Введение к работе
Актуальность проблемы. Разработка новых искусственных
регуляторов экспрессии генов на основе знаний о структуре и функциях
малых некодирующих РНК (нкРНК) является важной задачей
фундаментальной науки и практической медицины. К настоящему времени
результаты многих работ убедительно показали эффективность применения
синтетических аналогов коротких антисмысловых РНК для осуществления
контроля над процессами жизнедеятельности клеток человека и
стимулировали поиск новых природных механизмов регуляции экспрессии
генов. Поскольку малые нкРНК выполняют в клетках разнообразные
функции, они представляют собой перспективную основу для разработки
искусственных модуляторов экспрессии генов. К классу нкРНК относятся
малые ядрышковые РНК (мяоРНК), которые содержат в своей структуре так
называемые С- и D-боксы (C/D-бокс-мяоРНК) или Н- и АСА-боксы (Н/АСА-
бокс-мяоРНК). Эти РНК играют ключевую роль в пост-транскрипционной
модификации нуклеотидов рРНК клеток эукариот. В комплексе со
специфическим набором белков C/D-бокс-РНК направляют 2'-0-
метилирование нуклеотидов рРНК, Н/АСА-бокс-РНК -
псевдоуридилирование рРНК. Недавние исследования показали, что мяоРНК обладают широким спектром функций, которые не ограничиваются их участием в ядрышковом созревании рРНК. Некоторые мяоРНК вовлечены в процессы регуляции сплайсинга, пост-транскрипционной модификации нуклеотидов пре-мРНК и трансляции мРНК. Малые ядрышковые РНК, а также их микроРНК-подобные фрагменты транспортируются в цитоплазму клеток и секретируются во внеклеточное пространство, где они могут играть роль переносчиков внутри- и межклеточных сигналов. Исследования экспрессии генов C/D-бокс-РНК и Н/АСА-бокс-РНК в различных тканях млекопитающих показали, что изменение уровня этих РНК может быть напрямую связано с развитием заболеваний человека и животных.
Таким образом, изучение механизмов функционирования малых ядрышковых РНК и исследование нарушения экспрессии их генов в клетках могут открыть новые перспективы для разработки диагностических подходов и создания новых терапевтических средств.
Целью настоящей работы являлось исследование влияния синтетических аналогов малых ядрышковых C/D-бокс-РНК на экспрессию генов в клетках человека.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:
сконструировать и синтезировать аналоги малых ядрышковых C/D-бокс-РНК, направленные на нуклеотиды 18S и 28S рРНК человека, участвующие в формировании ключевых функциональных центров рибосом, а также на нуклеотиды, критичные для сплайсинга пре-мРНК гена белка теплового шока HSPA8;
адаптировать метод определения первичной структуры РНК и
методы выявления 2'-0-метилированных нуклеотидов в составе рибосомных РНК к использованию обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей Молони (M-MLV);
исследовать влияние аналогов C/D-бокс-РНК на 2'-0-метилирование нуклеотидов рибосомных РНК в клетках человека;
исследовать влияние аналогов C/D-бокс-РНК на уровень мРНК гена HSPA8 в клетках человека;
провести анализ влияния аналогов C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7;
провести анализ изменения транскриптома клеток человека под действием синтетических аналогов C/D-бокс-РНК методом гибридизации РНК на полнотранскриптомных чипах Illumina.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе создан уникальный набор аналогов малых ядрышковых C/D-бокс-РНК, направленных на модификацию заданных нуклеотидов разных видов РНК. С помощью трансфекции раковых клеток человека MCF-7 созданными аналогами выявлены характеристические особенности влияния C/D-бокс-РНК на экспрессию генов и продемонстрирована возможность контролировать процессинг РНК-мишеней с помощью аналогов мяоРНК. Показано, что аналоги C/D-бокс-РНК, направленные на нуклеотиды рРНК влияют на пост-транскрипционное созревание рРНК-мишеней, а именно, вызывают увеличение глубины природного 2'-0-метилирования нуклеотидов этих РНК. Под действием аналогов C/D-бокс-РНК, направленных на нуклеотиды, критичные для сплайсинга пре-мРНК гена HSPA8, происходит снижение уровня мРНК терапевтически-значимого гена-мишени в клетках MCF-7, сопровождаемое частичным нарушением сплайсинга пре-мРНК. В ходе работы проведен сравнительный анализ индивидуального цитотоксического действия разных аналогов C/D-бокс-РНК на клетки человека MCF-7, а также действия C/D-бокс-РНК в комбинации с набором цитотоксических агентов. Впервые проведен полнотранскриптомный анализ изменения уровня экспрессии генов в клетках человека, трансфицированных аналогами C/D-бокс-РНК, и выявлены регуляторные каскады, которые активируются в клетках под действием этих РНК. Полученные результаты закладывают базис для разработки искусственных регуляторов экспрессии генов на основе структурных особенностей C/D-бокс-мяоРНК.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы и получен Патент РФ. Результаты работы представлены на конференциях: «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2009, 2010, 2012), «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2008, 2012), «Химическая биология - фундаментальные проблемы бионанотехнологии» (Новосибирск, 2009), международной
конференции «The EMBO meeting 2010: advancing the life sciences» (Барселона, Испания, 2010), первом симпозиуме «Supramolecular chemistry for materials and life sciences» (Новосибирск, 2010), международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 85-летию академика Д.Г. Кнорре (Новосибирск, 2011), 4-ом международный конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), 16-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2012), «Postgenomic Technology for Biomedicine» (Новосибирск, 2012), симпозиуме EMBOIEMBL «The Complex Life of mRNA» (Гейдельберг, Германия, 2012), международной конференции «High-throughput Sequencing in Genomics» (Новосибирск, 2013), 38-ом конгрессе FEBS «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, 2013).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 152 страницах, содержит 40 рисунков и 8 таблиц. Библиография содержит 297 литературных источников.
