Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в большинстве развитых стран онкологические заболевания занимают второе место среди причин смертноста взрослого населения. Поэтому, усовершенствование методов лечения и разработка новых средств терапии онкологических заболеваний является приоритетной задачей биохимии, молекулярной биологии и медицины.
Апоптоз или программируемая клеточная гибель - процесс, необходимый для поддержания численности и функциональности клеток организма в норме, а также для удаления дефектных клеток. Одним из наиболее иродукпшных подходов к созданию современных оико-тераиевтических средств является разработка новых индукторов и модуляторов апоптоза раковых клеток.
Понимание механизма действия препарата на клеточном уровне позволяет подробно исследовать возможные молекулярные мишени его действия и проводить направленное конструирование молекул с улучшенными свойствами. Кроме того, такие комплексные исследования позволяют прогнозировать чувствительность различных опухолей к определенным лекарственным средствам.
Известно, что молоко человека содержит белки и пептиды, вызывающие апоптоз раковых клеток. Ранее в пашей лаборатории из молока человека был выделен и идентифицирован один из таких пептидов. Было показано, что этот пептид имеет молекулярную массу 8 кДа и является протеолитическим фрагментом к-казеипа человека. Выделенный из молока человека пептид получил название лактаптин.
Целью настоящем работы являлось получение рекомбинантных аналогов лактаптина и исследование механизма их действия на клетки человека в культуре.
В ходе работі>і необходимо было решить следующие задачи:
- Сконструировать и охарактеризовать рекомбинантные аналоги
лактаптина.
Разработать методы выделения и очистки рекомбинантных аналогов лактаптина.
Исследовать цитотоксическую активность рекомбинантных аналогов лактаптина по отношению к опухолевым и немалигнизированным клеткам человека в культуре.
Провести анализ основных биохимических маркеров гибели клеток, индуцируемой рекомбинантными аналогами лактаптина.
Провести поиск и идентификацию белков, взаимодействующих с рекомбинантными аналогами лактаптина в клетках человека.
- Провести анализ изменения трапскриптома клеток человека иод
действием рекомбинантных аналогов лактаптина методом гибридизации
РНК на полнотрапскриптомиых чипах lllumina.
- На основании полученных экспериментальных данных разработать модель цитотоксического действия рекомбипантных аналогов лактантнна на клетки человека.
Научная новизна и практическая ценность работы. Созданы генно-инженерные конструкции, с использованием которых получены рекомбинантные аналоги лактаптина. Установлено, что генно-инженерный аналог лактаптина RL2 вызывает гибель раковых клеток человека различного тканевого происхождения в культуре, в том числе клеток адснокарциномы молочной железы человека с ER-положитсльным и ER-отрицательным статусом, и не оказывает цитотоксического действия на немалигнизированные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани человека. Впервые разработаны методы выделения и очистки рекомбинантного аналога лактаптина RL2, позволяющие получать препараты RL2 для инъекционного применения при проведении доклинических испытаний. Впервые охарактеризован механизм цитотоксического действия рекомбинантного аналога лактаптина RL2 на раковые клетки человека. Показано, что RL2 проникает в клетки, взаимодействует с белками цитоскелета и индуцирует апоптотическую гибель раковых клеток по рецепторному и митохондриалыюму путям.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы представлены на конференциях: "The ЕМ ВО meeting 2010: advancing the life sciences" (Барселона, 2010); "llnd International conference physico-chemical biology" (Новосибирск, 2011); VI Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2011); V Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2012); "Postgenomic Technology for Biomedicine" (Новосибирск, 2012); "Programmed cell death in biology and medicine" (Москва, 2012); 37th FEBS "From Single molecules to Systems Biology" (Севилья, 2012), 20th Euroconference on Apoptosis "From Death to Eternity" (Рим, 2012).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 133 страницах, содержит 33 рисунка и 8 таблиц. Библиография содержит 232 литературных источника.
