Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Оксидативный стресс и динамика морфофункционального состояния центральной нервной системы 13
1.1. Механизмы развития оксидативного стресса в нервной ткани 13
1.2. Активные формы кислорода как индукторы ковалентных модификаций липидов и белков нервной ткани 22
1.3. Роль оксидативного стресса в регуляции функционального состояния нервной ткани 31
1.4. Морфогенетическая роль МАО-Б зависимого оксидативного стресса в центральной нервной системе 39
Глава 2. Материал и методы исследования 42
2.1. Материал исследования 42
2.2. Методы исследования 43
Глава 3. Собственные исследования 57
3.1. Возрастная динамика оксидативного стресса в гиппокампе на этапах постнатального онтогенеза человека 57
3.1.1.Возрастные изменения активности моноаминоксидазы-Б в гиппокампе на этапах раннего постнатального онтогенеза человека 57
3.1.2. Возрастные изменения активности супероксиддисмутазы, каталазы и содержания ферментно-активного церулоплазмина в гиппокампе на этапах раннего постнатального онтогенеза человека 62
3.1.3. Возрастная динамика устойчивости гиппокампа к оксидативному стрессу на этапах раннего постнатального онтогенеза человека 73
3.1.4. Возрастные изменения содержания продуктов перекисного окисления липидов в гиппокампе на этапах раннего постнатального онтогенеза человека 81
3.1.5. Возрастные изменения содержания продуктов окислительной модификации белков в гиппокампе на этапах раннего постнатального онтогенеза человека 97
3.2. Возрастная динамика клеточного состава гиппокампа на этапах раннего постнатального онтогенеза человека 101
3.2.1. Возрастная динамика содержания нейронов в гиппокампе на этапах раннего постнатального онтогенеза человека 101
3.2.2. Возрастная динамика содержания глиоцитов в гиппокампе на этапах раннего постнатального онтогенеза человека 117
Глава 4. Заключение 153
Выводы 169
Список литературы 171
- Механизмы развития оксидативного стресса в нервной ткани
- Активные формы кислорода как индукторы ковалентных модификаций липидов и белков нервной ткани
- Материал исследования
- Возрастная динамика оксидативного стресса в гиппокампе на этапах постнатального онтогенеза человека
Введение к работе
Актуальность проблемы
Оксидативный стресс (ОС) играет важную роль в развитии возрастной
инволюции центральной нервной системы (ЦНС) и нейродегенеративных
заболеваний (Smith М.А. et al., 1997; Nunomura A. et al., 1999; Aksenov M.Y.,
2001; Butterfield D.A., 2002; Mattson M.P. et al., 2002; Perry G. et al., 2002;
Poon H.F. et al., 2002; Mariani E. et al., 2005; Favier A., 2006; Szeto H.H., 2006).
Данный' процесс связан с повреждением клеток нейроэктодермального
происхождения. Аналогичный механизм лежит и в основе
нейродистрофических изменений при сахарном диабете, обуславливая
развитие нейропатических осложнений этого чрезвычайно
распространенного заболевания (Дедов И.И. и др., 2004; Гуревич К.Г., 2005; Волчегорский И.А., Местер Н.В., 2007; Местер Н.В., 2007; Biessels G.J. et al., 2002; Messsier С, 2005; Pasquier F. et al., 2006).
Структуры «древней коры» головного мозга человека играют важную роль в реализации когнитивных функций и нейроэндокринной регуляции (Боголепова И.Н., 1970; Отмахов Н.А., 1993; Буклина СБ. и др., 1998; Арушанян Э.Б., 1999; Sloviter R.S. et al., 1996; Vizi E.S., Kiss J.P., 1998; Saitoh O. et al., 2001; Isaacson R.L., 2002; Bartesaghi R., 2004; Czapinski P. et al., 2005; Munoz M., Insausti R., 2005; Gogtay N. et al., 2006). Гиппокамп является объектом пристального внимания кардиологов, эндокринологов, неврологов и гериатров. Это связано с тем, что нейродегенеративное поражение данного отдела «древней коры» лежит в основе развития когнитивных и аффективных расстройств при артериальной гипертонии, сахарном диабете, болезни Альцгеймера и «нормального» старения человека (Peila R. et al., 2002; Schmidt R. et al., 2004; Vincent A.M. et al., 2004).
Высокая медико-социальная значимость проблемы патологии гиппокампа вызывает закономерный интерес к изучению механизмов повреждения палеокортекса. К числу центральных механизмов повреждения этой
структуры мозга принято относить ОС. Данный процесс связан с развитием дисбаланса между продукцией свободно-радикальных форм кислорода и их обезвреживания (Болдырев А.А., 2001а; Голиков А.П. и др., 2003; Rojkind М. et al., 2002; Liu R. et al., 2003; Ahmed R.G., 2005; Kulak W. et al., 2005).
Особую роль в индукции нейронального ОС играет моноаминооксидаза (МАО), которая является важнейшим ферментом нейромедиаторного обмена и играет ключевую роль в регуляции поведения и эмоций (Горкин В.З., 1981; Grimsby J. et al, 1991; Zhu Q.S. et al., 1992; Sablin S.O, Ramsay R.R., 1998). В настоящее время описаны две формы фермента: МАО-А и МАО-Б, отличающиеся друг от друга по субстратной специфичности и чувствительности к ингибиторам (Горкин В.З. и др., 1984; Каган В.Е. и др., 1984; Горошинская И.А., 1985; Медведев А.Е. и др., 1995; Кнолл Дж., 1997; Johnston J.P., 1968; Willoughby J. et al., 1988; Hashizume С et al., 2003).
МАО-А предпочтительно дезаминирует серотонин, норадреналин (Горкин В.З., 1981). Специфическим ингибитором данной формы фермента является -хлоргилин, который в низких концентрациях оказывает избирательное, угнетающее действие на активность МАО-А. Другая форма фермента -МАО-Б обладает субстратной специфичностью в отношении (3-фенилэтиламина и бензиламина и специфически угнетается в присутствии низких концентраций депренила (Кнолл Дж., 1997). Биогенным субстратом МАО-Б в мозге человека является дофамин (Горкин В.З., 1981). Обе формы фермента по субстрат-независимому механизму продуцируют перекись водорода, роль которой в индукции ОС общеизвестна (Konradi С. et al., 1986). Важно добавить, что в условиях ОС активность МАО-А снижается, а МАО-Б нарастает.
Особая роль МАО-Б в развитии церебрального ОС связана с тем, что в головном мозге человека данная форма фермента является преобладающей и на ее долю приходится 80-90% всей МАО-активности мозга (Kalaria R.N. et al., 1988). Установлено, что в отличие от МАО-А, экспрессирующейся преимущественно в катехоламинэргических нейронах, МАО-Б
7 обнаруживается в серотонинэргических нейронах и клетках астроглии
(Евтушенко С.К. и др., 2002; Nakamura S. et al., 1990; Ekblom J. et al, 1993;
Carlo P. et al., 1996; Vitalis T. et al., 2002).
В динамике старения человека церебральная активность МАО-Б непрерывно нарастает (Волчегорский И.А. и др., 2001, 2003; Wong W.K. et al., 2002), что сопровождается возрастным снижением устойчивости различных отделов головного мозга к ОС и накоплением в них продуктов липидной пероксидации (Волчегорский И.А. и др., 2005; Малиновская Н.В., 2002; Шемяков С.Е., 2003). Гистохимически этот процесс проявляется угнетением узловых дегидрогеназ тканевого дыхания (НАД-диафораза и СДГ), редукцией капиллярного русла, уменьшением числа нейроцитов и развитием заместительного глиоза. Необходимо добавить, что в стволовых структурах мозга, нейроны которых особо богаты МАО-Б, возрастная экскалация ОС проявляется наиболее ярко (Волчегорский И.А. и др., 2003; Шемяков С.Е., 2003).
Возрастное увеличение МАО-активности в ЦНС обусловлено поздним онтогенетическим нарастанием уровня глюкокортикоидов, которые индуцируют экспрессию в ЦНС МАО-Б, но не МАО-А (Kalaria R.N. et al., 1988; Carlo P. et al., 1996). Кроме того ОС, который развивается в процессе старения, также благоприятствует экспрессии МАО-Б за счет редокс-активации протеинкиназы С (Knapp L.T., Klann Е., 2002).
В литературе практически отсутствуют интегрированные данные о возрастной динамике активности МАО-Б, содержании маркеров ОС и сопутствующих изменениях клеточного состава гиппокампа и зубчатой извилины на этапах раннего постнатального онтогенеза человека. Вместе с тем этот вопрос является достаточно важным, так как известно, что умеренно выраженный ОС способствует нейрональной пластичности, регуляции высших интегративных функций ЦНС и мобилизации пластического потенциала клетки (Moldovan L., Moldovan N.I., 2004; Haynes R.L. et al., 2006; Forster E. et al., 2006; Hu D. et al., 2007). Получены данные о том, что
8 умеренно выраженный ОС может играть существенную регуляторную роль в контроле морфогенеза структур «древней коры» у мышей (Li Y.-F. et al., 2004; Watson J.B. et al., 2006).
Вместе с тем чрезмерная активация свободно-радикального окисления сопровождается широким вовлечением палеокортикальных нейронов в процессы апоптоза, что ведет к снижению объема «древней коры» и сопутствует формированию когнитивных дисфункций (Lobnig В.М. et al., 2005). В связи с изложенным, вопрос о морфогенетической роли ОС в структурах «древней коры» на этапах раннего постнатального развития человека заслуживает отдельного изучения.
Цель исследования
Установить возрастные закономерности динамики показателей оксидативного стресса в сопоставлении с характеристиками клеточного состава структур «древней коры» на этапах раннего постнатального онтогенеза человека.
Задачи исследования
Изучить онтогенетическую динамику активности моноаминоксидазы-Б в гиппокампе и зубчатой извилине человека начиная с рождения и до 21 года.
Исследовать активность ферментов превентивной антиоксидантной защиты (Си,2п-зависимой супероксиддисмутазы, каталазы и церулоплазмина) в структурах «древней коры» на этапах раннего постнатального развития человека.
Изучить возрастную динамику устойчивости различных отделов палеокортекса к оксидативному стрессу in vitro начиная с рождения и до 21 года.
Исследовать динамику содержания продуктов липидной пероксидации и окислительной модификации белков в структурах «древней коры» человека на этапах раннего постнатального онтогенеза человека.
5. Изучить динамику клеточного состава гиппокампа и зубчатой
извилины на протяжении раннего постнатального развития человека.
6. Выявить взаимосвязь между изменениями биохимических показателей
оксидативного стресса и клеточного состава палеокортекса на этапах раннего
постнатального онтогенеза человека.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное биохимико-морфологическое исследование динамики возрастных изменений в гиппокампе и зубчатой извилине человека на протяжении периодов фетального развития, новорожденности, грудного и раннего возрастов, первого и второго периодов детства, подросткового и юношеского возрастов. Впервые установлена роль МАО-Б-зависимого ОС как фактора, контролирующего структурно-функциональное созревание структур «древней коры» на этапах фетального и раннего постнатального развития человека. Впервые продемонстрировано, что онтогенетическое увеличение активности МАО-Б и сопутствующее снижение активности каталазы в период с момента рождения до 3-х лет создает оптимальный метаболический фон для пролиферации и дифференцировки нейронов и глиоцитов нейроэктодермального происхождения в структурах лимбической системы. Дальнейшее нарастание МАО-активности с 3-х лет до 21 года сопровождается уменьшением содержания нейронов, астроцитов и олигодендроцитов практически во всех отделах гиппокампа и зубчатой извилине. Впервые продемонстрировано, что снижение активности Си,2п-зависимой супероксиддисмутазы с компенсаторным нарастанием каталазной активности и содержания церулоплазмина в палеокортикальных отделах в первый период детства и до юношеского возраста обеспечивает онтогенетический прирост устойчивости к ОС. Впервые показаны особенности ранней онтогенетической динамики содержания продуктов ПОЛ и ОМБ в различных отделах гиппокампа и зубчатой извилине человека. Впервые проведено комплексное сопоставление
10 возрастной динамики биохимических показателей ОС в структурах «древней коры» человека с характеристиками клеточного состава данной области головного мозга. Впервые обосновано положение о роли МАО-Б-зависимого ОС, как фактора регуляции возрастной динамики основных клеточных популяций структур «древней коры» на этапах раннего постнатального онтогенеза человека.
Практическая и теоретическая ценность работы
Работа носит фундаментально-теоретический характер.
На основании комплексного биохимико-морфологического исследования вскрыты фундаментальные закономерности морфогенетической роли ОС в отделах гиппокампа и зубчатой извилине на этапах раннего постнатального онтогенеза человека.
Результаты проведенного биохимико-морфологического исследования дополняют и расширяют систему существующих представлений о роли ОС в регуляции и функции ЦНС и могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах гистологии, анатомии, биохимии, физиологии и неврологии.
Выявленные взаимосвязи активности МАО-Б, процессов ПОЛ и ОМБ с морфологическими изменениями в структурах «древней коры» на этапах раннего постнатального онтогенеза человека могут быть использованы как теоретическая база для разработки новых подходов профилактики и терапии нейродегенеративных поражений ЦНС.
Результаты проведенного исследования существенно расширяют представления об окислительном метаболизме критических периодов развития структур «древней коры» головного мозга человека. Выявленные закономерности могут использоваться в разработке дифференцированных стратегий нейропротекций в зависимости от возраста ребенка, страдающего неврологической патологий.
Основные положения, выносимые на защиту
Раннее постнатальное развитие человека сопровождается фазными изменениями устойчивости палеокортикальных структур к оксидативному стрессу. Данный параметр снижается в течении первых трех лет жизни в структурах гиппокампа, а в последующем нарастает вплоть до 21 года. В зубчатой извилине устойчивость к оксидативному стрессу достигает максимума к подростковому возрасту с последующим трехкратным снижением к юношескому периоду.
Раннее снижение устойчивости структур гиппокампа к оксидативному стрессу связано с возрастным увеличением активности МАО-Б и одновременным снижением активности Си^п-зависимой СОД. Компенсаторное нарастание активности каталазы и содержания ферментноактивного церулоплазмина обуславливает устойчивость структур «древней коры» к оксидативному стрессу в период старше 3-х лет.
Нарастание устойчивости гиппокампальных структур к оксидативному стрессу в период с 3 лет до 21 года сопровождается увеличением уровня содержания продуктов окислительной модификации белков с одновременным снижением уровня продуктов перекисного окисления липидов.
Транзиторное снижение устойчивости к оксидативному стрессу палеокортикальных структур в течении первых трех лет жизни человека сопровождается интенсивной пролиферацией и дифференцировкой нейронов и глиоцитов нейроэктодермального происхождения в структурах гиппокампа. На фоне максимальной устойчивости к оксидативному стрессу в период с 3 до 16 лет отмечается дальнейшее нарастание числа глиоцитов и одновременное уменьшение числа гиппокампальных нейронов.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.
12 Апробация работы
Основные положения работы доложены, обсуждены и опубликованы на научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2005; 2006); на конференции, посвященной 25-летию ЦНИЛ ЧелГМА (2006); на научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием (Екатеринбург, 2006); на третьей Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007); на совместном совещании кафедр биохимии, фармакологии и анатомии человека в рамках расширенного заседания областного отделения Всероссийского научного общества АГ (Челябинск, 2007).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 213 страницах, содержит 35 таблиц и 48
рисунков; состоит из введения, обзора литературы, описание
использованных материалов и методов исследования, главу собственных исследований, обсуждение результатов, заключения и выводов. Список литературы включает 411 источников (ПО отечественных и 301 зарубежных).
Механизмы развития оксидативного стресса в нервной ткани
Состояние ОС связано с развитием дисбаланса между продукцией активных форм кислорода (АФК) и их обезвреживания (Болдырев А.А., 2001а; Меньшикова Е.Б. и др., 2006; Davies К.J.А., 2000; Rojkind М. et al., 2002; Liu R. et al., 2003). ОС играет важную роль в регуляции структурно-функционального состояния ЦНС (Биленко М.В., 1989; Baek B.S. et al., 1999). Данный процесс связан с высоким потреблением нервной тканью кислорода, большим содержанием полиненасыщенных жирных кислот и железа, относительно низкой активностью ферментов антиоксидантной защиты (Болдырев А.А., 2001а; Halliwell В., 1992; Mahadik S.P., Mukherjee S., 1996; Gaeta A., Hider R.G., 2005; Sayre L.M. et al., 2005). Необходимо добавить, что головной мозг новорожденных и детей первых лет жизни, в отличие от людей пожилого возраста, более восприимчив к окислительному повреждению (Mishra О.Р., Delivoria-Papadopoulos М., 1988; Buonocore G. et al., 2001; Bayir H. et al, 2006).
Митохондрии, являющиеся «энергетическими станциями клетки» (Марри Р. и др., 1993), считаются важнейшими источниками ОС, потребляющие от 85 % до 90 % кислорода поступающего в клетку (Szeto Н.Н, 2006). Функционирование первого и третьего комплексов цепи электронного транспорта митохондрий (рис. 1) в качестве побочного продукта окисления может генерировать значительные количества супероксид-аниона (Nicholls D.G, Budd S.L, 2000; Han D. et al, 2001, 2002; St-Pierre J. et al, 2002; Chen Q. et al, 2003; Gyulkhandanyan A.V, Pennefather P.S., 2004; Szeto H.H, 2005), который несмотря на важную роль в индукции свободнорадикальных процессов в клетке, является сравнительно слабым оксидантом (Ланкин В.З. и др., 2001; Меньшикова Е.Б. и др, 2006; Turrens J.F, 2003).
Не умаляя центральную роль митохондрий как индукторов ОС в нервной ткани, необходимо подчеркнуть, что определенный вклад в продукцию АФК осуществляют внемитохондриальные факторы, такие как: нейрональные НАДНФ-оксидаза, ксантиноксидоредуктаза и ферментные системы пероксисом (Меныцикова Е.Б. и др., 2006; Chae H.Z. et al., 1994; Keller J.N. et al.3 2000; Ding Q., Keller J.N., 2001; Grune T. et al., 2001; Ding Q. et al., 2003; Sullivan P.G. et al., 2004).
Наиболее важным оксидантом в живых системах является НгСЬ, которая формируется в процессе ферментативной дисмутации 02 супероксиддисмутазой и способна диффундировать через митохондриальные мембраны, вовлекая в ОС остальные клеточные структуры (Szeto Н.Н., 2006; Vincent A.M. et al., 2004).
Выделяют 3 основные формы супероксиддисмутазы: Си п-зависимая СОД - СОДІ, Mn-зависимая СОД - СОД2 и внеклеточная - СОДЗ (Меныцикова Е.Б. и др., 2006; Ни D. et al., 2007). Наиболее распространенной является CUjZn-СОД [супероксид: супероксидооксидоредуктаза; КФ 1.15.1.1], содержащаяся в межмембранном пространстве митохондрий, цитоплазме и на поверхности пероксисом. Mn-зависимая СОД локализуется в матриксе митохондрий. Высокая активность внеклеточной СОД регистрируется в диэнцефальной области головного мозга (Oury T.D. et al., 1999). Важно добавить, что Си,2п-СОД является не только Н202-генерирующим ферментом, но и способна вызывать разложение перекиси водорода на 02 и ОН . Это обстоятельство свидетельствует о том, что в определенных условиях СОДІ может выступать не столько в роли компонента АОЗ, сколько в качестве мощного индуктора цитоповреждающего ОС. Такая ситуация складывается при взаимодействии с высокими концентрациями Н2Ог (Меныцикова Е.Б. и др., 2006).
Избыточная экспрессия Cu,Zn-COfl может привести к подавлению синтеза других антиоксидантных ферментов, что делает клетки более уязвимыми к окислительной атаке (Meneghini R. et al., 1995; Ripps M.E. et al., 1995; Andrus
Р.К. et al., 1998; Jaarsma D. et al., 2000). Необходимо добавить, что гиперэкспрессия Cu-Zn-зависимой СОД в неонатальном мозге (Vannucci S J., Hagberg Н., 2004), формирует базу для усугубленного развития ОС и сопутствующего тканевого повреждения при гипоксии и церебральной ишемии.
Особую роль в индукции нейронального ОС играет моноаминооксидаза [МАО; амин: кислород оксидоредуктаза (дезаминирующая), (содержащая флавин); КФ 1.4.3.4], которая является важнейшим ферментом нейромедиаторного обмена и играет ключевую роль в регуляции поведения и эмоций (Москвитина Т.А. и др., 1977; Горкин В.З., 1981; Kochersperger L.M. et al., 1985; Bach A.W. et al., 1988; Grimsby J. et al., 1991; Zhu Q.S. et al., 1992; Sablin S.O, Ramsay R.R., 1998). В настоящее время подробно описаны две формы фермента: МАО типа А и МАО типа Б, отличающиеся друг от друга по субстратной специфичности и чувствительности к ингибиторам (Бауманис Э.А. и др., 1978; Северина И.С., 1979; Мелконян М.М. и др., 1980; Камышанская Н.С., Москвитина Т.А., 1981; Гриднева Л.И. и др., 1983; Москвитина Т.А. и др., 1983; Горкин В.З. и др., 1984; Каган В.Е. и др., 1984; Горошинская И.А., 1985; Медведев А.Е. и др., 1995; Кнолл Дж., 1997; Johnston J.P., 1968; Willoughby J. et al., 1988; Hashizume С et al., 2003). MAO-A предпочтительно дезаминирует серотонин, норадреналин. Специфическим ингибитором данной формы фермента является хлоргилин, который в низких концентрациях оказывает избирательное, угнетающее действие на активность МАО-А.
Активные формы кислорода как индукторы ковалентных модификаций липидов и белков нервной ткани
АФК оказывают влияние на биологические структуры за счет индукции ковалентных модификаций нуклеиновых кислот, липидов и белков (Ланкин В.З. и др., 2000, 2001; Halliwell В., 1992; Stadtman E.R., 1992; Shacter Е., 2000). Невзирая на бурное развитие концепции о нервной стволовой клетке (Kaplan M.S., Bell D.H., 1984; Gould E., Cameron H.A., 1996; Kemperman G. et al., 1997; Parent J.M. et al., 1997; Eriksson P.S. et al., 1998; Cameron H.A., McKau R.D.G., 1999; Gould E. et al., 2000; Rietze R. et al., 2000; Mattson M.P. et al., 2002; Guidi S. et al., 2004), следует подчеркнуть, что ЦНС в основном представлена высокодифференцированными клетками практически не способными к делению (постмитотическими клетками) (Hussain Т. et al., 1984; Vincent A.M. et al., 2004). Это обстоятельство свидетельствует о том, что ковалентно модифицированные нуклеиновые кислоты, детектируемые главным образом по 8-гидроксигуанину (Mecocci P. et al., 1994; Gabbita S.P. et al., 1998; Nunomura A. et al., 1999), имеют меньшее функциональное значение для нервной ткани, по сравнению с тканями, характеризующимися высоким митотическим потенциалом (Vincent A.M. et al., 2004). Наиболее функционально-значимыми маркерами ОС в ЦНС считаются продукты ковалентной модификации полиеновых липидов и белков (Vincent A.M. et al., 2004).
Структурную основу биологической мембраны составляет двойной слой фосфолипидов, «инкрустированный белками» (Антонов В.Ф., 1996). Кроме фосфолипидов и белков в биологических мембранах содержатся холестерин, гликолипиды, гликопротеиды (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995; Антонов В.Ф., 1996; Чизмаджев Ю.А., 2000; Болдырев А.А., 20016; Farooqui А.А. et al., 2007). Фосфолипиды содержат ненасыщенные остатки жирных кислот, являющиеся преимущественным субстратом повреждающего действия свободных радикалов (Владимиров Ю.А., Арчаков A.M., 1972; Биленко M.B., 1989; Ланкин В.З. и др., 2000; Adibhatla R.M. et al., 2003).
Обсуждая липидмодифицирующее действие АФК, необходимо подчеркнуть особую роль Н2О2 в индукции свободнорадикального (перекисного) окисления липидов. Это обстоятельство связано с тем, что будучи нейтральной, относительно липофильной молекулой, Н2С 2 беспрепятственно диффундирует через липидный бислой биологических мембран. Вступая в контакт с Fe , перекись водорода превращается в высокоактивный ОН . При взаимодействии ОН с полиненасыщенными ацилами происходит образование алкильных радикалов, которые мгновенно реагируют с кислородом, образуя активные гидропероксидные радикалы.
Примечание: LH - ненасыщенный липид І/ - алкильный радикал L02" - гидропероксидный радикал LOOH - липидный гидропероксид Гидропероксидные радикалы окисляют новые молекулы липидов с образованием липидных гидропероксидов, а они, будучи очень нестойкими соединениями, спонтанно или при участии ионов Fe"+, разлагаются с образованием алкоксильных радикалов. Последние, в свою очередь, инициируют дельнейшее свободнорадикальное окисление липидов. Циклы сводобнорадикального окисления постоянно воспроизводятся и процесс носит цепной характер (Марри Р. и др., 1993; Ланкин В.З. и др., 2000; Владимиров Ю.А., 2000; Esterbauer Н. et al., 1991). Свободнорадикальное окисление полиеновых ацилов фосфолипидов сопровождается стереотипной перегруппировкой двойных связей с формированием конъюгированных (диеновых) структур (Halliwell В. et al., 1985). Это обстоятельство лежит в основе принципа аналитической детекции продуктов ПОЛ (Плацер 3. и др., 1970; Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983; Костюк В.А. и др., 1984; Волчегорский И.А. и др., 2000а). Диеновые конъюгаты (ДК) рассматриваются как маркер первичных молекулярных продуктов ПОЛ и отражают уровень липидных ацилгидроперекисеи. При взаимодействии ацилгидроперекисеи с металлами переменной валентности происходит разветвление цепей с формированием алкоксильного радикала, в последующем трансформирующегося в структуры, содержание кетодиеновые группировки и сопряженные триены (КД и СТ). Спектрофотометрическое определение КД и СТ позволяет извлечь информацию об уровне вторичных молекулярных продуктов ПОЛ, отражающих глубокие стадии свободнорадикальной деструкции липидов.
Необходимо добавить, что ПОЛ-модифицированные ацилы глицерофосфолипидов становятся предпочтительным субстратом фосфолипазы А2, которая «вырезает» их из структуры мембранных липидов (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995; Rosenberger Т.A. et al., 2003; Sun G.Y. et al., 2004). При этом, данный процесс наблюдается не только в головном мозге, но и в других органах (Tan K.N. et al., 1984; Sevanian A., Kim E., 1985; Sevanian A. et al., 1988).
В отличие от эфирносвязанных ацилгидроперекисеи, экстрагируемых в основном изопропанольной фазой, продукты пероксидации свободных жирных кислот характеризуются высоким сродством к гептановой фазе (Плацер 3. и др., 1970; Волчегорский И.А. и др., 2000а). Таким образом, спектрофотометрическое определение ДК, КД и СТ в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта позволяет получить детализированную информацию о стадийности свободнорадикального повреждения и сопутствующей фосфолипидной деградации мембранных липидов.
Обсуждая процессы ПОЛ важно отметить, что его предпочтительным субстратом являются жирнокислотные остатки в структуре фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина, локализующиеся, в основном, во внутреннем слое биологических мембран (Марри Р. и др., 1993; Jain S.K., 1985). Ненасыщенность этих фосфолипидов превышает соответствующую характеристику фосфатидилхолина и обусловливает их наибольшую уязвимость к процессам ПОЛ (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995; Львовская Е.И., 1998; Jain S.K., 1985). На митохондриальном уровне преимущественным субстратом ПОЛ является кардиолипин (Adibhatla R.M. et al., 2003), играющий важную роль в компартментализации цитохрома С (Petrosillo G. et al., 2003; Szeto H.H., 2006). Отмеченные обстоятельства иллюстрируют потециальную вовлеченность процессов ПОЛ в регуляцию фосфолипидной асимметрии и функционального состояния митохондрий. Известно, что свободно-радикальное окисление фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина способствует их транслокации во внешний слой биологической мембраны. Данное обстоятельство приводит к нарушению фосфолипидной асимметрии мембран (Jain S.K., 1985). Перечисленные факты отражают общеизвестное значение ПОЛ, как в регуляции функционального состояния клетки (Dmitriev L.A., 2007), так и в реализации разнородных мембраноповреждающих воздействий (Болдырев А.А., 2001; Меньщикова Е.Б. и др., 2006).
Материал исследования
Объектом исследования послужили препараты «древней коры», полученные при аутопсии 166 трупов людей младше 22 лет, погибших в возрасте от 1 дня до 21 года от заболеваний или травм, не связанных непосредственно с заболеваниями центральной нервной системы. Материал для исследования получали в Челябинском областном бюро судебно-медицинской экспертизы и в областном детском паталогоанатомическом бюро. Наиболее частой причиной смерти являлись: механическая асфиксия (46 случаев), травмы (43 случая), пневмония (33 случая), отравления (19 случаев), утопление (18 случаев), кишечная непроходимость (5 случаев), врожденная кардиомиопатия (1 случай) и надпочечниковая недостаточность (1 случай). Препараты фетального гиппокампа были получены при аутопсии 33 плодов, погибших в результате прерывания беременности по медицинским показаниям со стороны матери на сроке 25-30 недель.
Образцы головного мозга для биохимического раздела исследования получали не позднее 12 часов с момента наступления смерти. Морфологический раздел работы выполнен на препаратах, полученных не позднее 24 часов с момента констатации смерти. Ни один из изученных показателей не продемонстрировал значимой корреляционной зависимости от давности наступления смерти. Из исследования исключались препараты с признаками ишемического, геморрагического и травматического поражения.
Основной объем исследований был проведен на следующих отделах палеокортекса: ножка гиппокампа; средний отдел гиппокампа; задний отдел гиппокампа и зубчатая извилина.
В соответствии с общепринятой периодизацией детского возраста (Автандилов Г.Г., 1990) полученные образцы «древней коры» были распределены на 8 групп: плоды второй половины беременности; новорожденные (1-10 дней); грудной ребенок (от 11 дней до 1 года); раннее детство (от 1 года до 3 лет); первый период детства (от 3 до 7 лет); второй период детства (8-12 лет для мальчиков, 8-11 лет для девочек); подростковый возраст (13-16 лет для мальчиков, 12-15 лет для девочек); юношеский возраст (17-21 год для мужчин, 16-20 лет для женщин). Каждая группа включала 10 препаратов головного мозга (по 5 образцов гиппокампа от каждого пола).
Распределение изученного материала по возрастным группам в соответствии с используемыми методами исследования приведены в таблице №1.
Данный раздел исследования включает определение активности МАО-Б, превентивных ферментов антиоксидантной защиты, изучение чувствительности липидов ткани гиппокампа к свободнорадикальному окислению in vitro, определение содержания первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ, а также продуктов окислительной модификации белков.
Активность моноамиоксидазы [МАО; амин: кислород оксиредуктаза (дезаминирующая), (содержащая флавин); КФ 1. 4. 3. 4.] в палеокортексе определяли по методике Волчегорского И.А. и др. (1991, 2000а). Данный метод основан на принципе семикарбазонобразования, где в качестве субстрата используется солянокислый бензиламин, который является специфическим субстратом МАО-Б (Lewinsohn R. et al., 1980). В головном мозге человека основной формой МАО является МАО-Б, на долю которой приходится 90% всей активности фермента (KalariaР. N. et al., 1988).
Для исследования готовили 10-15 % гомогенаты нервной ткани в системе стекло-стекло в среде выделения (0,25М раствор сахарозы на 0,067 М Na-фосфатном буфере, рН = 7,4). В течение 10 минут пробы центрифугировали со скоростью 3000 об/мин. Для исследования брали супернатант (безъядерный гомогенат) и на каждую пробу готовили две пробирки - опытную и контрольную. В каждую из них вносили 2,3 мл 0,067 М Na-фосфатного буфера (рН = 7,4) и 0,2 мл надосадочной жидкости, содержимое перемешивали стеклянной палочкой и пробирки ставили в термостат при температуре 37С на преинкубацию в течении 20 минут. Далее пробирки извлекали и запускали ферментативную реакцию внесением в опытную пробу 0,5 мл 30,2 мМ солянокислого бензил амина, приготовленного на 0,067М Na-фосфатном буфере (рН = 7,4). После этого пробы инкубировали в течение 2,5 часов при температуре 37С. По завершению инкубации пробирки извлекали из термостата и в каждую из них добавляли по 1 мл 50 мМ раствора семикарбазида гидрохлорида в 0,6Н хлорной кислоте. Содержимое пробирок тщательно перемешивали стеклянной палочкой, а затем в контрольные пробы добавляли 0,5 мл 30,2 мМ солянокислого бензиламина в 0,067М Na-фосфатном буфере (рН = 7,4). Через 20 минут после остановки реакции, пробирки центрифугировали в течении 15 минут при 3000 об / мин. Затем замеряли оптическую плотность обеих проб против дистиллированной воды при длине волны 278 нм в кварцевых кюветах с толщиной оптического слоя 1 см.
Расчёт конечного результата проводили по следующей формуле: [р -р )ху \ опыт контр} ев 0,012 х t х мг ткани в пробе х 0,2 где Е011ЬП и Еконтр — показатели оптической плотности опытных и контрольных проб; VCB - объём среды выделения, на который растирали ткань; 0,012 - тангенс угла наклона калибровочного графика; t - время инкубации (мин); 0,2 — объём супернатанта, вносимого в пробы. Активность МАО-Б выражали в нМоль бензальдегида / мг ткани мозга / мин. Такой расчет МАО-активности является более предпочтительным, так как тканевые гомогенаты, в которых сосредоточена большая часть МАО-активности, содержат значительное количество балластных белков (Волчегорский И. А. и др., 2000 а; б). Активность Cu-Zn-супероксиддисмутазы (СОД) [супероксид: супероксидооксидоредуктаза КФ 1.15.1.1] определяли по методу Чевари С. и др. (1985), адаптированному для работы с нервной тканью человека (Волчегорский И.А. и др., 2001). Метод основан на конкуренции СОД с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксид-анион, образующийся при взаимодействии восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида (НАД.Н2) и феназинметасульфата (ФМС). Это приводит к восстановлению НСТ с образованием гидразинтетразолия.
Для исследования готовили 3 % гомогенаты нервной ткани в системе стекло-стекло в Na-фосфатном буфере (рН = 7,8). Проводилась предварительная обработка материала, которая заключалась в добавлении к 0,5 мл гомогената мозга 0,2 мл этилового спирта 96 и 0,1 мл хлороформа. Эту смесь ставили на 15 минут на холод и затем центрифугировали 5-Ю минут со скоростью 5000 об / мин. В пробу вносили 0,2 мл супернатанта, к которому добавляли 2,7 мл реактива I, содержащего 62 мг ЭДТА, 500 мг НСТ, 92 мг феназинметасульфата в 1000 мл 0,067 М Na-фосфатного буфере (рН = 7,4). После этого измеряли первую экстинкцию.
Далее в кювету добавляли 0,15 мл реагента II, содержащего 76,3 мг НАД-Н в 100 мл трис-ЭДТА-буфере (рН = 8,0). Реакцию проводили в течении 10 минут при комнатной температуре, после чего повторно измеряли экстинкцию. Все замеры производили при длине волны 540 нм в кювете с толщиной оптического слоя 1 см.
Возрастная динамика оксидативного стресса в гиппокампе на этапах постнатального онтогенеза человека
В результате проведенного исследования были установлены существенные межгрупповые различия между изучаемыми возрастными группами по показателю активности МАО-Б в исследуемых структурах гиппокампа. В качестве референтной «точки отсчета» нами были избраны средние значения активности МАО-Б в гиппокампальных структурах плодов второй половины беременности.
Как видно (табл. № 2), в период новорожденности уровень активности МАО-Б в среднем отделе гиппокампа возрастал в 1,6 раз, а в зубчатой извилине почти в 1,3 раза относительно фетальных значений.
В ножке гиппокампа возрастной прирост активности изучаемого фермента развивался позже и достигал уровня статистической значимости лишь в период грудного возраста, более чем в 1,5 раза превышая фетальные величины и показатели периода новорожденности.
МАО-активность ножки гиппокампа у детей в возрасте от 1 до 3 лет в 1,4 раза превышала значения грудного возраста (табл. № 2). В среднем отделе гиппокампа соответствующий прирост составил более чем 100 % от пренатального уровня. В зубчатой извилине активность фермента возрастала лишь в 1,1 раза относительно фетальных величин. Аналогичная динамика прослеживалась и в заднем отделе гиппокампа, где показатель активности МАО-Б в 1,3 раза превышал значения периода новорожденности.
Достоверный рост активности МАО-Б во всех изучаемых отделах гиппокампа продолжался в первом периоде детства. Уровень активности фермента возрастал в ножке гиппокампа более чем в 1,5 раза относительно фетальных величин, значений периода новорожденности и раннего детства. В среднем отделе гиппокампа МАО-активность возрастала в 1,6 раза, относительно пренатального уровня; в заднем отделе гиппокампа в 1,4-1,7 раз от фетальных величин и значений периода новорожденности. Несколько менее выраженное возрастное увеличение активности МАО-Б отмечено и в зубчатой извилине - в 1,3 раз относительно величин раннего детства.
Во втором периоде детства наблюдалось увеличение активности МАО-Б в среднем отделе гиппокампа в 1,7-2,4 раза по сравнению с фетальными значениями, показателями грудного возраста и первого периода детства; в зубчатой извилине в 1,4-1,6 раза относительно фетальных показателей, величин грудного возраста и раннего детства (табл. № 2).
В подростковом возрасте наблюдалось некоторое снижение активности МАО-Б во всех изучаемых отделах, но её уровень оставался выше пренатальных значений. Активность изучаемого фермента в ножке гиппокампа достоверно увеличивалась по сравнению с фетальными значениями, но в то же время уменьшалась относительно показателей первого периода детства. Средний отдел гиппокампа и зубчатая извилина подростков характеризовались достоверным нарастанием активности МАО-Б по сравнению с пренатальными показателями.
В юношеском возрасте МАО-активность значимо увеличивалась практически во всех отделах гиппокампа (табл. № 2). Это проявилось практически двукратным увеличением данного параметра на уровне ножки гиппокампа и его среднего отдела относительно фетальных значений. В заднем отделе гиппокампа соответствующий прирост составил ПО % от показателя периода новорожденности. В зубчатой извилине раннее онтогенетическое увеличение МАО-активности к юношескому возрасту сменялось достоверным снижением данного параметра в 1,5 раза относительно величин 1-го и 2-го периодов детства.
Значимая зависимость активности МАО-Б от календарного возраста прослеживается и при проведении корреляционного анализа. В ножке гиппокампа показатели МАО-активности прямо коррелировали с абсолютными значениями календарного возраста (rs = 0,255; Р = 0,028; рис. 6).
В целом, результаты проведенного исследования свидетельствуют об онтогенетическом нарастании МАО-Б активности в гиппокампе человека на протяжении постнатального развития.
Система АОЗ ограничивает накопление в организме высокотоксичных свободнорадикальных интермедиатов (Ланкин В.З., 2000). Важным компонентом этой системы является её ферментное звено, в котором весьма заметную роль играют - супероксиддисмутаза, каталаза и церулоплазмин. Данные ферменты рассматривают как систему превентивной антиоксидантной защиты, препятствующей образованию активных форм кислорода и за- счет этого предотвращающей индукцию ПОЛ (Ланкин В.З., 2000; Mates J.M. et al., 1999).
Нами была изучена возрастная динамика активности Cu-Zn-зависимой СОД, каталазы и содержание церулоплазмина в гиппокампе человека на протяжении раннего постнатального онтогенеза.
В результате проведенного исследования было установлено, что активность Cu-Zn-зависимой СОД, в отличие от МАО-Б, уменьшалась по мере увеличения возраста (табл. № 3). Достоверное снижение активности Си-Zn-СОД более чем в 1,2 раза относительно показателей раннего детства было впервые отмечено в 1-ом периоде детства в заднем отделе гиппокампа. Аналогичная онтогенетическая динамика прослеживалась и в зубчатой извилине, где уровень активности исследуемого фермента снижался в 1,8 раз от величин грудного возраста.
Во 2-ом периоде детства активность Cu-Zn-СОД значимо уменьшалась во всех отделах гиппокампа. На уровне ножки гиппокампа это проявилось снижением данного параметра более чем в 2 раза относительно фетальных значений и показателей раннего детства (табл. № 3). Средний отдел гиппокампа характеризовался уменьшением активности Cu-Zn-СОД в 1,7-2,3 раз от пренатального уровня, величин грудного возраста и раннего детства. В заднем отделе гиппокампа активность фермента снизилась более чем 1,7 раза
