Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1. 1. Ядерные рецепторы и механизмы регуляции их активности 13
1. 1. 1. Суперсемейство ядерных рецепторов: биомедицинское значение, филогения и номенклатура 13
1. 1.2. Роль состояния хроматина в активации транскрипции ядерньми рецепторами 18
1. 1. 3. Доменная структура ЯР 19
1. 1.4. Особенности связывания ЯР с гормоночувствительными элементами 21
1. 1. 5. Лиганд-связывающий домен - мышеловка для лиганда 23
1. 1. 6. Связывание корегуляторов и коактиваторный карман 25
1. 1. 7. Корегуляторы, отличные от коактиваторов и корепрессоров 29
1. 1. 8. Регуляция активности орфановых рецепторов 30
1. 1.9. Альтернативные механизмы регуляции активности ядерных рецепторов 32
1. 2. Орфановые рецепторы подсемейства NR5a: роль в развитии и метаболизме и механизмы активации 35
1.2. 1. Роль орфановых рецепторов стероидогенного фактора 1 и гомолога рецептора печени 1 в раннем развитии и метаболизме 35
1. 2. 2. Мутации в гене SF-1 у человека 36
1. 2. 3. Роль LRH-1 в регуляции метаболизма холестерина 38
1. 2. 4. SF-1 и LRH-1: механизмы активации, в отсутствие лиганда 40
1. 2. 4. 1. Роль Dax-І и SHP в регуляции активности SF-1 и LRH-1 40
1.2. 4. 2. Активация SF-1 и LRH-1 через сигнальные пути 41
Заключение 43
2. Материалы и методы 45
2. 1. Плазмиды 45
2. 2. Культура клеток 45
2. 3. Экспрессия и очистка белка 46
2. 4. In vitro трансляция, in vitro фосфорилирование, ограниченный протеолиз и температурное плавление 48
2. 5. Моделирование вторичной структуры белков 49
2. 6. Аналитическое ультрацентрифугирование 50
2.7. Кристаллизация лиганд-связывающего домена LRH-1, получение набора рамок диффракции и интеграция данных 50
3. Результаты и обсуждение 52
3.1. Влияние фосфорилирования SF-1 по сайту Ser на транскрипионную активность и конформацию SF-1 52
3. 1. 1. Транскрипционная активность SF-1 зависит от фосфорилирования по сайту Ser в шарнирном домене 52
3. 1.2. Erk-2 фосфорилирует SF-1 in vitro 55
3. 1.3. Erk-2-зависимое фосфорилирование SF-1 повышает взаимодействие с кофакторами in vivo 56
3. 1.4. Фосфорилирование SF-1 с помощью Erk-2 вызывает конформационное изменение в шарнирном домене 60
3. 1.5. Фосфорилирование SF-1 с помощью Erk-2 не имитирует действие лиганда 64
3. 1.6. Эксперименты по температурному плавлению свидетельствуют в пользу активной конформации лиганд-связывающих доменов SF1 и LRH1... 66
3. 2. Структурные основы независимой от лиганда активности орфановых рецепторов подсемейства NR5a 69
3. 2. 1. Получение рентгеносруктурной модели лиганд-связывающего домена LRH-1 69
3. 2. 2. Особенности структуры лиганд-связывающего домена LRH-1 71
3. 2. 3. LRH-1 содержит большой, но пустой лигандный карман 73
3. 2. 4. Спираль Н2 является интегральным стабилизирующим элементом, ответственным за активную конформацию лиганд-связывающего домена 77
3. 2. 5. Наружная поверхность спирали Н2 является специфической для подсемейства NR5a поверхностью связывания корегуляторов 80
3. 2. 6. Особенности структуры и функции 1ЛШ-1Ю52Еи SF-l1*2551- 82
3. 2. 7. Архитектура коактиваторной бороздки LRH-1 85
3. 2. 8. Структурное объяснение мономерной природы LRH-1 88
3. 3. LRH-1 и SF-Г. пути регуляции контитутивной активности, в отсутствие лиганда 90
3. 3. 1. Регуляция активности LRH-1 через киназные сигнальные пути 91
3.3.2. Домены белок-белкового взаимодействия за пределами лиганд- связывающего домена: регуляторная роль шарнирного домена 92
Заключение 95
Выводы 98
Список цитируемой литературы 100
- Суперсемейство ядерных рецепторов: биомедицинское значение, филогения и номенклатура
- Мутации в гене SF-1 у человека
- Транскрипционная активность SF-1 зависит от фосфорилирования по сайту Ser в шарнирном домене
- Наружная поверхность спирали Н2 является специфической для подсемейства NR5a поверхностью связывания корегуляторов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Гормональная регуляция контролирует все аспекты развития и метаболизма многоклеточных организмов. Биологическая активность гормонов реализуется через рецепторы, расположенные как на поверхности, так и внутри клетки. Воздействием на трансмембранные или внутриклеточные ядерные рецепторы объясняется механизм действия более чем трети лекарственных препаратов, выпускаемых в настоящее время, что обуславливает огромное биомедицинское значение изучения рецепторов гормонов. К числу небольших липофильных молекул, способных проникать через клеточную мембрану и связываться с соответствующими внутриклеточными (ядерными) рецепторами, относятся эстрогены, андрогены, глюкокортикоиды, витамины А и D; в то же время, активирующие гормоны не идентифицированы для половины ядерных рецепторов, что является причиной классификации таких рецепторов как сиротских, или орфановых [1].
Ядерные рецепторы - это белки со стандартной для этих транскрипционных факторов доменной организацией. ДНК-связывающий домен ядерных рецепторов связывается со специфическими для каждого рецептора гормоночувствительными элементами, содержащимися в промоторных участках контролируемых генов, тогда как основная функция лиганд-связывающего домена заключается во взаимодействии с регуляторными транскрипционными факторами. В случае активируемых гормоном рецепторов связывание гормона с лиганд-связывающим доменом приводит к возникновению аффинности к активаторам транскрипции и транскрипционной активации. В отсутствие лиганда такой рецептор имеет аффинность к репрессорам транскрипции. Шарнирный домен, расположенный между ДНК-связывающим и лиганд-связывающим доменами, играет важную роль в модуляции активности ядерных рецепторов [2].
Орфановые рецепторы Steroidogenic Factor-1 (SF-1) и Liver Receptor Homolog-1 (LRH-1), относящиеся к подсемейству NR5a, являются
критическими организаторами раннего развития [2]. Во взрослом организме SF-1 и LRH-1 вовлечены в регуляцию функционирования органов гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой/гонадной оси и липидного метаболизма и контролируют работу генов, необходимых для синтеза стероидных гормонов и метаболизма холестерина [2]. SF-Г1' мыши лишены гонад, надпочечников и вентромедиального ядра гипоталамуса, а мыши с одной копией гена SF-1 проявляют ослабленную реакцию на стресс [2]. Гетерозиготные ХУ пациенты с мутацией в гене SF-1 страдают острой надпочечниковой недостаточностью и являются фенотипическими женщинами. Поскольку SF-1 и LRH-1 вовлечены в регуляцию биосинтеза и обмена стероидных гормонов и липидного метаболизма, исследование механизмов активации этих орфановых рецепторов имеет большое значение для понимания этиологии сердечно-сосудистых заболеваний и эндокринных патологий. Поскольку нарушение работы генов -критических организаторов раннего развития - часто ассоциировано со злокачественной трансформацией, исследование механизмов активации SF-1 и LRH-1 внесет вклад в понимание этиологии некоторых форм рака, в частности, рака надпочечников, где особенно хорошо экспрессирован SF-1, и рака органов пищеварительной системы, экспрессирующих большие количества LRH-1.
Поскольку лиганды для SF-1 и LRH-1 не идентифицированы, механизмы активации этих рецепторов неизвестны. Было высказано предположение, что 25-гидроксихолестерин является лигандом для SF-1, но это предположение не было подтверждено дальнейшими исследованиями. SF-1 является фосфопротеином, но при этом неизвестно, может ли фосфорилирование имитировать действие лиганда, так как структурная роль фосфорилирования в активации SF-1 не изучена. В отличие от «классических» ядерных рецепторов (таких как рецепторы стероидных гормонов), SF-1 и LRH-1 регулируют транскрипцию репортерных белков в культуре ткани конститутивно, т.е. независимым от лиганда способом. Механизм активации «классических» рецепторов был открыт благодаря получению рентгеноструктурных моделей лиганд-связывающих доменов этих рецепторов, тогда как структура лиганд-
связывающих доменов SF-1 и LRH-1 неизвестна, поскольку отсутствуют соответствующие рентгеноструктурные модели.
Цель работы. Целью данной работы является исследование структурных механизмов активации ядерных рецепторов подсемейства пять, с использованием биохимических и рентгеноструктурных методов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить структурные механизмы активации SF-1 и LRH-1 через киназные пути и исследовать роль фосфорилирования в активации SF-1.
С помощью ПЦР создать суперпродуцентный конструкт, экспрессирующий лиганд-связывающий домен LRH-1 в кишечной палочке, и получить очищенный белок.
Получить подходящие для рентгеноструктурного анализа кристаллы лиганд-связывающего домена SF-1 или LRH-1 и определить структуру этого домена.
На основе полученной кристаллографической модели определить структурные механизмы активации рецепторов подсемейства NR5a.
На основе полученной кристаллографической модели определить структурные детерминанты мономерности рецепторов подсемейства NR5a. Научная новизна работы. В результате данного исследования было
впервые показано, что зависимое от стимуляции митоген-активируемых киназных путей фосфорилирование серина 203 на SF-1 необходимо для максимальной активации рецептора, может осуществляться МАР-киназой Erk-2 и вызывает конформационное изменение в шарнирном домене, сопровождающееся повышением стабильности рецептора. Впервые была получена рентгеноструктурная модель лиганд-связывающего домена LRH-1. Эта модель продемонстрировала, что в соответствии с конститутивной модальностью активации рецепторов подсемейства пять, лиганд-связывающий домен LRH-1 находится в активной конформации, стабилизируемой с помощью нового структурного элемента - жесткой и длинной спирали Н2, и имеет
большой, полностью закрытый и неоккупированный лигандный карман. При трансфекции в культуру клеток гепатокарциномы активность мутантов с заполненным объемными боковыми цепями лигандным карманом была близка к активности белка дикого типа, что свидетельствовало о необязательности лиганда для поддержания активного состояния рецептора. Впервые было найдено структурное объяснение мономерной модальности функционирования ядерных рецепторов подсемейства пять.
Практическая значимость работы. Результаты данного исследования имеют большое практическое значение для медицины, поскольку получение рентгеноструктурной модели LRH-1 позволяет построить высокоточную модель лиганд-связывающего домена SF-1 и сделать заключение о структурных механизмах патологий у пациентов с мутациями в гене SF-1; кроме того, информация о координатах лигандного кармана позволяет, с помощью компьютерного докинга, вести рациональный поиск потенциальных лигандов, который, в случае успеха, позволит разработать новые лекарственные препараты, направленные на коррекцию нарушений баланса стероидных гормонов и метаболизма липидов.
Основное теоретическое значение настоящей работы заключается в открытии механизма активации ядерных рецепторов подсемейства пять, а именно лежащей в основе конститутивной активности LRH-1 независимой от лиганда стабилизации лиганд-связывающего домена с помощью нового структурного элемента - жесткой и длинной спирали Н2. Впервые были показаны структурные детерминанты мономерности ядерных рецепторов подсемейства пять. Было дано объяснение патологическому фенотипу человеческой мутации SF-lRb5 . Кроме того, было показано, что для максимальной активности SF-1 необходимо фосфорилирование серина 203 в шарнирном домене. Было также показано, что фосфорилирование серина 203 на SF-1 может осуществляться in vitro МАР-киназой Erk-1, вызывает конформационное изменение в шарнирном домене и приводит к стабилизации рецептора.
Основные положения, выносимые на защиту:
Фосфорилирование SF-1 стабилизирует структуру рецептора и усиливает белок-белковое взаимодействие с корегуляторами.
Конститутивная активность LRH-1 не зависит от действия лиганда.
Спираль Н2 является структурным элементом, ответственным за активную конформацию и конститутивную активность LRH-1.
Наружная поверхность спирали Н2 образует поверхность белок-белкового взаимодействия.
Структурные детерминанты связывания с корегуляторами рецепторов подсемейства NR5a отличаются от таковых для стероидных рецепторов.
Негативные взаимодействия между отрицательно заряженными аминокислотными остатками, специфическими для подсемейства NR5a, препятствуют образованию как гомо- так и гетеро дим еров LRH-1. Апробация работы
Результаты настоящего исследования были доложены на семинарах в University of California, San Francisco, Duke University, Baylor College of Medicine, San Francisco State University и на Ernst Klenk Symposium "Transcriptional and other regulatory factors of lipid metabolism" (6-8 июля 2003 года, Cologne, Germany), а также были представлены в виде постерных сообщений на "Keystone Symposium on Nuclear Receptors" в 2000 году (Steamboat, Colorado) и 2002 году (Snowbird, Uta).
Суперсемейство ядерных рецепторов: биомедицинское значение, филогения и номенклатура
Ядерные рецепторы (ЯР) - это транскрипционные факторы белковой природы, которые направляют и координируют регуляторные события в эмбриональном развитии и в регуляции метаболизма многоклеточных организмов. Подавляющее большинство ядерных рецепторов конститутивно локализовано в ядре клетки, хотя рецепторы стероидов могут быть найдены как в ядре, так и в цитоплазме - в зависимости от того, связаны ли они с соответствующим гормоном. Некоторые авторы, например Keith Yamamoto, используют термин «внутриклеточные рецепторы» («intracellular receptors») для обозначения ядерных рецепторов. В настоящей работе мы будем использовать общепринятый в данной области исследований термин «ядерные рецепторы», являющийся сокращением от выражения «рецепторы ядерных гормонов» («nuclear hormone receptors»).
Суперсемейство ядерных рецепторов включает в себя рецепторы для таких разных лигандов, как стероидные гормоны, тироидные гормоны, ретиноевая кислота, витамин D, ксенобиотики и оксистеролы, а также большую группу орфановых рецепторов, идентификация которых произошла в отсутствие соответствующих лигандов. Рецепторы, лиганды которых были известны до момента идентификации рецептора (такие, как большинство рецепторов стероидных гормонов), часто называют «классическими» рецепторами («classic receptors»). Рецепторы, лиганды которых были обнаружены с помощью методов так называемой «обратной эндокринологии» после идентификации самого рецептора [1], часто называют «усыновленными» рецепторами («adopted orphans») [2]. Человека» выяснилось, что в человеческом геноме содержатся гены, кодирующие 48 ядерных рецепторов, при этом ни один новый ядерный рецептор не был открыт в результате этого проекта [10,12]. По контрасту с геномом человека, геном Caenorhabditis elegans содержит более 270 генов для ядерных рецепторов, в то время как в геноме Drosophila обнаружен 21 такой ген [10,13].
Гены ядерных рецепторов имеют общую филогению и представляют собой одно большое суперсемейство, принадлежность к которому определяется наличием «сигнатурных» мотивов в ДНК-связывающем (DBD) и лиганд-связывающем (LBD) доменах [2,14,15]. В результате алайнмента консервативных мотивов и последующего филогенетического анализа суперсемейство ядерных рецепторов было разбито на шесть подсемейств (NR1, NR2, NR3, NR4, NR5, NR6) и 26 групп; при этом рецепторы с необычной структурой, т.е. содержащие только один домен (или DBD, или LBD), объединены, независимо от происхождения, в отдельное подсемейство NR0 [14]. Предложенная система номенклатуры ЯР аналогична той, которая используется для обозначения генов суперсемейства цитохромов Р450 [16] и обладает достаточной гибкостью, чтобы включать новые гены, группы генов или подсемейства по мере получения новой информации.
Согласно предложенной номенклатуре название каждого гена состоит из префикса NR, за которым следуют арабское число, обозначающее подсемейство, заглавная буква, обозначающая группу, и второе арабское число, обозначающее индивидуальный ген. Внутри одного подсемейства в группы объединены паралогичные (с бутстрап значениями для внутренних веток более 90%) гены, образовавшиеся в результате дупликации, сопряженной с возникновением позвоночных животных. Во многих случаях внутри одной группы объединены ЯР как позвоночных, так и беспозвоночных животных. Номер, данный определенному рецептору внутри группы, не несет никакой специфической информации. Ядерные рецепторы являются эффекторами сигналов, представляющих собой небольшие липофильные молекулы, легко проникающие через клеточную мембрану и непосредственно связывающиеся с соответствующим рецептором. Кроме того, сигналы, передаваемые через вторичные мессенжеры, могут приводить к регуляторным модификациям, таким, как фосфорилирование и ацетилирование, в ЯР и их белковых партнерах [3]. Таким образом, ЯР интегрируют поток экстра- и интраклеточных сигналов, и, в соответствии с суммарным вектором, регулируют транскрипцию контролируемых генов. Интересно заметить, что многие лиганды ядерных рецепторов связаны между собой общим происхождением из изопреноидного биосинтетического пути [4]. Многие реакции этого пути контролируются цитохромами Р450, которые, в свою очередь, находятся под контролем ядерных рецепторов [5].
Поскольку нарушения нормальной активности ЯР имеют этиологическое значение в патогенезе рака и эндокринных нарушений, включая диабет, этот класс молекул имеет чрезвычайно большое значение для медицины и здоровья человека. К примеру, выявленные к настоящему времени мутации в орфановом ЯР Стероидогенном Факторе 1 (SF-1) сопровождаются переменой пола у ХУ пациентов и острой надпочечниковой недостаточностью у обоих полов [6], а мутации в рецепторе тироидного гормоне ассоциированы с синдромом устойчивости к тироидном гормону [7]. Эпидемиологические исследования на подвергавшихся эстрогенной терапии женщинах показали, что прием эстрогена положительно коррелирует с риском возникновения рака груди [8,9]. В настоящее время, трансмембранные и ядерные рецепторы являются мишенями третьей части всех предписываемых лекарств [10], что свидетельствует о неоценимом фармакологическом значении исследований на этих классах молекул.
Характерные для ядерных рецепторов консервативные «сигнатурные» последовательности ДНК отсутствуют у растений, грибов и губок, и найдены у всех многоклеточных организмов царства Animalia, начиная с кишечнополостных (Coelenterata) [11]. По окончании проекта «Геном Примером подсемейства является подсемейство NR3, включающее стероидные рецепторы, а также орфановые рецепторы ERRcc и ERR0, родственные рецептору эстрогенов а. Примерами групп внутри этого подсемейства являются рецептор эстрогенов ER (группа ЗА), ERR (группа ЗВ) и стероидные рецепторы (группа ЗС). Для ДНК-связывающих доменов процент идентичности внутри одной и той же группы обычно составляет 80-90%, а для лиганд-связывающих доменов - примерно 40-60%. Различным гомологам одного и того же гена у беспозвоночных (например, Drosophila и Caenorhabditis) дано одно и то же имя. В случае одинаковой степени родства определенного гена Drosophila с любым из его гомологов у позвоночных (как в случае Drosophila USP и трех RXR генов позвоночные), гену Drosophila предложено, для ясности, давать отдельное имя; поэтому RXR а, р, и у получают имена NR2B1, 2 and 3 соответственно, и USP - имя NR2B4. Функционально и структурно различающиеся варианты одного гена, полученные в результате альтернативного сплайсинга и использования альтернативных стартов трансляции, обозначаются строчной буквой в самом конце названия гена. Например, SF-1 и ELP, являющимися изоформных продуктами гена Ftz-Fl, обозначаются NR5ala и NR5alb, соответственно. Поскольку гифены не используются в компьютеризованных базах данных, в данной номенклатуре их использование ограничено обозначением различий между продуктами недавней тетраплоидизации в таких видах, как zebrafish (Danio rerio) или Xenopus. Подробное описание номенклатуры ЯР может быть найдено на странице Vincent Laudet (http://www.ens lyon.fr/LBMC/laudet/NucRec/Nomenclature.html).
Мутации в гене SF-1 у человека
К настоящему времени обнаружены три мутации в гене стероидогенного фактора 1 у человека. Первой была обнаружена гетерозиготная мутация в Р-боксе ДНК-связывающего домена SF-1 (G35E) у ХУ-пациента с женским фенотипом, историей надпочечниковой гипоплазии и наличием зачатков мужских гонад, наряду с не подвергшихся инволюции Мюллеровыми структурами [92]. Исследования in vitro показали, что мутантный белок SF-1G35E не подавляет по доминантно-негативному механизму функцию дикого типа SF-1, но полностью лишен способности связываться с гормоночувствительным элементом [92]. У другого 46, ХУ пациента, младенца с мужским гермафродитизмом и симптомами надпочечниковой гипоплазии была обнаружена гомозиготная R92Q мутация в А-боксе SF-1; мутантный белок проявлял частичную потерю способности связываться с ДНК и пониженную транскрипционную активность [6]. Две описанные выше мутации демонстрируют критическую роль SF-1 в развитии надпочечников, гонад и формировании мужского фенотипа, а также важность дозы гена SF-1 в его нормальной транскрипционной активности, в соответствии с данными, полученными на мышиной модели [6,93].
Третья мутация была обнаружена в лиганд-связывающем домене SF-1 (R255L) у 46, XX пациентки с симптомами надпочечниковой гипоплазии [94]. Развитие женских гонад у данной пациентки происходило внешне совершенно нормально, демонстрируя критическую роль дозы SF-1 в развитии надпочечников и мужских гонад, но не яичников. Мутантный SF-1 (R255L) в экспериментах in vitro проявлял неспособность связываться с каноническим гормоночувствительным элементом, но при этом не подавлял по доминантно-негативному механизму функцию дикого типа SF-1 [94].
Симптомы острой надпочечниковой недостаточности в первые дни жизни и последующие нарушений в формировании мужского фенотипа характерны также для пациентов с мутациями в атипичном орфановом рецепторе (NR0B1) — Dax-1 [95]. Эти симптомы аналогичны симптомам, проявляющимся у пациентов с мутациями в SF-1 [96], и не случайно, поскольку к настоящему времени убедительно показано, что Dax-І физически взаимодействует с SF-1, ингибируя транскрипцию контролируемых этим конститутивно активным орфановым рецептором генов [89,91,97,98]. Предполагается, что белок-белковое взаимодействие SF-1 и Dax-І лежит в основе репрессивной активности Dax-І по отношению к SF-1; основанием для такого предположения является факт нарушенного белок-белкового взаимодействия вариантов Dax-1, соответствующих известным человеческим мутациям, с SF-1 [99,100].
LRH-1 (NR5a2) был изначально охарактеризован как фактор, связывающийся с промоторными районами эмбрионального маркера печени альфа-фетопротеина [79] и ключевого фермента «классического» пути синтеза желчных кислот холестерин-7ос-гидроксилазы (CYP7A) [101]. Кроме того, LRH-1 контролирует транскрипцию 12-ос-гидроксилазы (CYP8B1) - ключевого фермента, определяющего степень гидрофобности циркулирующего пула желчи путем регулирования соотношение между холиевой и ксенодиоксихолевой кислотами [102]. Эксперименты по Northern гибридизации РНК и Western иммуноблоттингу показали наличие мРНК и белка LRH-1 в печени, почках, кишечнике, мозге, сердце, тимусе, скелетных мышцах, мужских гонадах, панкреатической железе, и, в меньших количествах, в легких [79,101]. Более недавние исследования продемонстрировали экспрессию LRH-1 в преадипоцитах [103], яичниках [104] и в надпочечниках [105].
Обнаружение LRH-1 в стероидогенных тканях, наряду с тем фактом, что SF-1 контролирует гены метаболизма холестерина, такие как рецепторы липопротеинов высокой плотности SR-B1 [106], дает основание предполагать, что функции LRH-1 и SF-1 в контроле стероидогенеза могут перекрываться.
Исследования лаборатории Манделсдорфа выявили роль трех орфановых рецепторов - FXR, LRH-1 и SHP - в петле обратной связи, контролирующей транспорт и биосинтез желчных кислот [107,108]. Было показано, что эндогенными лигандами-агонистами «усыновленного» орфанового рецептора FXR являются желчные кислоты. Активация FXR желчными кислотами подавляет транскрипцию ключевых ферментов синтеза желчных кислот CYP7A и CYP8B1 по следующему механизму: (1) активированный избытком желчных кислот FXR стимулирует транскрипцию атипичного орфанового рецептора SHP (NR0B2), в промоторном участке которого имеется FXR гормоночувствительный элемент; (2) на следующем этапе, избыток SHP связывается с конститутивным активатором LRH-1, находящимся на промоторных участках CYP7A и CYP8B1, где имеются LRH-1 гормоночувствительные элементы, (3) поскольку SHP является корепрессором LRH-1, такое взаимодействие приводит к подавлению транскрипции CYP7A и CYP8B1 [108,109]. В этой петле обратной связи FXR является сенсором концентрации желчных кислот; при ее понижении ослабляется активация промотора SHP с помощью FXR, что приводит к дерепрессированию LRH-1 и, вследствие этого, повышению транскрипции CYP7A и CYP8B1.
Пациенты с мутацией в CYP7A имеют гиперхолестеринемический фенотип, что подтверждает важность регуляции этого фермента в регуляции метаболизма желчных кислот [ПО]. Важность регуляции биосинтеза и реабсорбции желчных кислот очевидна из того факта, что у человека около 50% холестерина катаболизируется в желчные кислоты и выводится через кишечный тракт [111], при этом часть холестерина подвергается в кишечнике обратной абсорбции с помощью транспортерных белков. Недавние исследования показали, что регуляция транскрипции одного из таких белков, apical sodium-dependent bile acid transporter (ASBT), также контролируется LRH-1 через описанный выше механизм обратной связи [107]. Кроме того, LRH-1 контролирует транскрипцию двух других белков, вовлеченных в реабсорбцию кишечных желчных кислот - панкреатической липазы карбоксиловых эфиров [112] и кишечного multidrug resistant protein МгрЗ [113].
Транскрипционная активность SF-1 зависит от фосфорилирования по сайту Ser в шарнирном домене
Моделирование вторичной структуры лиганд-связывающих доменов SF-1 и LRH-1 (рисунок 5) показало, что они состоят из характерных для ядерных рецепторов двенадцати альфа-спиралей и двух коротких бета-поворотов; таким образом, можно было ожидать, что принципы транскрипционной активации, общие для ядерных рецепторов вообще, приложимы к подсемейству NR5a.
Поскольку несколькими группами исследователей было показано, что стимуляция сигнальных путей с помощью пептидных гормонов, факторов роста, а также агентов, повышающих внутриклеточную концентрацию цАМФ, приводит к повышению транскрипционной активности SF-1 на репортерах, содержащих промоторы контролируемых SF-1 генов [57,74], была предпринята попытка исследования механизма регуляции активности SF-1 через киназные сигнальные пути.
Все активируемые через альтернативные пути ядерные рецепторы являются фосфопротеинами. Gary Hammer в лаборатории Ingraham показал, что SF-1 также является фосфопротеином, конститутивно фосфорилированым в культуре клеток COS и MCF-7 по единственному сайту Ser , находящемуся в шарнирном домене [24]. В экспериментах по трансфекции культуры клеток хориокарциномы человека JEG-3, способность нефосфорилируемого мутанта SF-1S2 активировать репортеры, содержащие гормоночувствительные элементы двух контролируемых SF-1 генов, MIS и 21-гидроксилазы, составляла около 50% активности SF-1 дикого типа, свидетельствуя о том, что фосфорилирование по сайту Ser203 является необходимым для максимальной активации SF-1 [24]. Были также получены свидетельства тому, что структуры SF-1 и LRH-1. Идентичные аминокислотные остатки показаны на желтом фоне, а похожие остатки показаны на зеленом фоне. Двенадцать предсказанных спиралей показаны буквами Н на сером фоне, под последовательностями. Показаны также специфический для ядерных рецепторов подсемейства NR5a Ftz-Fl бокс и богатый пролином домен в SF-I. Сигнатурные для суперсемейства ядерных рецепторов мотивы в ДНК-связывающем и лиганд-связывающем доменах показаны красным шрифтом. фосфорилирование по сайту Ser может зависеть от MAP киназы, в соответствии с наблюдением, что Ser203 расположен внутри мотива PYASP, родственного PXnS/TP консенсусному мотиву серин/треониновых МАР киназ. Действительно, котрансфекция с SF-1 фосфатазы, специфической для MAP киназ, привела к драматическому уменьшению активности SF-1 [24]. Фосфорилирование через протеин-киназу А представлялось маловероятным, поскольку стимуляция 8-Вг-сАМР (1 тМ, 4 часа) не приводила к заметному увеличению в уровне фосфорилирования SF-1 [24]. Драматическое повышение степени фосфорилирования SF-1 после стимуляции эмбриональным фактором роста в клетках, предварительно инкубированных с бессывороточной средой, а также стимуляция активности фосфорилирования дикого типа SF-1, но не SF-1S203A, в результате котрансфекции с конститутивно активной киназой Raf (киназой киназы MAP киназы), свидетельствовали об участии MAP киназы в фосфорилировании Ser203 в SF-1 [24].
Тем не менее, описанные выше эксперименты не предоставили прямого доказательства тому, что фосфорилирование SF-1 по Ser осуществлется с помощью киназы МАРК. Кроме того, не было показано, какой механизм лежит в основе повышения активности SF-1 в присутствии конститутивно активной киназы Raf и пониженной транскрипционной активности нефосфорилируемого мутанта SF-1 03А. В случае рецептора эстрогена, МАРК-зависимое фосфорилирование в N-терминальном домене AF-1 приводило к усилению взаимодействия рецептора эстрогена с коактиватором SRC, с последующим усилением транскрипционной активности [25]. Способна ли МАР киназа фосфорилировать SF-1 по сайту Ser203 in vitro1? Является ли усиление связывания с коактиватором основанием для повышения транскрипционной активности фосфорилированного SF-1? Каково влияние фосфорилирования на взаимодействие SF-1 с корепрессором? Чтобы ответить на данные вопросы, были проведены описанные ниже эксперименты.
Чтобы иметь возможность определить, какая киназа фосфорилирует SF-1 in vitro, были сконструированы, в виде химер с белком glutathione Sransferase (GST), пять белков: два белка (дикий тип, и мутант SF-1S203A) содержали часть шарнирного домена и лиганд-связывающий домены SF-1 (аминокислотные остатки 178-462), один белок содержал спирали НЗ-Н12 лиганд-связывающего домена SF-1 (аминокислотные остатки 265-462), и два белка (дикий тип, и SF-1 А мутант) содержали часть шарнирного домена SF-1 и спирали HI и Н2 лиганд-связывающего домена SF-1 (аминокислотные остатки 180-265), причем все пять белков содержали N-терминальный сайт фосфорилирования для киназы мышцы сердца (heart muscle kinase, НМК), выполнявший функцию внутреннего контроля фосфорилирования.
Наружная поверхность спирали Н2 является специфической для подсемейства NR5a поверхностью связывания корегуляторов
Чтобы ответить на вопрос о механизмах регуляции орфановых рецепторов подсемейства пять, прежде всего нужно ответить на вопрос: существуют ли лиганды для этих рецепторов? Лиганды для многих орфановых рецепторов были идентифицированы методами обратной эндокринологии, но поток открытий в этой области иссякает, тогда как около половины всех ядерных рецепторов до сих пор являются «сиротами» 54].
Поскольку в LRH-1 имеется большой лигандный карман, возможность различньк вариантов ответа на вопрос о наличии лиганда у LRH-1 находится в остром контрасте с ситуацией с DHR38 и Nurrl, лигандный карман которых практически отсутствует - и поэтому лиганда не может быть [35,36]. Несмотря на то, что рентгеноструктурная модель показала отсутствие лиганда в лигандном кармане LRH-1 и независимая от лиганда активность LRH-1 была подтверждена экспериментами по мутагенезу аминокислотных остатков лигандного кармана (рис 19А, 19Б), само наличие большого лигандного кармана с характерным распределением гидрофобных и заряженных аминокислотных остатков не позволяет закрыть вопрос о возможном участии лиганда (лигандов) в регуляции активности SF-1 и LRH-1 на определенных стадиях развития и в определенных тканях. SF-1 является основным регулятором биосинтеза стероидов в стероидогенных тканях, тогда как LRH-1 играет ключевую роль в регуляции биосинтеза желчных кислот. Стероиды, желчные кислоты и их метаболиты являются превосходными кандидатами на роль лигандов; при этом важно отметить, что открытие лигандов для SF-1 и LRH-1 будет иметь большое фармакологическое значение.
Поскольку активность ядерных рецепторов пятого подсемейства регулируется независимо от лиганда, исследование роли альтернативных механизмов имеет особую важность. Мы показали, что SF-1 является фосфопротеином, и его фосфорилирование зависит от MAP киназы Erk-2. Наши эксперименты также продемонстрировали драматическое повышению активности LRH-1, в ответ на активацию МАР-киназного пути, что означает, что и LRH-1 является фосфопротеином. Идентификация сайта (или сайтов) фосфорилирования на LRH-1 является задачей ближайших исследований.
Поскольку фосфорилирование приводит к конформационному изменению в шарнирном домене, логично предположить, что существуют корегуляторы для SF-1 и LRH-1, специфические для фосфорилированного состояния белка; идентификация таких регуляторов также является одной из задач дальнейших исследований.
Существует большое количество данных о том, что ядерные рецепторы пятого подсемейства контролируется атипичными орфановыми рецепторами Dax-І и SHP, подавляющими активность SF-1 и LRH-1 через белок-белковые взаимодействия. В то время как аналитическое ультрацентрифугирование показало, что лиганд-связывающие домены SF-1 и LRH-1 не взаимодействуют с лиганд-связывающим доменом Dax-І, результаты электрофореза в нативном геле продемонстрировали, что SF-1 8"462, включающий С-терминальную часть шарнирного домена, способен к такому взаимодействию (рисунок 27). Известно, что богатые пролином последовательности являются лигандами для WW и SH3 доменов белок-белкового взаимодействия [133]. Наличие богатой пролином последовательности аминокислот в N-терминальной части шарнирного домена SF-1, а также МАРК-зависимого сайта фосфорилирования в С-терминальной части этого домена, свидетельствуют о важной роли шарнирного домена в регуляции активности ядерных рецепторов пятого подсемейства, поэтому одной из задач дальнейших исследований является идентификация корегуляторов, специфически взаимодействующих с доменами белок-белкового взаимодействия в шарнирных доменах SF-1 и LRH-1.
Существуют свидетельства, что шарнирные домены LRH-1 и SF-1 участвуют во взаимодействии с рядом корегуляторов [130]. Получение рентгеноструктурной модели фрагмента LRH-1 или SF-1, содержащего лиганд-связывающий и шарнирный домены, а также моделей LRH-1 или SF-1 в комплексе с Dax-1, SHP, с коактиватором, корепрессором, или с соответствующим пептидом, тоже являются задачами последующих исследований.
Таким образом, настоящее исследование показало, что активность орфановых рецепторов пятого подсемейства регулируется через белок-белковые взаимодействия и через сигнальные пути с помощью фосфорилирования. Рентгеноструктурный анализ лиганд-связывающего домена LRH-1 продемонстрировал активную конформацию рецептора и наличие неоккупированного лигандного кармана, причем помещение объемных боковых цепей в лигандный карман не влияло на активность рецептора, свидетельствуя о том, что лиганд не является необходимым для активности LRH-1.
Получение модели лиганд-связывающего домена LRH-1 привело к открытию нового механизма стабилизации активированного состояния рецептора (с помощью спирали Н2), ответственного за конститутивную активность LRH-1 и формирующего новую поверхность связывания корегуляторов, а также позволило определить структурные детерминанты мономерности ядерных рецепторов подсемейства пять. Получение трехмерной структуры лиганд-связывающего домена LRH-1 дало также возможность проводить эксперименты по докингу потенциальных лигандов в лигандный карман, что, в свою очередь, может привести к открытию лигандов, модулирующих активность SF-1 или LRH-1.
Таким образом, в настоящей работе были получены имеющие важное научное и практическое значение новые знания о механизмах активации ядерных рецепторов подсемейства пять и о возможных путях регуляции этой активности.
