Введение к работе
Актуальность проблемы. Миграция клеток является ключевым процессом при эмбриогенезе, заживлении ран и метастазировании злокачественных опухолей. Направленная миграция гладкомышечных клеток (ГМК) сосудов происходит при ангиогенезе и рестенозе, а также на начальном этапе образования атеросклеротнческих бляшек и ремоделирования стенок поврежденных сосудов (Stary et al, 1989; Forrester et al, 1991). Миграция клеток - комплексный феномен, включающий рецепцию внешнего сигнала и поляризацию клетки по градиенту стимула, активацию внутриклеточных путей передачи сигнала, приводящих к перестройкам цитоскелета, образованию филоподий и ламеллоподий и их адгезии, актомиозин-зависимое перемещение тела клетки, деадгезию и ретракцию (Mitchison and Cramer, 1996). Внешними сигналами могут служить либо субстрат-связанные компоненты внеклеточного матрикса, вызывающие гаптотаксис, либо растворимые факторы, включающие факторы роста, цитокины и активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа), стимулирующие хемотаксис. Выявление активируемых ими внутри клетки сигнальных каскадов и конечных мишеней в сократительном аппарате ГМК представляется важным для понимания механизмов клеточной миграции и ряда сосудистых патологий, включая атеросклероз и рестеноз.
Урокиназа играет ключевую роль в миграции ГМК. Повреждение сосудистой стенки приводит к увеличению секреции урокиназы, которая стимулируют направленную миграцию ГМК в просвет сосуда и образование неоинтимы (Tkachuk et al, 1996). Мигрирующие клетки отличаются повышенным содержанием рецептора урокиназы, представляющего собой гликозилфосфатидилинозитол-заякореюгый белок, не имеющий трансмембранного и внутриклеточного доменов. Рецептор урокиназы располагается ка переднем крае мигрирующей клетки и обеспечивает локализованное связывание урокиназы, опосредуемую ей активацию плазмина и деструкцию внеклеточного матрикса (Okada et al, 1995). С другой стороны установлено, что урокиназа стимулирует миграцию клеток независимо от ее протеолитической активности (Del Rosso et al, 1993), что предполагает участие адапторных белков в инициации специфических сигнальных путей от рецептора урокиназы внутрь клетки. В то время как природа таких белков пока неизвестна,
предполагается, что их непосредственными мишенями могут являться тирозиновые и серин/треониновые протеинкиназы, а также низкомолекулярные ГТФ-связывающие белки семейств Ras и Rho (Koshelnik et al, 1999). Активация Ras связана с активацией p42/p44l:rk1,2 МАР-киназного каскада, тогда как Rho инициирует процессы перестройки цитоскелета и активацию р38 МАР-киназного каскада (Hall, 1998; Widmannetal, 1999).
Установлено участие p42/p44erk1-2 в гаптотаксисе трансформированных немышечных клеток (Klemke et al, 1997) и их миграционном ответе на факторы роста (Anand-Apte et al., 1997) и урокиназу (Nguyen et al, 1999). В этих клетках активация р42/р44"к1,2 коррелировала с повышением уровня фосфорилирования как киназы регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина, так и самих РЛЦ (Klemke et al, 1997, Nguyen et al, 1999), а фосфоршшрование киназы РЛЦ p42/p44erkU in vitro стимулировало ее активность (Morrison et al., 1996). Было сделано заключение, что опосредуемое p42/p44erk1'2 увеличение уровня фосфорилирования РЛЦ миозина и активация актомиозина является ключевым механизмом активации клеточной миграции, в том числе и урокиназой.
В то же время, роль p42/p44crt1'2, а также регулируемых Rho МАР-киназных каскадов, в стимуляции миграции ГМК урокииазой остается неясной. Роль р38 МАРК каскада была установлена для хемотаксиса ГМК, стимулируемого факторами роста и цитокинами, тогда как необходимость активации p42/p44srkU была опровергнута (Hedges et al, 1999). Более того, стимулируемая факторами роста миграция других типов клеток зависела от активации р38 МАРК и последующего фосфорилирования основной цитоскелетной мишени этого каскада, низкомолекулярного белка теплового шока HSP27 (Rousseau et al, 1997; Heuertz et al, 1999).
Таким образом, индивидуальная роль МАР-киназных каскадов в стимуляции миграции ГМК урокиназой остается неизвестной. Неясно также, является ли фосфоршшрование РЛЦ миозина и HSP27 достаточным для развития миграционного ответа ГМК на урокиназу или необходимо также участие других компонентов цитоскелета. Важным является также установление шщивидуальной роли доменов урокиназы в селективной активации тех или иных сигнальных каскадов, приводящих к стимуляции миграции ГМК.
Целью данной работы было исследовать роль МАР-киназньгх сигнальных каскадов в стимуляции миграции ГМК человека урокиназой и выявить их белки-мишени, ассоциированные с актомиозином. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
Изучить индивидуалыгую роль доменов урокиназы в стимуляции миграции ГМК.
-
Установить участие МАР-киназных каскадов в миграции ГМК человека и роль доменов урокиназы в активации МАР-киназ.
-
Исследовать участие МАР-киназ в фосфорилировании цитоскелетных белков под действием урокиназы.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что при стимуляции миграции ГМК человека урокиназой происходит активация как p42/p44CTkU, так и р38 МАРК. Определены домены урокиназы, необходимые для избирательной активации этих сигнальных каскадов. Активация р42/р44"к|'2 зависит только от протеолитическои активности, тогда как активация р38 МАРК зависит от «крингл» и «ростового» доменов урокиназы, но не зависит от ее протеолитическои активности. Ингибирование активации как p42/p44crk1'2, так и р38 МАРК блокирует миграцию ГМК, стимулируемую полноразмерной урокиназой. Обнаружено, что, в отличие от р38 МАРК, активация р42/р44сгкг2 не обязательна для миграции ГМК в ответ на урокиназу, лишенную протеолитическои активности с помощью сайт-направленного мутагенеза. Урокиназа стимулирует фосфорилирование РЛЦ миозина и ке влияет на фосфорилирование HSP27, которое максимально в ГМК человека, однако, этого не достаточно для обеспечения миграционного ответа ГМК. Установлено, что фосфорилирование капьдесмона МАР-киназой влияет на его связывание с внутриклеточным актином и выявлен возможный механизм участия этого белка в регуляции архитектуры и динамики цитоскелета.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на межлабораторном семинаре ИЭК РКНПК МЗ РФ (Москва, 2000).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 научных работы.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания ; материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 30 рисунками. Список литературы включает 302 источника.
