Введение к работе
Актуальность проблемы. В соответствии с современными представлениями усиленная продукция активных форм кислорода и азота вызывает комплекс патологических процессов и ответных реакций организма, обозначаемых соответственно окислительным и нитрозативным стрессами. [Halliwell, Chirico, 1993 Grisham et al., 1999; Pacher et al., 2007]. В свою очередь накопление активных карбонильных соединений (альдегидов и кетонов), способных, как и активные формы кислорода и азота, вызывать структурные и функциональные изменения биомолекул, приводит к карбонильному стрессу [Goldin et al., 2006; Schalkwijk 2007]. В связи с этим в последние годы возрос интерес к поиску антистрессовых соединений, способных продлить человеческую жизнь.
Основным предшественником активных форм кислорода (АФК) является анион-радикал супероксида. Образование активных форм азота определяется оксидом азота (NO) - простой молекулой, продуцируемой в биологических системах ферментативным путём [Schmidt, Murad, 1991]. Оксид азота выполняет функции одного из универсальных регуляторов биохимических и физиологических процессов. Например, NO вызывает расслабление гладких мышц сосудов, предотвращает агрегацию тромбоцитов, участвует в защите от патогенов, является нейромедиатором, регулирует программируемую гибель и пролиферацию клеток, а также играет важную роль в секреторной и репродуктивной системе [van Faassen, Vanin, 2007; Thomas et al., 2008]. Такое разнообразие обусловлено образованием физиологически активных метаболитов NO и его взаимодействием с различными молекулярными мишенями [Wink, Mitchell, 1998; Каламкаров и др., 2007; Осипов и др., 2007; Vanin, 2008]. Среди этих метаболитов особое место занимают S-нитрозотиолы и динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с тиол со держащими лигандами. Оба этих метаболита вовлечены в реализацию многих физиологических функций NO. Важнейшими из них являются - активация гемсодержащей гуанилатциклазы, ингибирование митохондриальных белков и регуляция активности ряда факторов транскрипции. Кроме того, S-нитрозотиолы и ДНКЖ, связанные с альбумином и гемоглобином, считаются основными формами
транспорта и депонирования N0 в кровеносной системе млекопитающих [Stamler et al., 1992; Muller et al., 2002; Vanin, Manukhina, 2007].
Известно, что в условиях окислительного и нитрозативного стрессов NO может выступать в качестве антиоксиданта, способного, например, подавлять процессы свободнорадикального окисления липидов [Bloodsworth et al., 2000; Schafer et al., 2002]. С другой стороны, при взаимодействии NO с супероксидом и молекулярным кислородом образуются активные формы азота, являющиеся сильными окислителями - пероксинитрит и диоксид азота [Pryor et al., 2006]. Эти процессы препятствуют функционированию NO как сигнальной молекулы. В настоящее время изучены реакции некоторых АФК с S-нитрозотиолами. Однако взаимодействие активных форм кислорода с динитрозильными комплексами железа до начала нашей работы практически не исследовалось. Между тем, положительное физиологическое действие этих комплексов при различных патологиях [Vanin, 2008] позволяет предположить, что ДНКЖ способны защищать компоненты биосистем от АФК, продуцируемых в условиях окислительного стресса.
Основной результат карбонильного стресса - гликирование и гликоокисление белков под действием метилглиоксаля, малонового диальдегида и других активных карбонильных соединений. Предполагается, что продукты неферментативного гликирования могут влиять на активность NO-синтазы, а также перехватывать оксид азота [Goldin et al., 2006], однако механизм этих процессов остается не ясным. Исходя из вышесказанного, мы полагаем, что проявление цитопротекторных (антиоксидантых) и цитотоксических свойств NO зависит от взаимодействия его метаболитов с интермедиатами окислительного и карбонильного стресса. В то же время эти реакции являются пересечением ключевых регуляторных путей в клетках и тканях живых организмов. Таким образом, особенно актуальным представляется исследование молекулярных механизмов нормальных и патологических процессов, происходящих в биологических системах с участием динитрозильных комплексов железа, АФК и карбонильных соединений.
Цель и задачи исследования:
Целью работы было изучение механизмов антиоксидантного и регуляторного действия ДНКЖ в биологических системах в условиях окислительного, нитрозативного и карбонильного стрессов. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать взаимодействие содержащих низкомолекулярные тиолы динитрозильных комплексов железа с АФК и пероксинитритом. Выяснить влияние этих реакций на физиологическое действие ДНКЖ.
-
Исследовать взаимодействие между динитрозильными комплексами железа, связанными с гемовыми и негемовыми белками и интермедиатами окислительного и нитрозативного стресса.
-
Изучить антиоксидантные и прооксидантные свойства метаболитов оксида азота в системах, моделирующих различные аспекты окислительного стресса.
-
Выявить особенности формирования и деструкции ДНКЖ в биологических системах, в том числе в митохондриях и бактериальных клетках.
-
Исследовать взаимодействие физиологически активных метаболитов оксида азота с редокс-активными интермедиатами карбонильного стресса.
-
Выяснить возможность образования новых типов ДНКЖ, связанных с продуктами взаимодействия активных карбонильных соединений с аминокислотами.
Научная новизна работы.
В представленной работе впервые обнаружено взаимодействие супероксида с различными типами ДНКЖ, приводящее к деструкции этих комплексов. Определена константа скорости реакции альбуминовых ДНКЖ с супероксидом. Установлено, что распад динитрозильных комплексов под действием гидропероксида водорода катализируется ионами железа, не входящими в эти комплексы. Показано, что гемовая группа катализирует взаимодействие ДНКЖ с гидропероксидом водорода и органическими гидропероксидами. В то же время, эффективность деструкции гемоглобиновых ДНКЖ под действием пероксинитрита существенно ниже, чем у комплексов,
связанных с альбумином. Сравнение антиоксидантного действия физиологических производных N0 в различных модельных системах показало, что содержащие глутатион ДНКЖ гораздо эффективнее, чем GS-NO, восстанавливают оксоферрильную форму миоглобина и ингибируют окислительную деструкцию р-каротина. Предложен механизм взаимодействия глутатионовых ДНКЖ с оксоферрильной формой гема. Впервые показано антиоксидантное действие нитрита и нитроксильного аниона при перекисном окислении гомогената миокарда крысы. В этой модели окислительного стресса установлено, что нитроксильный анион и связанные с альбумином ДНКЖ ингибируют деструкцию коэнзима Q. В разработанной модели окислительного стресса в культуре Е. coli обнаружено протекторное действие GS-NO. В этом исследовании выявлена корреляция между образованием ДНКЖ в бактериальных клетках и защитным действием GS-NO. Доказано, что источником ионов железа при формировании ДНКЖ может быть ферритин и митохондрии. Выяснен механизм образования супероксидного радикала в ходе реакции L-лизина с активным карбонильным соединением - метилглиоксалем. Обнаружено, что в этих условиях S-нитрозотиолы стимулируют образование свободных радикалов шиффовых оснований и метилглиоксаля. В условиях, моделирующих карбонильный стресс, обнаружены новые типы ДНКЖ, связанные с продуктами реакций аминокислот с метилглиоксалем. Полученные оригинальные результаты позволили сформулировать гипотезу о функционировании ДНКЖ и S-нитрозотиолов в качестве регуляторов динамического равновесия защитных и деструктивных процессов при окислительном, нитрозативном и карбонильном стрессе.
Научно-практическая значимость работы.
Из вышеизложенного следует, что физиологические производные оксида азота играют чрезвычайно важную роль как в нормальных условиях существования человеческого организма, так и при патологических состояниях, сопровождающихся окислительным, и карбонильным стрессом (к таким
патологиям относятся атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, диабет, нейродегенеративные заболевания, катаракта, рак, и др.). Полученные в диссертационном исследовании экспериментальные данные позволяют лучше понять роль ДНКЖ и других метаболитов оксида азота в процессах модификации биологических молекул активными формами кислорода и карбонильными соединениями и могут быть использованы для оптимизации применения препаратов доноров оксида азота (нитроглицерин и другие пролонгированные нитраты). Результаты исследования антиоксидантного действия динитрозильных комплексов железа, а также влияния АФК на сосудорасширяющее действие ДНКЖ имеют важное значение для разработки на основании этих комплексов новых полифункциональных фармакологических препаратов. Разработаны новые экспериментальные модели для исследования окислительного, нитрозативного и карбонильного стресса, в том числе с использованием экспрессирующей легоглобин культуры Е. coli.
Апробация работы.
Результаты исследований докладывались на двенадцати российских и международных конференциях и симпозиумах: XI Международной конференции по химии органических и элементоорганических пероксидов (Москва, 2003), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии (Москва, 2005), IV, V и VI научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск. 2005, 2007, 2009), XIV, XV и XVI международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармокологии и экологии» (Украина, Гурзуф, 2006, 2007 и 2008), 4-ой международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Украина, Судак, 2008), Vllth International Workshop on EPR (ESR) in Biology and Medicine (Poland, Krakow, 2007), международной научной конференции и восьмом съезде Белоруссокого общественного обединения фотобиологов и
биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Беларусь, Минск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 статей в рецензируемых изданиях, из них 21 в отечественных и 4 в международных.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырёх глав, посвященных результатам и их обсуждению, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 332 страницах, содержит 96 рисунков и 5 таблиц. Список цитируемой литературы включает 639 источник.
