Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 12
1. Урокиназа 12
1.1. Структура урокиназы 12
1.2. Структура доменов урокиназы 16
2. Взаимодействие с рецептором 17
2.1. Структура урокиназного рецептора 17
2.2. Комплекс АКФ -УКР 21
3. Урокиназа и гепарин 24
4. Ограниченный протеолиз урокиназы 25
5. Посттрансляционные модификации урокиназы 26
6. Регуляция экспрессии урокиназы : 28
7. Ингибирование урокиназы: ПАИ-1, ПАИ-2, PN-1 28
8. Эндоцитоз урокиназы 30
9. Витронектин 32
10. Интегрины 35
11. Функции урокиназы 37
11.1. Протеолитическая функция комплекса УК -УКР 38
11.2. Адгезия и миграция 41
11.2.1. Протеолиз 41
11.2.2. Крингл-зависимая миграция 42
11.2.3. Разрушение фокальных контактов 45
11.2.4. Сигналинг через GPCR 46
11.2.5. Витронектин 47
11.2.6. LDL-опосредованная миграция 47
11.3. Пролиферация 48
11.4. Апоптоз 49
12. Участие урокиназы в ремоделировании тканей 51
12.1. Рестеноз 51
12.2. Ангиогенез 52
12.3. Рост и метастазирование опухолей 53
Материалы и методы 57
1. Химические реактивы 57
2. Антитела 57
3. Культуральные среды и пластик 57
4. Очистка рекомбинантных форм белков 58
5. Определение концентрации белка в пробах 60
6. ДСН-электрофорез 60
7. Изучение растворимости телец включения в гуанидине 60
8. Очистка ростового домена 61
9. Изменение флуоресценции Тгр при температурной денатурации белка 61
10. Круговой дихроизм 61
11. Флуроресценция белков, меченых с помощью Флуоресцеин-5-малеимид J. 62
12. Иммобилизация белков 62
13. Получение общего клеточного лизата 63
14. Иммуноблоттинг 63
15. Иммуноферментный анализ 64
16. М9 среда 64
17. Получение и очистка белка с изотопным замещением 13NHT 65
18. Очистка комплекса УК -УКР 66
19. Спектроскопия ЯМР 66
20. Клеточные культуры 68
21. Получение белков из эукариотических клеток 68
22. Связывание йодированных рекомбинантных форм урокиназы человека с клетками 69
23. Миграция клеток 69
24. Статистическая обработка результатов 70
Результаты 71
1. Очистка рекомбинантных форм урокиназы человека 71
2. Очистка ростового домена урокиназы 73
3. Изучение вторичной структуры РД, КД, АКФ 76
4. Изучение наличия неспаренных цистеинов в ростовом домене 78
5. Изучение функциональности крингл- и ростового доменов рекомбинантных форм урокиназы 81
5.1. Взаимодействие рекомбинантных форм урокиназы с урокиназным рецептором на поверхности клеток СНО 81
5.2. Хемотактическое действие рекомбинантных форм урокиназы на миграцию гладкомышечных клеток человека 83
5.3. Взаимодействие рекомбинантных форм урокиназы с урокиназным рецептором из клеток U937 84
5.4. Сравнение рекомбинантных форм урокиназы, полученных в Е.СоИ с -формами урокиназы , экспрессируемыми в эукариотических клетках 85
6.ЯМР 87
6.1. Подбор условий для ЯМР 87
6.1.1. Подбор среды 87
6.1.2. Подбор условий роста Е. coli вереде Sinantes 88
6.1.3. Подбор условий очистки белка 90
6.2. Получение комплекса AKO(GZD) - УКР в максимально возможной концентрации 93
6.2.1. Очистка комплекса AK 6.2.2. Определение стехиометрии связывания УКР с AKO(G/D) 95 6.2.3. Повышение концентрации комплекса AK 6.2.4. Подбор буфера для ЯМР 99 6.3. Приготовление образцов для ЯМР 101 6.3.1. Урокиназный рецептор 101 6.3.2. АКФ (G/D) 102 6.3.3. Смесь AK 6.3.4. Стабильность белков и комплекса 104 6.4. Спектры ЯМР 105 6.4.1. Отнесение 'Н, 13С и 15N химических сдвигов рекомбинантного AKO(G/D) 105 6.4.2. Конформация рекомбинантного фрагмента урокиназы в свободном состоянии и в комплексе с рецептором 108 Обсуждение 113 Выводы 118 Список литературы 119 Введение к работе
Активатор плазминогена урокиназного типа — урокиназа (УК) — принадлежит к семейству сериновых протеаз. Основной функцией урокиназы считается ее участие, наряду с «тканевым» активатором плазминогена в тромболизисе [147]. Урокиназа состоит из трех доменов, каждый из которых обладает физиологической значимостью. Ростовой домен, гомологичный по структуре эпидермальному фактору роста, отвечает за связывание урокиназы с урокиназным рецептором (УКР) [17; 180], и это связывание обуславливает изменение конфигурации рецептора и переводит УКР в «сигнальное» состояние. Крингл-домен стабилизирует связывание урокиназы с УКР и способен связываться с гипотетическим рецептором, отличным от УКР, и активировать миграцию клеток [158]. Протеолитический домен отвечает за протеолиз плазминогена с переводом его в плазмин, а также принимает участие в целом ряде регуляторных процессов обуславливающих ремоделирование тканей, дифференцировку клеток, ангиогенез и др. [3; 37; 163]. Урокиназный рецептор является самым значительным партнером урокиназы на поверхности клеток [17]. Он представляет собой трехдоменный гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ) заякоренный белок, все три домена которого являются гомологичными по структуре. Считается, что за связывание с урокинзой отвечает первый домен, в то время как два других повышают сродство к урокиназе. Имеющиеся данные позволяют предположить, что при связывании урокиназы с высокоаффинным рецептором экспонируются участки в крингл-домене для взаимодействия с другими мишенями на поверхности клетки и запуска миграции [4]. Показано также, что при взаимодействии урокиназы с урокиназным рецептором экспонируются участки, отвечающие за сигнальные функции рецептора, а также образуются общие места связывания с белками внеклеточного матрикса и интегринами, образованные и урокиназой и рецептором [126]. Таким образом, связывание урокиназы с рецептором индуцирует изменения рецепторного белка важные для реализации ряда физиологических процессов, а рецептор, связываясь с урокиназой, изменяет ее свойства. Эти сведенья получены путем измерения функциональной активности этих белков, но структурные основы, определяющие эти изменения, не охарактеризованы. Недавно был расшифрован кристалл комплекса урокиназного рецептора и аминоконцевого фрагмента урокиназы (АКФ), лишенной протеолитического домена [22]. Как было показано, при взаимодействии с урокиназой первый и третий домены рецептора сближаются таким образом, что рецептор смыкается в кольцо, образованное тремя доменами. При этом происходит экспонирование активного участка между первым и вторым доменами рецептора. Однако метод кристаллографии не дал достоверной информации о взаимодействии урокиназы с урокиназным рецептором, потому что исследованная законсервированная структура белков не соответствует физиологическим условиям образования комплекса. Для установления изменений в структуре урокиназы при ее взаимодействии с рецептором более информативным является метод ядерного магнитного резонанса. Детальное изучение структуры ростового домена урокиназы, отвечающей за взаимодействие с урокиназным рецептором, внесет вклад в разработку результативных ингибиторов эффектов урокиназы, опосредованных ее взаимодействием с урокиназным рецептором. Известно, что суперэкспрессия урокиназы и урокиназного рецептора коррелирует с плохим прогнозом в ряде онкологических заболеваний [68]. Именно поэтому создание ингибиторов, блокирующих взаимодействие урокиназы с рецептором, является важной задачей в проблеме лечения рака. Помимо этого, блокирование взаимодействия урокиназы с урокиназным рецептором позволит контролировать процессы ремоделирования тканей, роста сосудов, устраняя негативные эффекты урокиназы. Именно поэтому мы заинтересовались исследованием ростового домена урокиназы. Таким образом, целью нашей работы было изучение структуры ростового домена урокиназы и ее изменения при взаимодействии с урокиназным рецептором. Для этого мы поставили перед собой следующие задачи: 1. Синтезировать в Escherichia coli, очистить и охарактеризовать рекомбинантные формы урокиназы человека. 2. Сравнить полученные формы с урокиназой, экспрессированной в эукариотических клетках, по способности к связыванию с урокиназным рецептором. 3. Изучить пространственную структуру ростового домена урокиназы. 4. Получить стабильный препарат аминоконцевого фрагмента с изотопным замещением N и С, и комплекса аминоконцевого фрагмента с урокиназным рецептором, стабильный и растворимый в высоких концентрациях в растворе с минимальным содержанием солей. 5. Методом ЯМР изучить изменения в структуре ростового домена аминоконцевого фрагмента урокиназы при взаимодействии с урокиназным рецептором. Урокиназа секретируется-: в виде гликозилированного малоактивного одноцепочечного белка (оцУК); состоящего из 41-іЬ аминокислотных остатков; ВI ее- структуре выделяют три\ домена: ростовой; домен, гомологичный- по структуре эпидермальному фактору роста РД:(г-48:, а.оі),.крингл-доме№КДі(49-131, а;Оі), конекшен; пептид КШ (Л32-158,..а.о}), т протеолитический домен ИД: (Рис. 1). Исторически РД-КД-КИ принято называть аминоконцевым фрагментом: (АКФ). Трехмерная: структура аминоконцевого фрагмента урокиназы (АКФ) была, определена; с помощью: ЯМР! [100]; и методом, ренгеноструктурного анализа [22] (Рис. 2)1 По данным ЯМР во вторичной структуре ростового-домена выделяют две области, состоящие: из Р-слоев, и три: из Р-изгибові Р-изгибы: тип Г изгиб Eeu14-Gln17, тип L изгиб Pro -F37, тип IFp-изгиб Gly39-Cys42. Один двухнитевой. Р-слой сформирован остатками: Thr18-Ser21 и His2 -Asn , второй небольшой сформирован остатками5 Phe37-Gly38 и Ile44-Asp45. Несмотря на то, что у ростового домена нет гидрофобной; сердцевины; остатки Thr , Val" , Trp , и Asn " сгруппированы на одной- стороне р-слоя. Еще один ключевой контакт находится: между Gin40 и Eeu14. Gin40 формирует выступ между концом протеолитический домен TDAS Рисунок 1. Структура урокиназы. Урокиназа представлена в виде последовательности а.о., состоящей из ростового домена (1-48 аминокислотные остатки (а.о.)), обозначен синем цветом, крингл-домена (49-131 а.о.), обозначен оранжевым цветом; конекшен пептид (132-158 а.о.), обозначен желтым цветом; и протеолитического домена (136-411 а.о.), обозначен зеленым цветом. Красным обозначены His2 4/Asp 5 /Ser а.о. активного центра протеолитического домена. обратного изгиба и второй нитью меньшего Р-слоя. Это взаимодействие с Leu способствует закреплению ориентации С-конца, района двойного изгиба по отношению к большему В-слою. Отличительным структурным элементом в ростовом домене является Q-петля, состоящая из семи остатков, соединяющая две нити большего Р-слоя. В этой петле боковые цепи Asn , Phe" и Ilezo обращены внутрь и сгруппированы к центру петли, а боковые цепи Lys23, Туг24, Ser и Asn наружу. Крингл-домен состоит из одного антипараллельного (3-слоя, двух небольших участков, подобных Р-слою, двух коротких спиралей и нескольких Структура АКФ. Ленточная модель в виде набора стрелок ф-слои), указывающих на карбокси-терминальный конец цепи; а, б) структура, полученная с помощью Я MP (pdb 1URK); в, г) структура, полученная методом рентгеноструктурного анализа (pdb 2I9A). обратных изгибов. Двухнитевой Р-слой сформирован остатками Pro -Val и Lys -Cys , соединенными обратным изгибом. Участки, подобные Р-слою сформированы участками: первый Thr64-Asp65 и Arg69-Pro70, второй Рго73-Тгр и His"-Asn100. а-спираль образована основаниями Ala77-Gln82. В этой спирали Ala , Thr , Gin и Gin ориентированы к растворителю, в то время как Val и Leu80 от растворителя и скомпонованы против гидрофобной сердцевины крингл-домена. Это гидрофобная сердцевина образована рядом ароматических и алифатических боковых цепей, включающих: Тгр74, Туг84, Leu94, Leu96, Trp , и Туг114. Второй спиральный участок представлен остатками Asp90-Leu94. Изгиб I типа образован остатками Pro73-Ser76 и Asn104-Asn107. Нерегулярно образованный изгиб включает пентапептид Asp65-Arg69. Две центральные дисульфидные связи Cys -Cys и Cys -Cys" расположены ортогонально друг к другу на вершине гидрофобной сердцевины. Кроме того, по данным ЯМР[100] ростовой и кринг- домены структурно независимы. При изучении динамики поведения аминоконцевого фрагмента урокиназы в растворе было получено[99], что упорядоченность ростового домена несколько ниже, чем у большинства хорошо структурированных доменов, это может объясняться отсутствием гидрофобной сердцевины, которая поддерживает отдельные элементы вторичной структуры в определенном положении. Причем структурный элемент, ответственный за взаимодействие с урокиназным рецептором, Q-петля (Asn22-Ile28), испытывает большое количество внутреннего движения, которое должно уменьшаться при взаимодействии с рецептором. По данным рентгеноструктурного анализа между доменами наблюдалось взаимодействие. Боковые цепи Leu14 и Leu92 вовлечены в близкие гидрофобные контакты, а боковая цепь Не44 заполняет гидрофобный карман, образованный Lys61, His99 и Туг101. Кроме того, карбонильная группа основной цепи Arg формирует короткую водородную связь с амидной группой Asp45 (2.88 A), Asp Р-карбоксильная группа вовлечена в систему водородных связей с амидной группой основной цепи Ser47 (3.39 А) и Lys48 (3.22 А). Ввиду того, что эти связи сохраняются и при взаимодействии АКФ с урокиназным рецептором, и относительная ориентация доменов АКФ при взаимодействии с рецептором не изменяется, авторы пришли к выводу, что молекула АКФ менее подвижна, чем было получено методом- ЯМР. Однако, вероятнее всего, молекула АКФ находится в динамическом равновесии между несколькими состояниями: 1 — домены независимы друг от друга и 2 — кратковременное взаимодействие доменов, запечатленное в кристалле. Тем более что структура белка в растворе более физиологична, чем законсервированная структура белка в кристалле. 1.2. Структура доменов урокиназы Ростовой домен урокиназы отвечает за связывание с высокоаффинным рецептором на поверхности клеток УКР (uPAR/CD87) [17] Кд=0.2-1 нМ. По своей структуре он гомологичен эпидермальному фактору роста. Похожей структурой обладают мышиный эпидермальный фактор роста mEGF, его структура была получена при рН 3.1 [156] и трансформирующий фактор роста a TGF-a при рН 6.3 [128]. . Структура ПДурокиназы. Ленточная модель, в виде набора стрелок ф-слои) или в виде спиралей (а-спирали), указывающих на карбокси-терминальный конец цепи (pdb 1LMW). Крингл-домен вовлечен в регуляцию миграции клеток под действием урокиназы [158], взаимодействие с гепарином через три последовательно расположенных аминокислотных остатка Arg108-Arg109-Arg110 [219]. Кринг-домен содержит участки связывания с ПАИ-1 [152] и интегринами [133; 183] Также показано, что КД принимает участие в стабилизации комплекса урокиназы с урокиназным рецептором [27]. По своей структуре он гомологичен кринглам: активатора плазминогена тканевого типа ТАП, плазминогена, протромбина, фактора XII и аполипопротеина [150]. Наибольшая гомология наблюдается со вторым кринг-доменом ТАП. Но, несмотря на это, эти домены обладают совершенно различными свойствами связывания, крингл-домен ТАП взаимодействует с положительно заряженным остатком лизина у фибрина, а крингл-домен урокиназы связывается с полианионными молекулами, такими как гепарин. И это свойство выделяет крингл-домен урокиназы из всех остальных кринглов. Как уже упоминалось, одной из основных функций урокиназы является протеолитическая активация плазминогена в плазмин. Перевод плазминогена в плазмин происходит при расщеплении одиночной пептидной связи в плазминогене (Arg561-Val562). Плазминоген является одним из самых распространенных проферментов в периферической крови (2 мМ). Главной ролью плазмина является поддержание проходимости сосудов, благодаря его эффективным фибринолитическим свойствам. Плазмин является внеклеточной протеазой с широкой субстратной специфичностью. При использовании фибринолитической функции плазмина в регуляции гемостаза, его активацию осуществляет тканевой активатор плазминогена (ТАП). В этом случае поверхность полимеризованного фибрина фактически обеспечивает предпочтительное микроокружение для ТАП-катализируемой активации плазминогена, благодаря наличию высокоаффинных мест связывания для крингл-доменов ТАП и более слабых «лизин-связывающих мишеней» для кригл-доменов в плазмине [106]. Таким образом, нерастворимый фибрин выполняет двойную функцию: во-первых, является физиологическим субстратом для генерации плазмина, а во-вторых, выступает в роли подложки для скопления реагирующих веществ в стимуляции ТАП-зависимой активации плазминогена. Однако если, мыши с нокаутом по ТАП не испытывали проблем с тромбозом, то у мышей с нокаутом по урокиназе наблюдалось пониженое давление [162] и повышенная склонность к тромбообразованию в ответ на гипоксию [49] и эндотоксины [41]. Также урокиназа играет роль в активации плазминогена на поверхности клеток. Эффективность активации плазминогена урокиназой главным образом зависит от ее связывания с высокоаффинным рецептором (УКР) на поверхности клеток (Kd = 0.1-1 пМ) [220]. Проурокиназа, связанная с поверхностью клеток, встречается с плазмином, локализованным на клеточной поверхности [80], после чего проурокиназа активируется плазмином [61], и положительная обратная связь замыкается, т.к. и плазмин, и дц-УК могут взаимно активировать неактивные формы друг у друга. Локализация активации плазмина определяется не только наличием рецепторов УК и плазминогена на поверхности клетки, ингибиторы плазмина а2-антиплазмин и а-макроглобулин полностью ингибируют его в растворе, но не способны образовывать с ним комплекс на клеточной поверхности [ИЗ], так как для связывания с этими ингибиторами требуется не только активный сайт в плазмине, но и лизин-связывающие участки в крингл-доменах. Помимо фибринолиза плазмин также участвует в расщеплении белков внеклеточного матрикса и базальной мембраны, таких как фибриноген, ламинин, коллаген. Кроме того, плазмин опосредует активацию матриксных металлопротеиназ — коллагеназы (ММП-1), стромелизина (ММП-3) и желатиназы В (ММП-9) [138]. Совместное действие комплекса активаторов плазминогена, плазмина и металлопротеиназ на плазматической мембране обеспечивает векторное передвижение клеток, как за счет разрушения межклеточных контактов и матрикса, так и благодаря активации или высвобождению латентных или связанных с матриксом факторов роста, обладающих хемотаксическими свойствами [3]. Путем образования плазмина урокиназа обеспечивает расщепление основных компонентов внеклеточного матрикса, ослабление межклеточных контактов и повышение внутритканевой подвижности клеток, принимая участие в регуляции ангиогенеза, ремоделирования сосудов, роста и метастазирования раковых опухолей. Урокиназа и плазминоген способны взаимодействовать с ганглиозидами - группой липидов, находящихся на внешней стороне плазматической мембраны [151]. Константа диссоциации комплекса урокиназы и ганглиозидов составляет 12 нМ. Предполагается, что ганглиозиды способствуют концентрированию урокиназы на мембране и, совместно с УКР, обеспечивают ее высокоаффинное связывание с клетками. Урокиназа также принимает участие в активации и высвобождении ряда факторов роста, связанных с межклеточным матриксом. Так, было показано участие урокиназы в активации HGF, который секретируется стромальными фибробластами в виде одноцепочечного биологически неактивного предшественника и накапливается в межклеточном матриксе. При расщеплении урокиназой происходит образование активного гетеродимера HGF [160]. Кроме того, урокиназа принимает участие в активации VEGF-189 [179] и, плазмин-зависимым образом, в активации TGF-(3 [204] и Сугбі [174]. 11.2. Адгезия и миграция Существует несколько моделей участия урокиназы в запуске клеточной миграции. Так как УКР лишен цитоплазматического домена, он не способен самостоятельно передавать сигнал внутрь клетки. В настоящее время описано, по меньшей мере, два типа рецепторов посредников, вовлеченных в передачу сигнала от УКР — интегрины и рецепторы, сопряженные с G-белками. Предполагается, что интегрины служат посредниками между комплексом УК-УКР и цитоскелетом клетки, опосредуя активацию адгезии и миграции клеток под действием урокиназы [56]. УКР играет важную роль в образовании кластеров интегринов и сигнальных молекул, что необходимо для эффективной передачи сигнала от интегриновых рецепторов [209]. При связывании урокиназы с УКР происходят конформационные изменения в УКР и его латеральной подвижности, что приводит к его физической ассоциации с интегринами [244]. Причем компоненты матрикса селективно индуцируют ассоциацию УКР и интегринов. Так, УКР и J33 интегрины способны образовывать комплексы только на витронектине, но не фибронектине, ламинине или полилизине. Интегрин а5 солокализовался с УКР на фибронектине, а5 и av — на витронектине, а аЗ и (36 — на ламинине [243]. Связывание урокиназы с рецептором сопровождается снижением его латеральной подвижности и локализацией рецептора преимущественно на участках межклеточных контактов. Тем самым УКР способен локализовать протеолитическую активность, опосредованную урокиназой, на лидирующем крае мигрирующей клетки [14; 58]. Плазмин принимает участие в деградации компонентов внеклеточного матрикса и, таким образом, клетка расчищает себе путь, при этом плазмин также активирует факторы роста, стимулирующие миграцию клеток. Помимо этого было показано, что урокиназа способна стимулировать миграцию гладкомышечных клеток [170], эндотелиальных клеток [169], эпителиальных клеток [43] и моноцитов [194] независимо от ее протеолитической активности. Ввиду отсутствия у УКР трансмембранного или цитоплазматического доменов для передачи сигнала внутрь клетки необходимо его взаимодействие с трансмембранным адаптером. В работе были использованы химические реактивы следующих фирм: электрофорезные реагенты Invitrogen Life technologies (США); CHAPS, Тритон Х-114, Тритон Х-100, тромбин — Sigma (США); колонки для гель-фильтрации PD-10, CNBr-активированная Сефароза «4 Fast Flow» — Amersham Bioscience AB (Швеция); Ni-NTA агароза — QIAGEN (США); апротинин (Trasylol) — Bayer (Германия); нейтравидин, конъюгированный с пероксидазои хрена, хемилюминесцентный субстрат "SuperSignal" West Pico, Флуоресцеин-5-малеимид — Pierce (США); Millipore/iCon concentrator 7ml/20k — Pierce (США); Millipore ultra 10k centrifugal filter, JA3 — Millipore (Ирландия); 96-и луночные планшеты «Stripwell Flat bottom» — Corning Inc. (США); меченая среда Silantes для роста E.Coli OD2 CN 13C l5N labeled rich growth media «Silantes» — (Silantes, Germany); РНКаза (Рибонуклеаза-1 марки A) — «ДиаМ» (Россия). Мышиные моноклональные антитела к УК человека (UNG, НЮ узнающие крингл-домен; UIG узнающие протеолитический домен урокиназы, Россия); моноклональные антитела к УКР («Monozyme», Дания); вторичные -антитела козы к иммуноглубулинам мыши, конъюгированные с пероксидазои хрена AffmiPure (Н + L) («Jackson ImmunoResearch», США); GAHUK биотинилированные поликлональные антитела козы к УК человека (Россия). Для ведения клеточных культур использовали материалы следующих фирм: модифицированная среда Дульбекко Игла (DMEM), RPMI1640, трипсин ЭДТА, пенициллин-стрептомицин, генетицин и гигромицин Б — Gibco (Invitrogen Corp., США); бычья эмбриональная сыворотка — HyClone (США). Очистка рекомбинантных форм белков Рекомбинантные формы белков были синтезированы штаммами, полученными методом трансформации клеток Е. coli плазмидами, кодирующими нативную урокиназу и формы урокиназы с различными модификациями. Конструирование плазмид, трансформация клеток Е. coli и сиквенс ДНК для подтверждения последовательности были проведены в сотрудничестве с лабораторией Генной инженерии Института Экспериментальной Кардиологии КНЦ. В работе использовали следующие формы урокиназы: АКФ — аминоконцевой фрагмент урокиназы, лишенный протеолитического домена; AK I (G/D) — аминоконцевой фрагмент урокиназы с заменой Gly16 на Asp16; КД — крингл-домен урокиназы (43-156 а.о.); УКАРД — урокиназа, лишенная ростового домена (43-411 а.о.); УКдт — урокиназа дикого типа (1-411 а.о.); YK(H/Q) — каталитически неактивная урокиназа с заменой His" на Gin" в активном центре; РД-ЦСД — химерный белок, состоящий из РД и целлюлозо связывающего домена (ЦСД), ЦСД. Клетки Е. coli, содержащие плазмиды, кодирующие формы УК, AKO(G/D), КД, УКАРД, УКдт, YK(H/Q), растили в среде LB Broth medium (Sigma) в присутствии ампицилина (150 мкг/мл) и канамицина (40 мкг/мл) в течение ночи при 37С и интенсивной аэрации (150 об/мин). Клетки Е. coli, содержащие плазмиды, кодирующие белки: АКФ, РД-ЦСД и ЦСД, — растили в среде LB Broth medium (Sigma) в присутствии канамицина (40 мкг/мл) при 37С и интенсивной аэрации ( 150 об/мин) до ОП (600нм) 0.6-0.7, затем добавляли IPTG до 1 мМ и растили 4 ч при 37С и интенсивной аэрации (150 об/мин). Затем осаждали центрифугированием при 6000 g в течение 30 мин. Далее все процедуры проводили при 4С. Полученный осадок клеток суспендировали в растворе лизоцима с концентрацией 1 мг/мл в дистиллированной воде (40 мл на 1 л культуры). Полученную суспензию инкубировали при перемешивании в течение 30 мин. Затем к суспензии последовательно добавляли 1М буфер трис/HCl, рН9.2 (1/10 от объема раствора лизоцима, 4 мл на 1л культуры), тритон Х-100 (конечная концентрация 1%), ЭДТА (конечная концентрация 1мМ), NaCl (конечная концентрация 0.8-1 М), а затем обрабатывали ультразвуком (3-4 раза по 40 сек при 80- 100 Вт на льду) до снижения вязкости раствора. Полученный раствор центрифугировали 10 мин при 20000 g. Супернатант отбрасывали, а осадок, содержащий тела включения с экспрессированными формами урокиназы, промывали несколько раз раствором 50 мМ трис/HCl, рН 7.5, содержащим 1 М NaCl, а затем раствором 50 мМ трис/HCl, рН 7.5. Промытый осадок растворяли в 6 М гуанидин/НС1, рН 9.0, содержащем ЮмМ Р-меркаптоэтанол (50 мл раствора на 0.5 л клеточной культуры), при необходимости подогревая раствор до 50-60С. Полученный раствор центрифугировали 10 мин при 20000 g. К полученному раствору медленно при перемешивании добавляли 10-кратный объем 1 М гуанидин/НС1, рН 9.0 (для РД-ЦСД и ЦСД 2М), содержащего Red/Ox пару 1 мМ глутатион восстановленный / 0.1 мМ глутатион окисленный. Полученный раствор белков оставляли для рефолдинга на 14 ч при температуре +4С. Рефолдинговую смесь центрифугировали 10 мин при 20000 g. Затем белковый раствор нейтрализовали 1 М НС1 / 1 М трис до значений рН 7.4-7.6. Очистку полученных рекомбинантных форм белков проводили хроматографическими методами. Первичную очистку проводили с использованием метода металлохелатной хроматографии: формы урокиназы УКАРД, УКдт, YK(H/Q) очищали на колонке с Си2+, а КД, РД-ЦСД, ЦСД и AK D(G/D), имеющие на С-конце последовательность из шести His — на колонке с Ni- . Дальнейшую очистку проводили и использованием аффинной хроматографии на колонках Sepharose 4В с иммобилизованными моноклональными антителами к урокиназе человека (моноклональные антитела к каталитическому и крингл-доменам урокиназы). Для форм, имеющих каталитический домен (УКАРД, УКдт, УК (H/Q)) очистку проводили на колонке с иммобилизованными моноклональными антителами UTG-1 к каталитическому домену урокиназы. Для АКФ, АКФ (G/D) и КД очистку проводили на колонке с моноклональными антителами НЮ к крингл-домену урокиназы. 5. Определение концентрации белка в пробах Концентрацию чистого белка определяли, измеряя поглощение при 280 нм и 320 нм и вычисляли по следующей формуле: концентрация белка = (величина поглощения 280 нм - величина поглощения 320 нм) / коэффициент экстинкции белка. Коэффициент экстинции для белков получали изходя из аминокислотной последовательности в программе Vector NTT. Определение количества белка в пробах проводили с помощью метода Бредфорд. Кумасси Бриллиантовый синий G-250 (100 мг) растворяли в 50 мл 95%-го раствора этанола, добавляли 100 мл 85%-го раствора фосфорной кислоты и доводили водой до 1 л. В образцы, содержащие 1-10 мкг белка в 0.1 мл, добавляли 1 мл реагента и перемешивали. Через 15 мин производили измерения при длине волны 595 нм. Концентрацию белка определяли по калибровочному графику для стандартного БСА. Для нашей работы мы выделили путем экспрессии в Е. coli следующие формы белков: АКФ — аминоконцевой фрагмент урокиназы, лишенный протеолитического домена; AK I (G/D) — аминоконцевой фрагмент урокиназы Рекомбинантные формы урокиназы, использовавшиеся в работе. АКФ — аминоконцевой фрагмент урокиназы, лишенный протеолитического домена, AK P(G/D) — аминоконцевой фрагмент урокиназы с заменой Gly16 на Asp1 , КД — крингл-домен, УКАРД — урокиназа, лишенная ростового домена, УКдт — урокиназа дикого типа, УЩН/Q) - каталитически неактивная урокиназа с заменой His204 на Gin204 в активном центре, РД-ЦСД - химерный белок, состоящий из РД и целлюлозо-связывающего домена (ЦСД), ЦСД; к. п. - обозначен конекшен пептид. с заменой аминокислотного остатка Gly16 на Asp16; КД - крингл-домен; УКАРД — урокиназа, лишенная ростового домена; УКдт —урокиназа дикого типа; yK(H/Q) — каталитически неактивная урокиназа с заменой His на Gin в активном центре; РД-ЦСД — химерный белок, состоящий из РД и целлюлозо-связывающего домена (ЦСД); ЦСД (Рис. 12). Рекомбинантные формы урокиназы: АКФ, AKO(G/D), КД, У КАРД, УКдт, УК(Н/ 3) выделяли, как описано в методах. Чистоту выделенных белков определяли по ДСН-электрофорезу (Рис. 13). ц# »,Л Рисунок 13. Рекомбинантные формы урокиназы, использовавшиеся в работе. 13%-ный ДСН-электрофорез в ПААГ. Разделение белков проводили в невостанавливающих условиях. УКдт — урокиназа дикого типа, УЩН/Q) - каталитически неактивная урокиназа с заменой His204 на Gin204 в активном центре, У КАРД — урокиназа, лишенная ростового домена, АКФ — аминоконцевой фрагмент урокиназы, лишенный протеолитического домена, AK0(G/D) — аминоконцевой фрагмент урокиназы с заменой Gly на Asp10, КД — крингл-домен. 5 мкг каждого белка наносили на дорожку, белки окрашивали кумасси R250. Выделенные формы урокиназы окрашивали 1) антителами UNG-5, специфичными для крингл-домена урокиназы и не взаимодействующими с близкими по структуре крингл-доменами других белков и 2) антителами UIG-1, специфичными для протеолитического домена урокиназы (Рис. 14). Видно, что формы содержащие в своем составе крингл-домен: УКдт, YK(H/Q), У КАРД, АКФ, AK I (G/D), КД окрашивали антителами UNG-5. Антитела UIG-1 окрашивали только формы урокиназы, содержащие протеолитический домен: УКдт, yK(H/Q), УКАРД. Так же видно, что димерные формы АКФ, AKO(G/D) и КД также окрашивали антитела к крингл-домену. «A V, ««v H Рисунок 14. Рекомбинантные формы урокиназы, использовавшиеся в работе. Белки разделяли с помощью ДСН-электрофореза в ПААГ, переносили на ПВДФ-мембрану и детектировали с помощью моноклоналъных антител к УК: a) UIG-1 - антитела к протеолитическому домену урокиназы человека, б) UNG-5 - антитела к крингл-домену урокиназы человека. УКдт — урокиназа дикого типа, УК(НЮ) - каталитически 0ҐЇ/4 "У fid неактивная урокиназа с заменой His на Gin в активном центре, УКАРД — урокиназа, лишенная ростового домена, АКФ — аминоконцевой фрагмент урокиназы, лишенный протеолитического домена, AK0(G/D) — аминоконцевой фрагмент урокиназы с заменой Gly16 на Asp16, КД — крингл-домен. Для исследования изолированного РД урокиназы пришлось сконструировать химерный белок. Такие белки, как изолированный ростовой домен урокиназы (РД), являются очень «маленькими». У бактерий Е. coli, несущих плазмиды, кодирующие такие белки, возникают трудности с их экспрессией. Поэтому необходимо было каким-то образом увеличить размер белков. В генно-инженерной практике часто используют технологию создания химерных белков (соединении в одной рамке трансляции нескольких кДНК, например, кДНК белка-носителя и кДНК исследуемого продукта) для увеличения уровня продукции и стабилизации рекомбинантных белков в клетках Е. coli [229], поэтому в лаборатории генной инженерии была сконструирована химерная конструкция РД-ЦСД. В качестве белка-носителя был выбран целлюлозосвязывающий домен (ЦСД) фермента эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilum. РД был представлен аминокислотной последовательностью gshmsnelhqvpsncdclnggtcvsnkyfsnihwcncpkkfggqhceidkskt. Между РД и ЦСД была вставлена линкерная часть, содержащая сайт для активации тромбином и 6 His на конце. Полученный белок эспрессировался под Т7 промотером. Клетки растили, как описано в методах. Для получения Растворимость РД-ЦСД в гуанидине. 13%-й ДСН-электрофорез в ПААГ. Тельца включення, соответствующие 250 мкл культуры, растворяли в 1 мл 100 мМ трис рН 8.3 буфера содержащего: 1 —4 М гуанидин, дорожки 1-4: соответственно. Затем образцы центрифугровали 10 мин при 11 т g. а) Осадок отмывали водой и растворяли в 20 мкл буфера О. б) Надосадочную жидкость высаживали 10% ТХУ, осадок отмывали 80% ацетоном, затем водой и растворяли в 20 мкл буфера О. Разделение белков проводили в восстанавливающих условиях, белки окрашивали кумасси R250. оптимальных условий рефолдинга изучали растворимость полученных телец включения в различных концентрациях гуанидина (Рис. 15). Как видно из Рис.15, оптимальным оказалось растворение в 2 М гуанидине. После выделения белка РД-ЦСД и очистки его на металл-хелатной колонке, белок переводили в фосфатно-солевой буфер. Выделенный белок инкубировали с тромбином для отделения РД от ЦСД (Рис 166). Затем от ЦСД домена отделяли с помощью центрикона 20 ША (Рис 16а). Полученный РД концентрировали с помощью центрикона 3 ША (Рис 16в). Получение РД. а) РД-ЦСД инкубировали 1 ч при 37С с тромбином; б) от ЦСД домена отделяли с помощью центрикона 20 kDA при 3 тыс. g. Белки разделяли с помощью Трицин - ДСН-электрофореза в ПААГ; в) 16% + 1 см 10% -6МЭ, г)16% + 1см 10% + 6М мочевины + 6МЭ. Белки окрашивали кумасси R250. . Изучение вторичной структуры РД, КД, АКФ После получения изолированного РД мы исследовали его вторичную структуру методом кругового дихроизма. Полученный вид спектра (Рис 17) характерен для белка с отсутствием вторичной структуры. Это очень интересный результат, потому что, как описано выше, выделяемые нами формы УК обладали физиологической активностью. Белки, обладающие доменами, гомологичными EGF, с замыканием S-S связей 1-3, 2-4, 5-6, обладают сходными вторичными структурами. Все ранее полученные данные о структуре АКФ урокиназы и в кристалле, и методом ЯМР говорят о наличии р-структуры в РД. Однако мы этого не наблюдали. В чем может быть причина? Мы предположили, что, может быть, дело в том, что крингл-домен каким-то образом влияет на правильное формирование структуры домена во время рефолдинга РД. Поэтому решили сравнить АКФ, РД и КД методом изменения флуроресценции триптофана при плавлении белка. Во-вторых, возможно неправильное замыкание S-S связей в РД при рефолдинге. В-третьих, необходимо сравнить связывание рекомбинантных форм с УКР относительно белка, полученного в эукариотических клетках. И в-четвертых — вероятно, РД может приобрести большую упорядоченность при взаимодействие с УКР, так как, как было показано ранее, РД плотно входит в кольцо, образованное тремя доменами УКР. Самым точным методом в этом случае был бы ЯМР. Итак, для выяснения, почему же РД получился неструктурированным, мы решили сравнить, будет ли наличие у РД вторичной структуры зависеть от того, находится ли он в составе АКФ или нет. Для этого использовали метод измерения флуроресценции триптофана при температурной денатурации белка. В структуре ростового домена находится один триптофан, в крингл-домене два. При повышении температуры в момент денатурация белка мы сможем наблюдать характерное изменение флуроресценции триптофанов, так как будет меняться их аминокислотное окружение. В качестве тестируемых белков взяли: РД, КД, АКФ, AK &(G/D). На Рисунке 18 представлены полученные графики, по оси абсцисс изменение температуры, а по оси ординат отношение значений флуроресценции при 380 и 320 нм.Структура урокиназы
Протеолитическая функция комплекса УК -УКР
Химические реактивы
Очистка рекомбинантных форм урокиназы человека
Похожие диссертации на Роль структуры ростового домена урокиназы во взаимодействии с урокиназным рецептором uPAR/CD87
