Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Введени CLASS е 5
Актуальность проблемы , 5
Цели и задачи исследования 6
Основные положения, выносимые на защиту 6
Научная новизна работы 7
Теоретическое и практическое значение работы 7
Апробация работы , .. 8
Личный вклад 8
2. Обзор литературы 9
2.1. Роль модифицированных лпнп в атерогенезе 9
2.2. Иммунные факторы в атерогенезе. роль иммунного ответа на модифицированные лпнп в атерогенезе 12
2.3. Типы модифицированных лпнп, обнаруженные vivo. иммуногенные эпитопы, возникающие при модификации 16
2.3.1. Окислительная модификация ЛПНП. 16
Перекисно-модифицированные ЛПНП 16
Инициаторы перекисного окисления ЛПНП in vivo 20
Разнообразие эпитопов, возникающих при перекисной модифиции липопротеинов in vivo 21
Изменение химических и физико-химических свойств ЛПНП при перекисном окислении 26
Другие механизмы окисления ЛПНП in vivo 27
Окисление ЛПНП, индуцированное пероксидазоЙ 27
Участие миелопероксидазы в окислении ЛПНП 28
2.3.2. Гликированные ЛПНП. 29
2.3.3. Десиалированные ЛПНП. 34
2.3.4. Протеолиз апо В. 35
3. Материалы и методы 37
3.1. Пациенты и образцы плазмы крови 37
3.2. Выделение лпнп человека 37
3.3. Химическая модификация лпнп 37
3.4. Получение кроличьих антисывороток к модифицированным лпнп 39
3.5. Выделение аутоантител к модифицированным лпнп (аффинная хроматография) 39
3.6. Твердофазный иммуноферментный анализ (т-ифа) 40
3.6.1 Анализ активности антител 40
Выявление аутоантител плазмы крови человека 40
Анализ активности кроличьих антисывороток 41
3.6.2. Конкурентный анализ. 41
Конкуренция между антигенами 41
Конкуреция между человеческими и кроличьими антителами к м-ЛПНП 41
3.6.3. Определение содержания окисленных ЛПНП в плазме 42
3.7. Определение холестерина циркулирующих иммунных комплексов 42
3.8. Определение концентрации гомоцистеина в плазме крови человека 42
3.9. Иммуногистохимический анализ 43
3.10. Получение экстракта стенки аорты человека 43
3.11. Изучение захвата иммунных комплексов «м-лпнп - аат» макрофагами. 44
3.12. Изучение цитотоксического эффекта иммунных комплексов лпі-іп-антитело 45
3.13. Статистическая обработка результатов 46
4. Результаты исследований 47
4.1. Обнаружение и характеристика антилипопротеиновых антител человека 47
4J.1. Поиск модификаций ЛПНП, ответственных за выработку антител 47
4.1.2. Влияние степени модификации ЛПНП на эффективность связывания с антителами 50
4.1.3. Изучение специфичности человеческих аутоантител к м-ЛПНП. 51
4.1.4. Взаимодействие ААТ к м-ЛПНП с другими модифицированными белками 54
4.1.5. Аутоантитела к м-ЛПНП, выделенные методом аффинной хроматографии. 57
4.1.6. Аутоантитела из экстрактов аорты человека. 58
4.2. Кроличьи аутоантитела к модифицированным лпнп 59
4.3. Уровень циркулирующих аат к м-лпнп человека и клинические проявления атеросклероза , 62
4.3.1. Разработка метода определения уровня ААТ. 62
4.3.2. Содержание аутоантител к м-ЛПНП в крови человека 64
4.3.3. Анализ взаимосвязи между содержанием ААТ в крови и клиническими проявлениями атеросклероза. 66
Частота обнаружения ААТ к м-ЛПНП у человека 67
Взаимосвязь уровня ААТ с клиническими проявлениями атеросклероза 68
Соотношение уровня ААТ с другими факторами риска ИБС 73
Дислипопротеинемия 73
Гипертоническая болезнь 73
Курение 74
Гипергомоцистеинемия 74
Содержание в крови окисленных ЛПНП 75
Содержание в крови аутоиммунных комплексов ЛПНП-антитело 76
4.4. Обнаружение эпитопов модифицированных лпнп в стенке аорты человека. 78
4.5. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ АУТОАНТИТЕЛ к м-ЛПНП 85
4.5.1. Влияние ААТ на захват модифицированных ЛПНП макрофагами. 85
4.5.2. Влияние ААТ на цитотоксичность модифицированных ЛПНП. 88
5. Обсуждение результатов 89
6. Выводы 100
7. Список цитируемой литературы 101
- Типы модифицированных лпнп, обнаруженные vivo. иммуногенные эпитопы, возникающие при модификации
- Твердофазный иммуноферментный анализ (т-ифа)
- Обнаружение и характеристика антилипопротеиновых антител человека
- Уровень циркулирующих аат к м-лпнп человека и клинические проявления атеросклероза
Введение к работе
Изучение механизмов патогенеза атеросклероза по-прежнему остаётся актуальной проблемой современной науки, в связи с высокой частотой и тяжестью этого заболевания.
Все большее внимание уделяется в последнее время роли иммунных факторов в атерогенезе. Широкое распространение получила аутоиммунная теория патогенеза атеросклероза, в основе которой лежит подкрепленное рядом фактов предположение об аутоан-тигенности аполипопротеин (апо) В-содержащих липопротеинов. Предполагается, что аутоантитела вырабатываются в ответ на химическую модификацию липопротеинов, происходящую in vivo.
В крови человека обнаружены гликированные, десиалированные и перекисно-мо-дифицированные липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и аутоантитела (ААТ) к ним. При этом остается неясным, исчерпывается ли список модификаций липопротеинов перечисленными выше, или же в организме человека возможны и другие атерогенные модификации липопротеинов.
В то же время показано, что в крови как здоровых лиц, так и больных ишемической болезнью сердца (ИБС), а также в стенках крупных артерий присутствуют аутоиммунные комплексы, в состав которых входят апо В-содержащие липопротеины, и убедительно продемонстрировано, что такие комплексы способны индуцировать трансформацию макрофагов в пенистые клетки, вызывать повреждение эндотелиальных клеток и увеличивать поступление в интиму артериальной стенки атерогенных липопротеинов. Однако до сих пор остается невыясненным весь спектр модификаций липопротеинов, приводящих к возникновению аутоиммунного ответа.
Кроме того, до сих пор не выяснена роль аутоантител в атеросклеротическом процессе. С одной стороны, сам факт накопления аутоиммунных комплексов липопротеин-антитело в местах поражений сосудистой стенки может свидетельствовать о негативных последствиях образования аутоантител. С другой стороны, есть данные, говорящие о возможной положительной роли аутоантител. Так, иммунизация животных (кроликов или мышей) окисленными ЛПНП приводило к замедлению развития экспериментального атеросклероза, что сопровождалось резким возрастанием в кровотоке титра антител к таким ЛПНП. Изучение участия антилипопротеиновых антител в атерогенезе представляется важным для формирования подходов к лечению, профилактике и, возможно, диагностике атеросклероза.
Типы модифицированных лпнп, обнаруженные vivo. иммуногенные эпитопы, возникающие при модификации
К настоящему времени не вызывает сомнений, что большую роль в атерогенезе играют окисленные ЛПНП. При этом механизмы инициации и развития процесса окисления ЛПНП in vivo до сих пор полностью не выяснены.
ТТерекисио-модифшщроеанн ые ЛПНП.
По общепринятой гипотезе, существенную роль в окислительной модификации ЛПНП играет перекисное окисление липидов (ПОЛ). На данный момент имеются некоторые представления об основных этапах этого процесса (Janero D.R., 1990; Климов А.Н., 1999).
Субстратом для перекисного окисления выступают главным образом полиненасыщенные жирные кислоты (как неэстерифицированные, так и входящие в состав тригли-церидов, фосфолипидов, эфиров холестерина). Инициаторами ПОЛ могут быть различные кислородсодержащие радикалы: супероксид-анион (Ог" ), гидроксильный радикал ( ОН), гидроперекисный радикал (НОО ) (рис. 1).
В образующемся на первой стадии радикале жирной кислоты происходит перегруппировка двойных связей с образованием конъюгированных диенов (А і и Аг) или триенов. Образовавшиеся радикалы далее активно взаимодействуют с кислородом, давая в конечном итоге гидроперекиси (В) или моноциклические эндоперекиси (С). Диеновые конъю-гаты и гидроперекиси липидов являются первичными продуктами ПОЛ и часто используются как маркеры пероксидации.
На более поздних стадиях процесса сформировавшиеся моноциклические (С) и би-циклические (D) эндоперекиси разлагаются с разрывом углеродного скелета, давая различные альдегиды (малоновый диальдегид (МДА), 4-гидрокси-2-ноненаль, ацетальдегид, кротоновый альдегид). Альдегиды способны ковалентно связываться с белком, таким образом, играя существенную роль в химической модификации ЛПНП.
В первую очередь, альдегиды взаимодействуют с є-аминогругшами лизиновых остатков белка. Кроме того, атаке может подвергаться тирозин и, в меньшей степени, гид-роксильные группы серина, имидазольное кольцо гистидина и сульфгидрильные группы цистеина (Jurgens G. et al, 1986; Palinsky W. et al., 2000).
При реакции с первичными аминогруппами насыщенные альдегиды, такие как ацет-альдегид или гексаналь, дают основания Шиффа (1), тогда как а,Р-непредельные альде гиды (например, 4-гидрокси-2-ноненаль) вступают в реакцию присоединения по Михаэлю (реакция 2).
МДА содержит две альдегидные группы, что может способствовать формированию внутри- или межмолекулярных кросс-сшивок. В этом случае образуется характерная флюорофорная группировка N-C=C-C=N (4). В физиологических условиях при участии МДА, первичных аминогрупп и моноальдегидов образуется ещё один флюоресцирующий продукт - 1,4-дизамещённые-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбальдегиды (5). Важно отметить, что нарастание флюоресценции является характерным явлением, которое наблюдается при окислении ЛПНП.
Помимо МДА, способностью давать кросс-сшивки обладает и 4-гидрокси-2-ноне-наль. По традиционным представлениям, он присоединяется за счёт двойной связи к лизину (а также к цистеину или гистидину). При этом альдегидная группа остаётся свободной (реакция 2) и может далее участвовать в образовании основания Шиффа (Uchida К., Stadtman Е. R., 1993).
Жирные кислоты, подвергающиеся перекисному окислению, могут находиться как в свободном состоянии, так и в составе триглицеридов, фософолипидов и эфиров холестерина. Больше всего окислению подвержены глицерофосфолипиды (Климов А.Н., 1999), поскольку для них характерно наличие в sn-2 положении жирной кислоты, содержащей две и более кратные связи (например, линолевой, линоленовой и арах ид оно вой). Кроме того, фосфолипиды расположены в поверхностном слое липопротеиновой частицы, и поэтому в первую очередь, наряду с апо В, выступают мишенью для внешних воздействий.
Окисление жирных кислот в составе фосфолипидов, триглицеридов или эфиров холестерина может протекать таким образом, что в результате образуется укороченная цепь с альдегидной группой на конце, всё ещё связанная с исходной молекулой. При этом вся структура способна давать основания Шиффа (рис. 2, (С)).
При пероксидации липидов, составляющих ядро ЛПНП, образующиеся вещества альдегидной природы, прежде всего, будут реагировать с аминогруппами основного белкового компонента ЛПНП — апопротеина В. Появление новых химических структур на поверхности белка может послужить причиной возникновения антигенных детерминант (рис. 2, (А), (С)).
Строго говоря, такие эпитопы могут появиться in vivo не только на поверхности апо В, но и на других структурах, имеющих первичную аминогруппу: на различиых белках, а также аминосодержащих фосфолипидах, например, таких как фосфатидилэтанол-амин или фосфатидилсерин (рис. 2, (В), (D)).
При этом нельзя исключать возможность и того, что новые эпитопы на ЛПНП появляются также вследствие конформационных перестроек апо В, вызванных модификацией лизиновых остатков, особенно в случае образования кросс-сшивок. Инициаторы переписного окисления ЛПНП in vivo.
Твердофазный иммуноферментный анализ (т-ифа)
В качестве твердой фазы использовали 96-луночные планшеты для микротитрования "Nunc" высокой сорбционноЙ емкости. Модифицированные ЛПНП, БСА или ЧСА (окислен ые Си2+, модифицированные МДА, дихлорангидридом малоновой кислоты, гексан алем, кротоновым альдегидом, ацетальдегидом; N-гомоцистеинирован-ные, маленлированные, карбамоилированные или ацетилированные) наносили на планшеты в 0.01М ФСБ, рН 7.4 (100 мкл/лунку в концентрации 10 мкг/мл) и инкубировали в течение 16 часов при +4 С. Нативные ЛПНП (БСА, ЧСА) использовали в качестве контроля. Для удаления несвязавшихся белков планшет промывали 0.01 М ФСБ, содержащим 0.05% Tween-20, после чего инкубировали с блокирующим буфером (0.5% раствор казеина в ФСБ, по 200 мкл в лунку) в течение 1 часа при комнатной температуре. Плазму последовательно разводили в блокирующем буфере, вносили в лунки панелей (по 100 мкл) и инкубировали 1 час при +37 С. После промывки планшеты инкубировали с антителами против IgG или IgM человека, мечеными ПХ ("Полигност"), в разведении 1:100 (100 мкл/лунку) в течение 50 мин при +37 С. Планшет вновь промывали, вносили в каждую лунку по 100 мкл субстрата (I мг ТМБ, 20 мкл 3% Н2О2 в 10 мл 0.1М Na цитратного буфера, рН 4.6) и инкубировали в течение 10-20 мин до достижения оптимального уровня окрашивания. Реакцию останавливали 2М H2SO4 (50 мкл в лунку) и измеряли оптическую плотность при 450 нм на автоматическом ридере ELx-800 ("ФинБио"). Уровень антител выражали в относительных единицах (отношение значений ОП, полученных для модифицированного и нативного белка). Выявление аутоантител в экстрактах аорты осуществляли по аналогичной схеме. Анализ активности кроличьих аитисывоуоток. Использовалась аналогичная методика. В качестве антигена брали модифицированные кроличьи ЛП, а также человеческие ЛПНП и БСА. После инкубации с кроличьими антисыворотками на планшет наносили меченые ПХ козьи антитела к IgG кролика ("Sigma"). Конкурентный анализ. Конкуренция между антигенами На планшет наносили антигены (нативные, МДА-модифицированные, ацетилированные, малеилированные, кротон ированные, карбамоилированные и N-гомо-цистеинированные ЛПНП или БСА) в концентрации 10 мкг/мл в ФСБ и инкубировали 16 часов при +4 С. Лунки промывали и блокировали, как описано выше. Человеческую плазму или кроличью антисыворотку в соответствующем разведении преинкубировали 1 час в присутствии различных концентраций тестируемых антигенов (0 — 200 мкг/мл), после чего вносили в лунки. Последующие стадии проводили так же, как описано выше.
Конкуреция между человеческими и кроличьими антителами к м-ЛПНП.
Человеческую плазму (или аффинно выделенные антитела) преинкубировали с кроличьей антисывороткой в нескольких разведениях. Проявляли с помощью меченых ПХ антител к IgG или IgM человека. Остальные стадии проводились, как описано ранее. 3.6.3. Определение содержания окисленных ЛПІІП в плазме.
Был использован тестовый набор Oxidized LDL ELISA (Mercodia). Метод основан на "сэндвич"-варианте т-ИФА с применением нижних моноклональных антител к окисленным ЛПНП и меченых ПХ антител к апоВ.
Было проанализировано 73 образца плазмы. В группу пациентов с ИБС вошли 52 человека, в контрольную группу - 21 человек без ИБС.
Осаждение циркулирующих иммунных комплексов.
К 0.7 мл сыворотки на холоду добавляли 0.7 мл ФСБ, содержащего 5% полиэтиленгликоля (ПЭГ, м.в. 6000), перемешивали и инкубировали пробы на холоду в течение 30 мин. Затем центрифугировали при охлаждении (+4 С) 20 мин при 5000 об/мин, после чего супернатант отсасывали. Осадок промывали охлаждённым 5% раствором ПЭГ в ФСБ 2-3 раза по 1 мл, каждый раз аналогичным образом центрифугировали и отбрасывали супернатант. Промытый осадок растворяли в 0.1 мл физиологического раствора, после чего определяли содержание холестерина в образцах.
Определение концентрации холестерина проводили с помощью энзиматического колориметрического набора CHOLESTEROL liquicolor (HUMAN, Германия) по рекомендованному производителем протоколу. Вкратце, к 100 мкл образца добавляли 1 мл раствора реагента, пробы перемешивали, выдерживали в течение 5 мин при 37С, после чего фотомстрировали при 500 нм против холостой пробы.
Количественное определение гомоцистеина в плазме крови человека проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием орто-фталевого альдегида в качестве реагента дериватизации. Аминокислоты разделяли в виде производных с орто-фталевым альдегидом и 2-меркаптоэтанолом (Donzanti В.А. et al., 1988) на обращённо-фазной колонке и детектировали при длине волны возбужденния 340 нм и длине волны испускания 450 нм. Перед анализом проводили восстановление дисульфидных связей в образцах (с помощью 2-меркаптоэтанола), а также осаждение плазменных белков (с помощью метанола). Автор приносит свою благодарность сотруднице отдела биохимии, к.б.н. Ю.В. Черкас за помощь при выполнении этой части работы.
Объектом анализа являлись участки аорты (грудной отдел) с атеросклеротическими повреждениями различной степени: начальные поражения в виде липидных пятен и выраженные повреждения в виде липидно-фиброзных и фиброзных бляшек, а также неизмененные участки аорты. Исследуемые образцы представляли собой материал 18 аутопсий (мужчины, средний возраст 55±6 лет) - смерть от острой сердечно-сосудистой недостаточности. На основании результатов патологоанатомического вскрытия, из исследования исключен материал, взятый от людей, у которых были заболевания, способные оказать воздействие на иммунологическую реактивность.
Исследование проводили на криостатных срезах толщиной 4-6 мкм, которые фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 мин и промывали в ФСБ (рН 7.4) При проведении микроскопического анализа для выявления липидов, а также для определения степени выраженности атеросклеротических поражений срезы окрашивали Oil red О.
Иммуногистохимическое окрашивание срезов проводили с помощью аффинно выделенных человеческих или кроличьих аутоантител к м-ЛПНП, конъюгированных с ПХ. В параллельных опытах наносили также кроличьи антитела к апоВ человека, меченые ИХ. В качестве хромогенного субстрата использовали 3,3 -диаминобензидин. После проведения иммуногистохимической реакции ядра клеток докрашивали гематоксилином.
Препараты просматривали и фотографировали в световом микроскопе Axiomat (Opton, Germany).
Обнаружение и характеристика антилипопротеиновых антител человека
Прежде всего, необходимо было выяснить, к каким типам модифицированных ЛПНП направлены циркулирующие в крови человека аутоантитела. Потенциальные антигены были приготовлены путём химической модификации in vitro ЛПНП человека. Липо-протеины были подвергнуты обработке малоновым диальдегидом (МДА), ацетальдеги-дом, гексаналем и кротоновым альдегидом, ацетилированию, малеилированию, карбамои-лированию, малонированию и N-гомоцистеинированю. Структура полученных продуктов отображена на рис. 9.
При выборе типов модификаций ЛПНП мы, прежде всего, исходили из теоретической возможности появления соответствующей модификации in vivo.
Как известно, при перекисном окислении липидов (ПОЛ) образуются различные альдегиды, среди которых можно назвать: МДА, ацетальдегид, гексаналь, 4-гидрокси-2-ноненаль, кротоновый альдегид и др. Присутствие в крови человека аутоантител к МДА-ЛПНП уже было показано ранее (см. «Обзор литературы»). Поскольку МДА является доминирующим продуктом альдегидной природы, образующимся в ходе ПОЛ, считается, что формирование антигенных эпитопов в перекисно-модифицированных ЛПНП происходит в основном за счёт взаимодействия с МДА. Кроме того, были приготовлены ЛПНП, модифицированные гексаналем, ацетальдегидом и кротоновым альдегидом.
Поскольку аутоантитела к перекисно-модифицированным ЛПНП широко описаны в литературе, мы использовали окисленные ЛПНП в качестве сравнения.
У больных, страдающих заболеваниями почек, повышено содержание в крови мочевины. Изоциановая кислота, образующаяся при спонтанной диссоциации мочевины, способна взаимодействовать с первичными аминогруппами белков, давая соответствующие производные. У больных с почечной недостаточностью, действительно, были зафиксированы в крови карбамоилированные белки (Roxborough Н.Е., Young I.S, 1995)
В результате ацетилирования или малеилирования (как и при описанных выше процессах) происходит блокирование свободных аминогрупп белка и, как следствие, возрастание общего отрицательного заряда белка. Следует отметить, что при малеилировании нарастание отрицательного заряд происходит более интенсивно за счёт введения карбоксильной группы.
При малонировании белка образуются эпитопы, подобные эпитопам МДА-модифи-цированых белков (но не идентичные им), поскольку дихлорангидрид малоновой кислоты является кросс-сшивающим агентом.
Как показали исследования Н. Jakubovski (2000), гомоцистеин может образовывать в физиологических условиях тиолакон, причём последний действительно обнаруживается в плазме крови человека (Jakubovski Н., 2002). Тиолактон гомоцистеина способен активно взаимодействовать с аминогруппами белка, с образованием соответствующих производных. Не исключено, что при повышенном содержании гомоцистеина в плазме возможна подобная модификация ЛПНП.
Было изучено взаимодействия антител плазмы крови человека с полученными модифицированными ЛПНП (с помощью твердофазного иммуноферментного анализа).
Как и ожидалось, антитела более активно взаимодействовали с МДА-ЛПНП, по сравнению с нативными липопротеинами (рис. 10). Кроме того, оказалось, что в крови человека присутствуют антитела, эффективно связывающиеся с ацетилированными, малеи-лированными и кротонированными ЛПНП, а так же, в меньшей степени, - с карбамоилированными и гомоцистеинированными ЛПНП.
При этом не наблюдалось повышенного сродства антител к малонированным, а также обработанным гексаналем или ацетальдегидом ЛГТНП. Данные по относительной эффективности взаимодействия человеческих антител с различными типами модифицированных ЛПНП представлены в табл. 1. Следует сказать, что обнаружение у человека аутоантител, распознающих ацетили-роваиные и малеилированные ЛПНП, явилось неожиданностью, поскольку внеклеточное ацилирование белков представляется маловероятным. Тем не менее, взаимодействие антител с таким образом модифицированными ЛПНП было в 3 раза более активным, чем с нативными ЛПНП. Возможно, естественный лиганд для этих антител имеет эпитопы, которые структурно очень близки фрагментам, образующимся при ацетилировании и малеи-лировании белков.
Нам не удалось обнаружить аутоантитела, связывающиеся с обработанными ацет-альдегидом или гексаналем ЛПНП. Возможно, модификация липопротеинов с участием этих альдегидов протекает in vivo в незначительной степени, или же образующиеся эпитопы не распознаются иммунной системой человека как чужеродные.
Таким образов, было показано присутствие в крови человека аутоантител, взаимодействующих, по крайней мере, с шестью различными модифицированными липопротеи-нами, а именно: МДА-ЛПНП, ацетилированными, малеилированными, кротонирован-ными, карбамоилированными и N-гомоцистеинированными ЛПНП. Следует отметить, что эффективность связывания аутоантител с модифицированными ЛПНП изучаемых типов оказалась значительно выше, по сравнению с окисленными ЛПНП (табл. 1).
Уровень циркулирующих аат к м-лпнп человека и клинические проявления атеросклероза
Поскольку изучаемые антитела оказались специфичными к типу химической модификации, а не к структуре исходного белка, при определении содержания аутоантител с помощью т-ИФА было решено использовать в качестве антигена модифицированный БСА. Выбор такого антигена давал ряд преимуществ по отношению к м-ЛПНП. Прежде всего, альбумин гораздо более устойчив к различным химическим воздействиям, тогда как липопротенны склонны к агрегации, что существенно усложняет приготовление антигена с желаемой степенью модификации. Далее, раствор альбумина допускает длительное хранение и замораживание, в отличие от ЛПНП, которые могут при этом подвергаться окислению и агрегации, и, следовательно, значительно менять свои первоначальные свойства. Таким образом, появлялась возможность использовать однажды приготовленную партию антигена для анализа большого количества образцов в течение длительного времени, что важно для получения воспроизводимых результатов. Дело в том, что довольно сложно добиваться одинаковой доли модифицированных аминогрупп белка в различных партиях антигена, а от этого, как уже говорилось в главе 4.1.2., очень зависит эффективность связывания аутоантител. При этом свежевыделенные ЛПНП пригодны для анализа в течение 1-2 недель, после чего требуется повторное приготовление антигена. И, наконец, физико-химические и иммунологические свойства липопротеинов, полученных от разных доноров, могут несколько различаться, что также осложняет достижение воспроизводимых определений. В случае же, например, БСА, может быть рутинно использован один и тот же коммерчески доступный препарат со стандартными характеристиками.
Так как эффективность связывания антител возрастала с увеличением числа заблокированных аминогрупп белка, при подготовке антигена для анализа человеческих ААТ мы добивались максимально полной степени модификации (табл. 3).
В предварительных экспериментах была выбрана оптимальная концентрация иммобилизуемого антигена —10 мкг/мл.
Оказалось, что углы наклона кривых зависимости сигнала (ОП) от кратности разведения плазмы были различными у разных пациентов. Поэтому изначально было понятно, что не удастся добиться определения содержания аутоантител в абсолютных (мг/л) единицах. Неодинаковые углы наклона объясняются, по-видимому, разным аффинитетом аутоантител к м-ЛПНП у пациентов. В связи с этим содержание ААТ определялось в относительных единицах. Оценивалась активность свободных антител в плазме при определённом разведении образца, выражаемая как отношение значений ОП, полученных для модифицированного и нативного БСА. Соответственно, уровень антител равный 1.0 означает одинаковую активность антител по отношению к модифицированному и нативному антигену, т.е. отсутствие специфических ААТ к м-ЛПНП. В предварительных экспериментах было выбрано оптимальное разведение образца плазмы (1/30) для антител классов IgG и IgM.
По литературным данным, наиболее распространёнными способами выражения концентрации ААТ при её определении методом т-ИФА являются:
1) «Титр» ААТ, выражаемый в единицах ОП, полученной при связывании ААТ с м-ЛПНП;
2) Разница между значениями ОП, полученными при связывании ААТ с м-ЛПНП и нативными ЛПНП;
3) Отношение ОП, полученных при связывании ААТ с м-ЛПНП и нативными ЛПНП;
4) Титр ААТ, вычисленный относительно содержания ААТ в стандартной сыворотке. Было показано, что достоверность различий уровня ААТ к ок-ЛПНП в исследуемых группах пациентов может зависеть от способа выражения результата. По данным О. Narvanen и соавт. (2001), наилучшую воспроизводимость обеспечивал третий из перечисленных способов. Именно этот способ представления уровня ААТ и был использован в настоящей работе.
У 116 человек (72 больных ИБС и 44 здоровых лиц) было изучено содержание аутоантител классов IgG и IgM к шести типам модифицированных ЛПНП. На рис. 21 представлены графики, отображающие средние уровни всех изучаемых типов аутоантител у человека в популяции г. Санкт-Петербурга. 1
Можно видеть, что наиболее велико содержание в крови ААТ к мал-ЛПНП и кротон-ЛПНП. Аутоантитела к карб-ЛПНП присутствуют в довольно низкой концентрации (или же они обладают очень низкой активностью). Можно отметить более высокий уровень аутоантител, принадлежащих к классу IgM, по сравнению с IgG.
Распределение уровня ААТ имело сходный характер для всех изучаемых типов антител и соответствовало нормальному распределению. Типичный график с единственным максимумом приведён на рис. 22.
Была исследована также взаимосвязь между уровнями аутоантител различных типов (простая линейная корреляция Пирсона). Корреляционная матрица для общей группы (мужчины и женщины) представлена в табл. 4.
