelerated Mite) при активации глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов.
Научная и практическая новизна исследования:
Исследования сигнальных процессов, в которые вовлекаются Na/K-АТФаза и глутаматные рецепторы, на изучаемых объектах до сих пор не проводились. Представленные данные показывают, что Na/K-АТФаза принимает непосредственное участие в реализации внутриклеточной сигнализации в клетках
неиробластомы SH-SY5y в качестве регулятора клеточного метаболизма и
жизнеспособности этих клеток. В клеточной культуре неиробластомы 5Н-бУ5У присутствуют все 3 изоформы каталитической субъединицы Na/K-АТФазы. При ингибировании АТФазы уабаином наблюдается увеличение уровня АФК и внутриклеточных ионов кальция, которые, вероятно, участвуют в передаче сигналов в качестве вторичных мессенджеров. На клетках нервного происхождения впервые получены данные об активации Na/K-АТФазой сигнальных путей с участием протеинкиназ МАРК и РКВ. Впервые обнаружено, что действие уабаина приводит к фосфорилированию белка Bad и подавлению его проапоптозного действия. Одновременно выявлена активация і ряда внутриклеточных посредников, участвующих в развитии апоптоза в этих клетках -снижается доля активных (фосфорилированных) белков Вс1-2 и Bcl-xL, подавляющих выход цитохрома С из митохондрий; в цитоплазме клеток появляется цитохром С, активируется каспаза 3 и белок р53. Два противоположных пути регуляции характеризуются различной чувствительностью к уабаину: первый выявляется при низких, а второй - при высоких (1 мкМ и выше) концентрациях этого лиганда.
Показано, что в клетках неиробластомы 6Н-5У5У присутствует NR1 субъединица NMDA-рецепторов, но инкубация клеток с NMDA не приводит к увеличению уровня АФК и ионов Са2+. Тем не менее, в этих условиях
активируются МАРК и РКВ киназы. Возможно, что именно NR1 субъединица NMDA-рецепторов ответственна за их сигнальную функцию.
Данные, полученные на мышах линии SAMP, демонстрируют регулирующее действие метаботропных глутаматных рецепторов на NMOA-рецепторы, выражающееся в том, что метаботропные рецепторы I группы ослабляют, а III группы усиливают токсическое действие NMDA.
Обнаруженные закономерности помогают уточнить молекулярные механизмы сигнальной функции Na/K-АТФазы и рецепторов глутаматергической системы в нервных клетках.
Часть і Обзор литературы
—--—-—————~~^^ _____—____________^^^—
Регуляция апоптоза. Семейство белков Вс1-2
Активация каспазного каскада может осуществляться несколькими способами. Эволюционно более молодой путь регуляции апоптоза, определяющий взаимные влияния клеток, опосредуется «рецепторами смерти» через адапторные белки, в частности белок FADD (белок, содержащий Fas-associated death domain) {Рис. 1, слева). Связывание лиганда CD95 с «рецептором смерти» приводит к формированию комплекса, который, взаимодействуя с адапторным белком FADD, активирует каспазный каскад. Путь, индуцируемый внутриклеточными стрессорными сигналами, является более древним - в данном случае происходит активация каспазы 9 комплексом, состоящим из белка Apaf-1 (Apoptotic protease-activating factor 1) и электронного переносчика цитохрома С, высвобождающегося из митохондрий при индукции апоптоза; этот путь регулируется белками семейства Вс1-2 [Рис. 1, справа}.
Митохондриальный путь и путь «рецептора смерти» сходятся на уров не кас-пазы-3, которая является основным исполнителем программы апоптоза. Появление каспазы-3 блокируется белками IAPs, которые в свою очередь блокируются выделяющимся из митохондрий белком Smac/DIABLO. Взаимодействие мито-хондриального пути и пути «рецептора смерти» обеспечивается проапоптозным белком Bid. Каспаза-8 расщепляет Bid, что приводит к усилению его проапоп-тозной активности, дрейфу к митохондриям и высвобождению цитохрома С.
Митохондриальный путь (Рис. 1, справи сводится к высвобождению цитохрома С из митохондрий, снижению митохондриального мембранного потенциала за счет возникновения пор в митохондриальной мембране и усиленной продукции АФК митохондриями (Уапд et al, 1997; Zamzami et al, 1995). Под действием избыточных АФК во внутренней мембране митохондрий образуются неспецифические каналы с высокой проницаемостью для ионов, в результате чего матрикс митохондрий набухает, а внешняя мембрана разрывается. Митохондриальный путь активируется как при внешних воздействиях, так и при нарушениях ДНК. Передача сигнала происходит с участием фактора Apaf-І после его взаимодействия с цитохромом С, выделяющимся из поврежденных митохондрий.
Точный механизм выхода цитохрома С из митохондриального пространства в цитозоль неизвестен, однако установлено, что ключевая роль в этом процессе принадлежит белкам семейства Вс1-2 (обнаруженных впервые в культуре «B-cell lymphoma» 2 типа), некоторые из них закреплены в митохондриальной мембране, а другие циркулируют между мембраной и цитозолем. У млекопитающих выявляется, по меньшей мере, 20 белков семейства Вс1-2, каждый из которых содержит по крайней мере одну область гомологии с Bcl-2 (ВН). В семейство входят как антиапоптозные белки (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Al и Mcll), так и проапоптозные факторы типа Bid, Вах и Bad. Кажется, будто члены Bcl-2 семейства большую часть времени стараются блокировать активность друг друга. Взаимодействуя с другими белками, они способны формировать множественные гетеродимеры. Вопрос о клеточной смерти сводится к балансу активности про- и антиапоптозных белков, смещение которого будет определять выбор клетки «остаться в живых» или погибнуть по пути апоптоза.
Полагают, что функции Вс1-2-подобных белков заключаются в сохранении целостности митохондрий, препятствии изменению митохондриального потенциала и появлению митохондриальных пор (тем самым, препятствуя продукции АФК) и сохранении «в запертом» состоянии цитохрома С. Также показано, что Bcl-xL напрямую взаимодействует с /\paf-l, таким образом, подавляя его связывание с каспазой-9 и формирование апоптосомы.
При развитии апоптоза белки Вах и Вак, относящиеся к семейству Вс1-2, формируют димеры с ВсІ-2 в митохондриальнои мембране - эти комплексы и включаются в формирование больших мембранных пор в митохондриях, через которые проходит белок митохондриального матрикса цитохром С (Toescu, 1 2000). Формирование пор обусловлено быстрым падением мембранного потенциала и «набуханием» органелл. Показано, что избыточная экспрессия Bcl 2 предотвращает формирование пор в митохондриях, высвобождение цитохрома С и усиливает способность митохондрий к захвату кальция (Murphy et al, 1996). В цитоплазме клеток в нормальном состоянии в неактивной форме находится проапоптозный член семейства Вс1-2 - фосфорилированный белок Bad, образуя комплекс с белком-шапероном 14-3-3. Ассоциация Bad с шапероном 14-3-3 защищает его от дефосфорилирования и препятствует миграции к митохондриальнои мембране (Yaffe et al, 1997). При стимуляции апоптоза Bad дефосфорилируется и связывается с доменом ВНЗ белка Bcl-xL на внешней митохондриальнои мембране, тем самътм, ингибируя его антиапоптозное действие (снимается блокирующее действие на выход цитохрома С) (Zha et al, 1996, 1997). После этого активируется мембранный проапоптозный белок Вах, открывая путь ионам внутрь митохондриального пространства. В это же время, из митохондрий через образовавшиеся в мембране поры в цитоплазму выходит цитохром С и связывается в апоптосомный комплекс с адаптерным белком Apaf 1, который в свою очередь активирует прокаспазу 9.
Еще один важный белок, включающий программу развития апоптоза в клетках с генетическими дефектами, - опухолевый супрессор р53, который получил образное название «страж генома» за его исключительно важную роль в обеспечении сохранения правильной генетической информации в клетке. является ключевым компонентом некоторых событий клеточного цикла, он активируется в ответ на разные неблагоприятные воздействия, в том числе и те, что приводят к генетическим нарушениям - разрывы ДНК, недостаток нуклеотидов, разрушение микротрубочек, отсутствие сегрегации хромосом в митозе или ее неправильное завершение, приводящее к образованию микроядер. При этом сенсорами повреждений ДНК являются, очевидно, ДНК-протеинкиназа и/или белок ATM (Атахіаeleangioectasia Mutated), обладающие способностью, с одной стороны, распознавать свободные концы ДНК, а с другой, -фосфорилировать р53 по Ser-15, препятствуя тем самым его связыванию с белком Mdm2, последующему транспорту из ядра и деградации. Сенсоры других вышеупомянутых аномалий и пути передачи при них сигнала к р53 пока не ясны (Копнин, 2000; Чумаков, 2000).
Одним из следствий активации р53 является изменение экспрессии регулируемых им генов, таких как Вах, Вс1-2 и других, контролирующих апоптоз, и p21WAF1, 6ADD45 (бгои/th Arrest and DNA Damage-induced), экспрессия которых приводит к остановке клеточного цикла. В результате клетка, в которой уже произошли или только могут произойти генетические изменения, либо гибнет в результате индукции апоптоза, либо останавливается в 61- или 62-, а иногда в 5-фазе клеточного цикла. Выбор между двумя возможными реакциями клетки на активацию р53 - апоптозом и остановкой клеточного цикла - зависит от множества факторов: гистогенетического типа клеток (например, в нормальных фибробластах, как правило, наблюдается остановка клеточного цикла, тогда как в лимфоцитах - апоптоз), степени активации р53, уровня функциональной активности сигнального пути (Копнин, 2004; Gottlieb, 1998).
Определение нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR)
Культура клеток нейробластомы SH-SY5Y, (АТСС, Manassas, VA), поддерживалась в специальной культуральной среде (медиа-среде) согласно протоколу производителя. Медиа-среда представляет собой смесь 1:1 сред ЕМЕМ, (АТСС), и Ham s F12 (F12K), (АТСС), содержащая 10% сретальной сыворотки телят (Fetal Bovine Serum) и 1% р-ра смеси антибиотиков стрептомицина и пенициллина (100 ед/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина). Клеточная культура поддерживалась в чашках Петри диаметром 10 см или 5 см при температуре 37С и 5% СОг в воздухе. Смена культуральной среды производилась каждые 4-6 дней, эксперименты проводились на 8-11 день после посева.
Для сбора прикрепленных к подложке клеток добавляли 2 мл р-ра трипсина и оставляли на 1-2 мин в термошкафу при 37С. Клетки отрывались от подложки, затем их тщательно суспендировали и считали в камере Горяева. Поскольку данная клеточная культура представляет собой смесь свободно плавающих и прикрепленных к поверхности чашки клеток, то перед «пересеиванием» клеток или перед началом эксперимента для сбора всех клеток среда с плавающими клетками центрифугировалась 1 мин при 3000 об/мин, затем осадок осевших клеток также использовался. Получение суспензии первичной культуры нейронов из мозжечка быстростареющих мышей SAMP
В опытах использовали 10-12-дневных мышей линии SAMP1 (Senescence Accelerated Mice Prone, strain 1), когда у животных еще не проявляются морфологические и поведенческие отклонения от контроля (Takeda, 1994). Первичную культуру нейронов получали из мозжечка с помощью обработки диспазой (Oyama et al, 1996, Sureda et al, 1996; Petrushanko et al, 2006; Boldyrev et al, 2003c). В каждой серии для приготовления суспензии нейронов использовали мозг 3 животных. Выделяли мозжечок, тщательно измельчали на холоду лезвием и переносили в р-р диспазы-коллагеназы (200 ед/мл) на буфере Тироде, содержащем 14,8 мМ NaCl; 0,5 мМ КСІ; 0,2 мМ СаС12(2Н20); 0,1 мМ MgCI2 (6 ИгО); 1 м№ глюкозу; 1 мМ HEPES, рН 7,4. Клеточную ткань оставляли на 30 мин при 37С. После разрушения межнейронных контактов ткань промывали в растворе Тироде, содержащем 0,257о бычьей сыворотки. Затем клетки суспендировали пастеровской пипеткой и пропускали через тефлоновый фильтр диаметром 40 мкм. Полученную суспензию нейронов оставляли для восстановления в растворе Тироде и затем использовали для оценки внутриклеточного уровня АФК в присутствии NMDA, L-AP4 и 3-HPG, предварительно нагружая клетки АФК-чувствительным зондом DCF (100 мкМ) в течение 40 мин и измеряя флуоресцентный сигнал с помощью проточного цитометра (Beckman Coulder). Количество мертвых клеток в нейрональной суспензии измеряли с помощью йодистого пропидия (подробнее см ниже). В опытах использованы NMDA, L-AP4, 3-HPG, PI фирмы "Sigma" (USA), DCF -"Molec. Probes" (USA). Каждый эксперимент был повторен 3-4 раза. Определение нуклеотидньїх последовательностей методом полимеразной цепной реакции (ТТЦР, PCR) І Выделение мРНК Выделение мРНК проводили с помощью набора QIAGEN RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany) согласно протоколу производителя. 1) Образцы клеток неиробластомы бН-бУбУ, закрепленные на поверхности 10 см чашек Петри, удалив клеточную среду, промывали буфером PBS. 2) В чашки Петри с клетками добавляли по смеси 1188 мкл лизис-бусрера (10 мл Трис рН 8.3, 400 мМ ЫаС\, 1-% SDS, 2 мМ ЭДТА) и 12 мкл меркаптоэтанола. Несколько раз пипетировали. 3) Полученные суспензии разделяли на 2 части по 600 мкл и центрифугировали 3 мин при 8000д. 4) Осадок отбрасывали, а к супернатанту добавляли 600 мкл 70% этанола, тщательно перемешивали и частями переносили на колонку QIAshredder (QIAGEN, Germany) для гомогенизации. 5) Прошедшую через мембрану жидкость частями по 700 мкл переносили в 2 мл колонку RNeasy mini column и центрифугировали 15 сек при 6000д. 6) Прошедшую через колонку жидкость отбрасывали и повторяли процедуру со второй частью образца. Затем колонку центрифугировали 15 сек при 6000д с 350 мкл RW1 буфера для промывки. 7) Прошедшую через колонку жидкость отбрасывали и затем прямо на мембрану (RNeasy silica-gel membrane) добавляли специальную микс-смесь, содержащую ДНКазу I и оставляли на столе на 15 мин для деградации ДНК. 8) Снова центрифугировали колонку 15 сек при 6000д с 350 мкл RW1 буфера и отбрасывали прошедшую жидкость и пробирку Эппендорфа, оставляя только колонку. 9) Колонку помещали в новую 2 мл эппендорфовскую пробирку и центрифугировали колонку 15 сек при бОООд с 500 мкл PRE буфера, прошедшую через колонку жидкость отбрасывали.
Уровень внутриклеточного кальция и АФК в клетках нейробластомы SH-SY5Y при действии уабаина
Мы исследовали влияние уабаина на уровень внутриклеточного кальция и активных форм кислорода с помощью проточного цитометра, используя флуоресцентные красители FLUO-3-AM для определения Са2+ и DCF-DA для определения уровня АФК. Достоверность данных проверялась по одномерному непараметрическому критерию ANOVA с применением метода Дунетта (все значения сравнивали с контролем), различия считались достоверными при р 0,05.
Уровень внутриклеточного кальция и АФК в клетках нейробластомы БН-БУбУ определяли после 30 мин инкубации клеток с различными концентрациями уабаина. Максимальная концентрация уабаина составляла 10"5 М, при этом ингибировались и чувствительные, и резистентные изоформы Na/K-АТФазы. Мы обнаружили, что уабаин в концентрациях 10"5 - Ю"6 М вызывал достоверное увеличение уровня внутриклеточного кальция (на 25-30% от исходного уровня), хотя при концентрации уабаина 10"7-10"8 М отличия от контроля были недостоверны (Рис. 25). Для оценки роли внеклеточного кальция в регистрируемом эффекте мы вводили в среду инкубации 1 мМ кальциевого хелатора ЭГТА. Совместное присутствие уабаина и ЭГТА не приводило к повышению уровня ионов кальция внутри клеток, следовательно, кальциевый сигнал в присутствии уабаина был обусловлен поступлением этого иона из внеклеточного пространства. Вероятно, подавление Na/K-АТФазы уабаином приводило к накоплению ионов натрия в клетках и активировало работу Na/Ca-обменника. Блокада Na/K-АТФазы уабаином вызывала и рост внутриклеточного уровня АФК. На Рис. 26 (А, Б) представлена характеристика популяции клеток SH-SY5Y, как она видна на проточном цитометре при измерении уровня АФК. Эта популяция была выбрана с помощью «гейта» среди всех событий, зафиксированных прибором. «Гейтом» охватывалась только та часть, которая содержала целые клетки, что позволяло избавиться от анализа клеточных частей, кусков мембран и пр. Положение «гейта» выбирали при анализе популяции в координатах «FS vs SS» (размер клеток и гранулярность), исходя из известных размеров клеток нейробластомы Шкала абсцисс на Рис. 26 отражает флуоресценцию DCF-DA, которая пропорционально уровню АФК. Уровень АФК оценивали как среднее значение флуоресценции в популяции клеток. Шкала ординат отражает флуоресценцию пропидия иодида (PI), по которой можно судить о количестве мертвых клеток в исследуемой популяции (пропидий проникает сквозь мембранные дефекты некротических клеток и красит ДНК). Видно, что количество мертвых клеток незначительно. Звездочкой помечены данные, достоверно отличающиеся от контроля цитометре (по флуоресценции DCF). Разделение поля на квадранты проведено только для влияние 30-мин инкубации уабаина на уровень АФК. За 30 мин инкубации клеток БН-бУбУ с уабаином наблюдался концентра ционно-зависимый рост уровня АФК {Рис. 26-В). Статистически достоверные отличия от контроля отмечены начиная с концентрации 100 нМ, то есть при концентрации, не вызывающей роста уровня ионов кальция внутри клетки. Максимальное увеличение уровня АФК наблюдалось при действии 10 мкМ уабаина и составляло 50% от контроля. В присутствии кальциевого хелатора ЭГТА изменения уровня АФК были пропорциональны исходным (полученным в отсутствие ЭГТА), таким образом, генерация свободных радикалов исследуемыми клетками в присутствии уабаина имеет Са-независимую природу. Активация уабаином внутриклеточных белков-посредников в клетках нейробластомы SH-SY5Y Активацию (сросфорилирование) белков, являющихся внутриклеточными передатчиками сигнала, мы измеряли методом вестерн-блоттинга, детектируя искомые белки по связыванию со специфическими антителами. Таким способом определялось общее количество искомых белков, а также их фосфорилированная фракция. Мы изучали вовлеченность белков-посредников в реализацию сигнальных механизмов с участием Na/K-АТФазы, инкубируя клетки с разными концентрациями уабаина в течение 30 мин, 6 ч и 24 ч. Через 30 мин инкубации активации внутриклеточных посредников не происходило, тогда как через 6 ч и 24 ч инкубации выявлялось уабаин-зависимое фосфорилирование ряда внутриклеточных белков, свидетельствующее о вовлечении Na/K-АТФазы в процессы внутриклеточной сигнализации. Представлены результаты только для экспериментов с временем инкубации 6 часов. Каждый эксперимент имел не менее 3 повторов, данные на графиках представлены в виде means ± SEM; = р 01,05. Активация уабаином р42/44 МАРК (Erkl/2) протеинкиназы Активация каскада МАР Киназ ассоциируется с ранними стадиями передачи сигнала и является ключевым событием в пролиферации и дифференцировке клеток; этот каскад участвует в регуляции клеточной жизнеспособности (Davis, 1993). Мы установили, что под действием уабаина за 6 ч и 24 ч инкубации происходит активация р42/44 МАРК, наиболее изученного внутриклеточного регулятора. Рис. 27-А демонстрирует детекцию на нитроцеллюлозной мембране суммарного белка (общая р42/44 МАРК), а на Рис. 27-Б представлен сигнал фосфорилированной фракции р42/44 МАРК.
Сигнальные механизмы с участием NMDA-рецепторов в клетках 5Н-5У5У
Инкубируя клетки нейробластомы бН-бУбУ с различными концентрациями уабаина, мы обнаружили рост уровня внутриклеточного кальция и активных форм кислорода, фосфорилирование целого ряда белков, участвующих в проведении внутриклеточных сигналов каскадным способом и связанных с регуляцией жизнеспособности клетки. Все эти данные свидетельствуют о том, что Na/K-АТФаза вовлекается в процессы проведения информационных сигналов в клетках нейробластомы 5Н-бУ5У и ее сигнальные механизмы реализуются с участием вторичных мессенджеров.
Известно, что в возбудимых тканях Na/K-АТФаза экспрессируется в виде нескольких изоформ, различающихся по чувствительности к переносимым ионам, АФК, а также к гормонам и гормоноподобным соединениям, например, к уабаину (Huang et al, 1992; Urayama et al, 1989). Изоформы Na/K-АТФазы no чувствительности к уабаину делятся на 2 типа: чувствительные (а2и аЗ) изосрормы - взаимодействуют с этим лигандом при его концентрации 10 9-10"6 М, и резистентные al изоформы, взаимодействуют с уабаином при его концентрации свыше 10"6 М (Atterwill et al, 1984; Boldyrev, 2003b; Xie et al, 1999). Уабаин-чувствительные изоформы содержат более доступные для модификации SH-группы и окисляются АФК в первую очередь
Методом полимеразной цепной реакции мы показали, что в клеточной культуре нейробластомы БН-бУбУ присутствуют и чувствительные, и резистентные изоформы Na/K-АТФазы. Возможно, что в сигнальном действии Na/K-АТФазы чувствительные и резистентные изоформы играют разную роль.
Ранними событиями в ответ на аппликацию уабаина в клетках нейробластомы БН-бУбУ является рост уровня внутриклеточного кальция и активных форм кислорода. Рост уровня внутриклеточного Са2 и АФК мы обнаружили через 30 мин инкубации клеток с уабаином, однако при этом мы не наблюдали увеличения фосфорилированной фракции внутриклеточных сигнальных белков (типа р42/44 МАРК и РКВ). Согласно данным литературы, на других биологических моделях, и в частности, на культуре сердечных миоцитов крысы (Xie &. Askari, 2002; Scheiner-Bobis, 2003), на клетках метастатической аденокарциномы простаты (McConkey et al, 2000), на эндотелиальных клетках сосудов (Saunders & Scheiner-Bobis, 2004) также обнаруживался рост Са2 и АФК. Источник ионов кальция, появляющихся в цитоплазме, мы изучали с помощью кальциевого хелатора ЭГТА, который, будучи добавлен в культуральную среду, связывает внеклеточный кальций. Обнаружилось, что при ингибировании Na/K-АТФазы кальций попадает в клетку из внешней среды, так как при связывании внешнего кальция ЭГТА роста кальция при аппликации уабаина не наблюдалось. Известно, что уабаин в небольших концентрациях не приводит к заметному смещению Na/K-градиента, но даже небольшого изменения концентрации натрия достаточно, чтобы вызывать накопление ионов кальция внутри клетки за счет работы Na/Ca-обменника. По-видимому, именно этот механизм реализуется в клетках нейробластомы SH-SY5y при ее инкубации с уабаином. Известно, что внутриклеточный кальций (Са2+) в клетке выполняет функции вторичного мессенджера в сигнальных механизмах регуляции (Kometiani et al, 1998; Liu et al, 2000). Например, на миоцитах сердечной мышцы показано, что ионизированный кальций участвует в регуляции Ras/Raf/MEK/MAPK каскада (Haas et al, 2000; Liu et al, 2000; Toescu, 2000). Кальций-зависимые процессы играют важную роль в процессах клеточной жизни или смерти, они участвуют в активации основных участников апоптоза - каспаз, вовлекаются в финальные стадии апоптоза - фагоцитоз и лизис клеток, а также участвуют в неапоптозных механизмах клеточной смерти (Orrenius et al, 2003; Nicotera, 2003). Таким образом, ионизированный кальций в клетке, по-видимому, выполняет функции вторичного 1 мессенджера. Одновременно с ростом кальция, через 30 мин инкубации с уабаином мы регистрировали рост уровня активных форм кислорода. Функции АФК в клетке 108 многочисленны: в низких концентрациях они действуют как сигнальные соединения, а при высоких концентрациях выполняют защитную роль, разрушая чужеродные вещества и ксенобиотики. При нарушениях контроля уровня АФК, они могут наносить вред и собственным структурам клетки, приводить к развитию окислительного стресса и быть причиной многих заболеваний (Болдырев, 1998; Катата & Нігата, 1998; Sabri et al, 2003; Hsu et al, 2004). Например, АФК способны активировать белки-тирозинкиназы и стимулировать «нисходящие» сигнальные системы, включающие каскад МАРК и сроссролипазу С (РІСу) (Катата $ Hirata, 1998; Mikoshiba et al, 1997). Одним из сигнальных свойств АФК может являться их воздействие на Na/K-АТФазу по принципу обратной связи, как это показано на модели изолированных нейронов (Kurella et al, 1995; Lopina, 1999; Boldyrev et al, 2003a). Авторы показали, что атака АФК на Na/K-АТФазу приводит к окислению SH групп фермента и снижению его активности, причем этот эффект является обратимым, и активность может быть восстановлена при действии клеточных редуктантов. 1 Известно, что сигнальные свойства АФК также связаны с регуляцией жизнеспособности клетки. Небольшое повышение уровня АФК стимулирует апоптоз, тогда как сильное увеличение ведет клетку к смерти по типу некроза. АФК могут регулировать активность опухолевого супрессора р53, который функционирует как транскрипционный фактор, регулирующий арест клеточного цикла и апоптоз (Rainwater et al, 1995). В наших экспериментах уабаин вызывал рост уровня АФК концентрационно зависимым способом, при этом статистически достоверные отличия от контроля регистрировались при концентрации уабаина 100 нМ и выше. Отменим, что достоверный рост уровня Саг отмечался при более высоких концентрациях уабаина, (начиная с 1 мкМ), чем рост уровня АФК. Максимальное увеличение уровня АФК при 10 мкМ уабаина - составляло 507о от контроля. Таким образом, по сравнению с ростом ионизированного кальция, АФК увеличиваются более сильно и начиная с меньших концентраций лиганда. Исходя из этого можно было предположить, что по крайней мере частично, генерация АФК в клетках не зависит от ионов кальция. Для проверки этого предположения мы измеряли АФК в присутствии 1 мМ кальциевого хелатора ЭГТА. На фоне 1 мМ ЭГТА уровень АФК изменялся 1 пропорционально исходному опыту без ЭГТА, а, значит, механизм генерации активных форм кислорода клетками нейробластомы БН-ЗУбУ в присутствии уабаина не зависит от внутриклеточного Са2 . Таким образом, мы полагаем, что сигнальные механизмы Na/K-АТФазы в клетках нейробластомы БН-бУбУ реализуются с помощью вторичных посредников - внутриклеточного Са2+ и активных форм кислорода, причем, аналогично литературным данным (Xie & Askari, 2002), рост Са2+ и АФК происходят независимыми путями. С помощью метода вестерн-блоттинга мы оценивали вовлеченность различных внутриклеточных сигнальных белков в сигнальные механизмы Na/K-АТФазы. Мы измеряли степень фосфорилирования (которая соответствует степени активности белка) белков МАРК и PI3K/PKB - известных и изученных участников каскадной регуляции клеточного метаболизма и жизнеспособности. Активация белка р42/44 МАРК ассоциируется с ранними стадиями передачи сигнала и является ключевым событием в пролиферации и дифференцировке клеток (Davis, 1993), регуляции жизнеспособности клеток (Grewal et al, 1999; Sweatt, 2001; Ballif et al, 2001).
