Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1. АГ и структурные изменения сосудистой стенки 13
1.1.1. Нормальная структура артериальной стенки 15
1.1.2. Пролиферация и апоптоз ГМК сосудов при АГ 16
1.1.3. Межклеточный фиброз сосудов при АГ 19
1.1.4. Формирование очагов воспаления в сосудах при АГ 20
1.2. Морфологические изменения сосудистой стенки во время атерогенеза.. 23
1.3. Теории патогенеза AT 27
1.3.1. Липопротеидная теория 29
1.3.2. Теория «реакция на повреждение» 30
1.3.3. Моноклональная теория 33
1.3.4. Иммунная теория 34
1.3.4.а. Инициаторы иммунного ответа в АТП 35
1.3.4.Ь. Врожденный иммунный ответ при атерогенезе 37
I.3.4.C. Адаптивный иммунный ответ при атерогенезе 46
1.4. Экспрессия основных генов-участников атерогенеза 51
1.4.1. Гены, влияющие на метаболизм липидов в артериальной стенке..51
1.4.2. Молекулы адгезии 54
1.4.3. Ростовые факторы 56
1.4.4. Цитокины и хемокины 58
1.4.5. Матриксные металлопротеиназы 59
1.4.6. Оксид азота 60
1.4.7. Система окисления/антиокисления в сосудах человека 61
1.4.8. Транскрипционные факторы 61
1.5. Изучение профиля генетического транскриптома при AT 63
1.5.1. Исследование атерогенеза методами DD и SAGE 63
1.5.2. Исследование атерогенеза с использованием ДНК-микрочипов 66
1.5.2а. Исследование атерогенеза на клеточных моделях 67
1.5.2Ь. Исследования атерогенеза на животных моделях 72
1.5.2с. Исследование атерогенеза у человека 73
1.6. Заключение 77
Глава II. Материалы и методы исследования 79
II.1. Образцы ЛПК 79
II.2. Получение и характеристика аутопсийного материала брюшного отдела аорты человека 80
II.З . Выделение суммарной РНК из ЛПК человека и из образцов интимы аорты человека 81
II.4. Проверка качества выделенной суммарной РНК 83
II.5. Приготовление кДНК-зондов для гибридизации с кДНК- микрочипами 84
11.6. Гибридизация кДНК-зондов с кДНК-микрочипами 85
11.7. Математическая обработка гибридизационных данных 86
II.8. Реакция ОТ 87
II.9.ПЦР 88
II. 10. Анализ продуктов ПЦР 89
II.11. Приготовление внешнего ПЦР-стандарта 89
II.12. Количественная ОТ-ПЦР с внешним стандартом 90
II 13. Иммуногистохимическое окрашивание 90
Глава III. Результаты 94
III.1. Пригодность образцов суммарной РНК для анализа молекулярно-биологическими методами 94
III. 1 .а. Моделирование распада РНК 95
III. 1 .Ь. Анализ изменений количеств индивидуальных мРНК методом ОТ-ПЦР в образцах суммарной Т24Р РНК с различным соотношением 28S и 18SpPHK 97
III. 1 .с. Корреляция между степенью распада (числом разрывов) рРНК и индивидуальных мРНК при различном соотношении 28S/18S рРНК 101
111.2. Обратные транскриптазы и их свойства 104
111.3. Сравнительный анализ транскриптомов нормальной и пораженной атеросклерозом интимы аорты человека в поисках дифференциально экспрессирующихся генов 115
111.4. Анализ транскриптома ЛПК больных эссенциальной гипертензией и сопоставление полученных данных с транскриптомом АТП аорты человека 135
III.5. Рїммуногистохимическое исследование экспрессии CD53 в нормальных и атеросклеротически измененной аорты человека 153
Глава IV. Обсуждение результатов 157
Выводы 196
Список литературы 199
Список сокращений 238
- АГ и структурные изменения сосудистой стенки
- Морфологические изменения сосудистой стенки во время атерогенеза..
- . Выделение суммарной РНК из ЛПК человека и из образцов интимы аорты человека
- Математическая обработка гибридизационных данных
Введение к работе
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смертности населения промышленно развитых стран [Шевченко Ю, 1999; Гусев ЕЙ, 2006; Williams В, 2006], поэтому профилактика и лечение болезней системы кровообращения являются важнейшими задачами современной медицины. Подбор лекарственной терапии с целью предупреждения развития ССЗ и их осложнений в настоящее время основан на оценке эффективности устранения факторов риска ССЗ [Органов РГ, 1999]. Для понимания основ взаимосвязи факторов риска и ССЗ необходимо иметь полное представление о патогенетических механизмах данных заболеваний.
В основе развития таких ССЗ как ишемическая болезнь сердца, инфаркт
миокарда, мозговой инсульт и заболевание периферических сосудов лежит
атеросклероз (AT). Массовый характер распространения AT у населения
большинства стран, начало развития заболевания задолго до клинических его
проявлений, несомненная зависимость его развития от многих ССЗ факторов
риска - все это определяет целесообразность проведения исследований на
молекулярном уровне как самого заболевания, так и факторов, к нему
предрасполагающих.
По современным представлениям AT является результатом хронического
воспалительного процесса в артериальной стенке, обусловленного иммунными
реакциями с участием мигрирующих из кровотока моноцитов,
дифференцирующихся в макрофаги и дендритные клетки, и лимфоцитов [Ross
R, 1999; Hansson GK, 2005]. В настоящее время полагают, что одним из
основных факторов риска возникновения AT является артериальная
гипертензия (АГ) [Alexander RW, 1995; Жданов ВС, 2002; Sasamura Н, 2005].
Известно, что такие вазоактивные молекулы, как катехоламины, ангиотензин II
и эндотелии-1, выбрасываемые в кровь в повышенных количествах при АГ, как
и само по себе повышение артериального давления вызывают структурные
изменения сосудистой стенки через активацию сигнальных путей, вовлеченных
в регуляцию роста и пролиферации гладкомышечных клеток (ГМК), в
процессы воспаления и апоптоза [Olsen МН, 2002; Plante GE, 2002; Dao НН,
2001; Van Zwieten PA, 2000; Shaw А и Xu Q, 2003; Lu H, 2007]. Было показано,
что те же самые факторы (химические и механические) воздействуют не только
на стенку сосуда, но и на клетки циркулирующей крови [Stevenson JR, 2001;
Hahn AW, 1994; Ohki R, 2002; Smedly LA, 1986], что приводит к активации
лейкоцитов, продукции ими активных форм кислорода и инициации
неспецифического воспаления в сосудистой стенке. Таким образом, анализ
экспрессии генов лейкоцитов периферической крови (ЛПК) больных АГ может
указать на особенности лейкоцитарного микроокружения и быть использован
как для оценки тяжести течения заболевания, так и в качестве способа
мониторирования эффективности лекарственной терапии, направленной на
предупреждение развития осложнений при АГ.
Использование олиго- или кДНК-микрочипов дает возможность оценить
количественные изменения в уровне нескольких сотен и даже тысяч
индивидуальных мРНК одновременно. Это позволяет, с одной стороны,
провести поиск новых генов-участников патологического процесса в
дополнение к уже выявленным и достаточно изученным генам, а с другой -
дать предположительную оценку их функциональной взаимосвязи по общности
изменения профиля экспрессии этих генов при данной патологии.
В течение последних десятилетий олиго- и кДНК-микрочипы активно
используются с целью изучения патогенетических механизмов возникновения и
развития как АГ, так и AT. Так, например, при изучении транскриптома
лейкоцитов крови больных эссенциальной гипертензией (ЭГ) было отмечено
изменение активности 680 генов, в том числе 10-ти цитокиновых генов, 4 генов
рецепторов серотонина, гена рецептора ангиотензина II и гена
эндотелинпревращающего фермента [Chon Н, 2004], хотя достоверность
полученных данных сложно было оценить ввиду использования авторами
работы пулированных образцов. При исследовании AT на животных моделях и
клеточных культурах была выявлена роль атерогенных стимулов (окЛПНП,
гомоцистеина, цитокинов воспаления, механического стресса) в регуляции
липидного метаболизма, межклеточных взаимодействий, воспаления и
ремоделирования внеклеточного матрикса [Shiftman D, 2000; Li Н, 2002; Mikita
Т, 2001; Ohura N, 2003]. Результаты анализа различных типов
атеросклеротических поражений (АТП) коронарных артерий человека
показали, что важным процессом в формировании атеросклеротической бляшки
является изменение экспрессии генов, отвечающих за дифференцировку ГМК
[King JY, 2005]. Исследование транскриптома образцов грудного отдела аорты
человека выявило списки дифференциально экспрессирующихся генов,
характеризующих определенный гистологический тип АТП [Seo D, 2004].
Результатом сравнительного анализа стабильных и склонных к разрушению атеросклеротических бляшек было выявление нарушений регуляции синтеза внеклеточного матрикса и метаболизма липидов [Faber ВС, 2001], а также повышенного уровеня экспрессии медиаторов апоптоза в ГМК [Martinet et al., 2002].
Несмотря на активное изучение патогенетических механизмов возникновения AT и АГ, до сих пор остаются невыясненными молекулярные механизмы взаимосвязи данных заболеваний, доказанной наличием сходных, структурных изменений в сосудистой стенке в виде дисфункции эндотелия, лейкоцитарной инфильтрации, миграции и пролиферации ГМК, а также повышенного образования соединительно-тканного матрикса. В связи с этим, целью настоящей работы было проведение сравнительного анализа экспрессии генов с использованием кДНК-микрочиповой технологии и обратной транскрипции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией, (ОТ-ПЦР) не только в разных типах АТП брюшного отдела аорты человека, включая ранние, выраженные и осложненные типы поражений, относительно макро- и микроскопически нормальных участков аорты, но и сопоставление полученных данных с результатами анализа профилей экспрессии в ЛПК больных ЭГ и здоровых доноров.
Поскольку достоверность и воспроизводимость результатов анализа
транскриптома клеток с применением кДНК-микрочиповой технологии и ОТ-
ПЦР, в основном, зависят от качества исследуемого образца суммарной РНК и
свойств используемой обратной транскриптазы - её процессивности и
специфичности, представлялось целесообразным проанализировать влияние степени распада суммарной РНК и условий проведения реакции обратной транскрипции (ОТ) на результаты количественного анализа экспрессии генов.
Таким образом, для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
Проанализировать влияние качества суммарной РНК и условий проведения реакции ОТ на результаты количественного анализа экспрессии генов на основе кДНК-микрочиповой технологии и метода ОТ-ПЦР.
Используя метод гибридизации радиоактивно меченой кДНК, синтезированной в ходе ОТ на образцах суммарной РНК, с кДНК-микрочипами фирмы Clontech, получить и проанализировать профили генной экспрессии:
а) ЛПК от пациентов, страдающих ЭГ, и здоровых доноров;
б) образцов интимы брюшного отдела аорты человека, полученных из
разных гистологических типов АТП.
3. Проверить данные кДНК-микрочипов методами ОТ-ПЦР и
иммуногистохимии.
4. Провести кластерный и корреляционный анализы полученных данных с
целью выявления степени взаимосвязи между характером экспрессии
генов и клиническими (или морфологическими) признаками исследуемых
заболеваний - ЭГ и AT аорты.
Сделать сравнительный анализ списков генов с дифференциальной экспрессией в ЛПК больных ЭГ и в АТП аорты человека с целью идентификации общих генов-участников двух заболеваний.
Провести функциональную оценку выявленных групп генов с точки зрения возможного их участия в процессах ремоделировании сосудистой стенки.
АГ и структурные изменения сосудистой стенки
АГ - это повышение давления крови в артериях вследствие увеличения сердечного выброса и/или увеличения сопротивления сосудов. Различают первичную (или эссенциальную) гипертензию (ЭГ), встречающуюся в девяносто процентах случаев, и симптоматическую (или вторичную гипертензию), частота встречаемости которой равна десяти процентам [Струков АИ, 1993]. В случае ЭГ повышение артериального давления является основным, иногда даже единственным симптомом заболевания, возникновение которого не связано с органическим поражением регулирующих его органов и "-- системг--чПоэтомуп такой і-вид--. артериальной- ллертензии называют гипертонической болезнью (ГБ). Симптоматическая артериальная гипертензия является следствием органных поражений почек, аорты, эндокринной и нервной системы. В регуляции артериального давления в норме участвуют две основные физиологические системы - прессорная и депрессорная, тесным и сложным образом связанные друг с другом [Чазов ЕЙ, 1992]. К прессорной системе относят симпатико-адреналовую систему, ренин-ангиотензин-альдостероновую систему, систему антидиуретического гормона вазопрессина, систему прессорных простагландинов тромбоксана А2 и простагландина F2a, систему эндотелинов. Депрессорная система включает в себя барорецепторы синокаротидной зоны аорты, калликреин-кининовую систему, системы депрессорных простагландинов, предсердный натрийуретический фактор, эндотелий-зависимый фактор релаксации. При ГБ взаимодействие прессорной и депрессорной систем нарушается в виде доминирования прессорной системы, что способствует развитию гипертензии и ее осложнений. Какова бы ни была причина возникновения устойчивой гипертензии, последняя всегда коррелирует с возникновением и усилением структурных изменений сосудистой стенки [Sasamura Н, 2005], которые, в свою очередь, замыкая петлю обратной связи, становятся независимым от первичной причины источником гипертензии. В процесс вовлекаются, главным образом, мелкие артерии и артериолы, защищающие капиллярное русло от повышения гидростатического давления в артериальной системе. Очевидно, что выявление и анализ причин морфологических изменений сосудистой стенки (ремоделирования сосудов) важно для понимания патогенеза АГ. Под ремоделированием сосудов понимается модификация их функции и морфологии. Этот процесс включает две стадии: 1) стадию функциональных изменений сосудов, связанную с вазоконстрикторными реакциями в ответ на повышение трансмурального давления и нейрогуморальную стимуляцию, и 2) морфологическую стадию, характеризующуюся структурным уменьшением просвета сосудов вследствие сочетания клеточной пролиферации и апоптоза гладкомышечных клеток (ГМК), воспалительной инфильтрации сосудистой стенки клетками крови и межклеточного фиброза. . Нормальная структура артериальной стенки Артериальная стенка состоит из трех слоев: интимы, медии и адвентиции. Интима является внутренним слоем артериальной стенки, отделенным от просвета сосуда и циркулирующей крови монослоем эндотелиальных клеток. Эндотелий функционирует как барьер проницаемости, образует устойчивую к тромбообразованию поверхность и участвует в регуляции тонуса сосуда путем синтеза простациклина, оксида азота и эндотелина. Интима состоит из двух слоев: поверхностного слоя, богатого протеогликанами, и более глубокого слоя - мышечно-эластического [Stary НС, 1992]. Внеклеточный матрикс (ВКМ) протеогликанового слоя в основном состоит из версикана и, в меньшей степени, из декорина и бигликана [Williams KJ, 2001]. Матрикс в этой области также содержит немного коллагена, в основном I и III типов, эластина и гликопротеинов [Stary НС, 1992]. Главным источником ВКМ являются богатые шероховатым эндоплазматическим ретикулумом ГМК секреторного фенотипа, расположенные хаотичным образом в субэндотелиальном пространстве. При этом также встречаются ГМК сократительного фенотипа, богатые миофиламентами. Кроме того, в субэндотелиальном пространстве присутствует небольшое количество макрофагов, тучных клеток и Т клеток [Kaartinen М, 1994]. Мышечно-эластический слой содержит большое количество богатых миофиламентами ГМК сократительного типа, организованные в близко расположенные слои. Этот слой состоит из большего количества коллагена, нежели протеогликановый слой, и богат эластическими волокнами. Внутренняя эластическая мембрана отделяет интиму от среднего слоя сосуда, медии, которая в основном состоит из ГМК. Адвентиция отделена от медии внешней эластической мембраной и, в основном, состоит из фибробластов и соединительной ткани, в которой встречаются мелкие артерии и нервные волокна [Gutterman DD, 1999].
Морфологические изменения сосудистой стенки во время атерогенеза..
На начальных этапах развития AT первые атеросклеротические поражения (АТП) появляются в областях с диффузным интимальным утолщением (ДИУ). ДИУ образуются в ответ на растяжение стенки сосуда в различных областях артерий в условиях повышенного кровяного давления [Stary НС et al., 1992]. При этом не всегда в участках сосуда с ДИУ происходит образование АТП. Для этого необходимо наличие атерогенных факторов таких, как повышенная концентрация липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в плазме крови. Существует классификация АТП стенки кровеносных сосудов, разработанная Гербертом Стари по материалам выполненных аутопсийных исследований. Выделено 6 гистологических типов поражения, и римские цифры, которыми они обозначены, отмечают последовательность развития поражений [Stary НС et al., 1992] (Рис. 1.1, Табл. 1.1). Прмтрои Ат.рон» " ро ибролмром Осяожяввя» Аи6роа рома Рис. 1.1 Структура артериальной стенки и гистологическая классификация АТП по Стари. Начальный I тип поражения (липидное пятно) характеризуется повышенным числом макрофагов, организованных в виде небольших групп, которые трансформированы в пенистые клетки вследствие захвата ими липидов. Когда содержащие липиды макрофаги и ГМК становятся более многочисленными и организуются в слои, поражения классифицируют как II тип поражения (липидная полоса). Ранние поражения (типы I и II) обычно встречаются у детей, но также их обнаруживают у людей старшего возраста особенно в областях, устойчивых к AT. Поражения II типа, локализованные в участках артерий, предрасположенных к AT, могут превращаться в поражения III типа, являющиеся промежуточными поражениями между ранними и выраженными Таблица 1.1. Классификация АТП на основании гистологических данных (по Стари) Тип поражении Используемые названия поражении Описание поражении интимы Типі Начальное поражение Появление изолированных групп макрофагов в интиме; накопление липопротеидов в макрофагах (образование пенистых клеток); нет повреждения ткани; изменения выявляются только микроскопически или химически Тип II Паlib Липидная полоса- склонное кпрогрессированиюпоражение- не склонное кпрогрессированиюпоражение Накопление липопротеидов в макрофагах и ГМК; большинство липидов располагается внутриклеточно, внеклеточно содержатся липидные капли; макрофаги без капель липидов более многочисленны, чем в поражениях I типа; появление Т-лимфоцитов; увеличение числа тучных клеток; нет повреждения ткани Тип III Преатерома Все изменения, характерные для типа На, плюс множественные нечетко отграниченные массы внеклеточных липидов, расположенные между слоями ГМК и замещающие протеогликаны и волокнистые структуры, присутствующие в норме; микроскопически видимые структурные повреждения ткани Тип IV Атерома Все изменения, характерные для типа На, плюс липидное ядро, развивающееся вследствие увеличения и последующего слияния изолированных внеклеточных отложений липидов, характерных для повреждения типа III. Вокруг липидного ядра в значительных количествах содержатся макрофаги, ГМК, пенистые клетки, тучные клетки и лимфоциты. Липидное ядро частично ограничивается капиллярами. Имеются разрывы и дезорганизация стенки артерии, вызванные значительным внеклеточным накоплением липидов. В липидном ядре всегда видны отложения минеральных солей. Tim VaVbVc ФпброатеромаОбызвествленная бляшкаФиброзная бляшка Все изменения, характерные для типа IV, плюс формирование коллагеновых слоев между просветом сосуда и липидным ядром, замещающие предсуществующий протеогликановый матрикс. Увеличение числа ГМК секреторного типа. Возрастает число капилляров (по срав. с IV типом), вокруг которых могут возникать микрогеморрагии. В прилежащих участках медии могут накапливаться липиды, а ГМК этого слоя разобщаются. Соответствующий участок адвентиции содержит скопления лимфоцитов, макрофагов и пенистых клеток. Бляшки склонны к разрыву и образованию интрамуральных тромбов.Любой тип выраженного АТП стенки сосуда с преимущественным отложением кальцияЛюбой тип выраженного АТП стенки сосуда, состоящего преимущественно из коллагена; липиды могут отсутствовать Тип VI ViaVlb Vic Осложненная фпброатероматромбо-геморрагическаятромботическаягемморагическая Все изменения, характерные для типа V, плюс тромботические отложения в бляшке и/или кровоизлияния и/или разрывы поверхностных слоев бляшки (щели, эррозии и изъязвления). При превращении тромботических масс во внеклеточный матрикс поражения VI типа по морфологии становится похоже на V тип, но с большей площадью поражения. АТП. Для III типа поражения характерно появление липидов в виде отдельных скоплений во внеклеточном пространстве. По мере развития AT небольшие внеклеточные скопления липидов III типа поражения сливаются друг с другом с образованием внеклеточного липидного ядра в интиме, что характерно для IV типа поражения. Липидное ядро формируется не только за счет липидов, поступающих из плазмы крови, но и за счет гибели пенистых клеток. Липидное ядро может также содержать кристаллы холестерина и отложения кальция. Толщина интимального слоя поверх липидного ядра обычно того же размера, что и при поражениях I и II типов, и в этом слое содержатся макрофаги и ГМК с наличием или отсутствием внутриклеточных липидов, а также Т-лимфоциты и тучные клетки. В ответ на разрушение ткани интимальные ГМК начинают пролиферировать и образуют новый соединительно-тканный матрикс, в частности коллаген. Это приводит к утолщению интимального слоя поверх липидного ядра и формированию фиброзной покрышки, отделяющей липидное ядро от просвета сосуда (V тип поражения - фиброатерома). При поражении VI типа, или осложненном поражении, имеются разрывы поверхностных слоев, такие как щели, эррозии или изъязвления, гематомы и кровоизлияния, тромботические наложения. В основе большинства поражений VI типа лежат поражения IV или V типов. На способность бляшки к разрыву значительно влияет ее морфологический состав и структура. Бляшки, склонные к разрушению, обычно имеют некротическое ядро большого размера, тонкую фиброзную покрышку, скудное количество ГМК и значительную инфильтрацию лейкоцитами, синтезирующих ферменты, деградирующие ВКМ и разрушающие фиброзную покрышку [Naghavi М, 2003; van der Wal AC, 1994]. Более того, для поражения такого типа характерно наличие vasa vasorum внутри бляшки и в адвентиции. Мелкие кровоизлияния в пределах данного поражения могут возникать из этих новообразованных сосудов, что привносит свой вклад в дестабилизацию бляшки, поскольку геморрагии внутри бляшки значительно увеличивают размер некротического ядра [Kolodgie FD, 2003]. Гистологические данные несомненно свидетельствуют о том, что осложняющие моменты следуют друг за другом с различными, до настоящего времени непредсказуемыми интервалами. Иногда эпизоды тромботических осложнений разделены месяцами или годами. В течение этого времени щели заполняются, а гематомы и тромботические наложения прорастают ГМК и замещаются коллагеном. В результате этого вновь возникает поражение V типа, хотя и более обширное и больше суживающее просвет артерии, чем предшествующее.
. Выделение суммарной РНК из ЛПК человека и из образцов интимы аорты человека
К каждому образцу ткани (либо лейкоцитарной массе, полученной как описано в разделе 2.1, либо интиме аорты весом 0,35-0,50 г) добавляли по 400 мкл 1х денатурирующего буфера (2,7 М гуанидин тиоцианат; 1,3 М аммония тиоцианат; 100 мМ натрия ацетат, рН 4,0; 5 мМ ЭДТА рН 8,0; 0,8 % р-меркаптоэтанол). Образец гомогенизировали с помощью гомогенизатора «Ultraturrax» до полного ресуспендирования ткани. 2. Немедленно к гомогенату добавляли 950 мкл закисленной фенольной смеси (Фенол 60%, Глицерин 8%, 100 мМ Натрия ацетат, рН 4.0) и интенсивно встряхивали на вортексе в течение 1 минуты, центрифугировали 1 мин. (+4С, 15000 rpm) в центрифуге «Eppendorf 5410». 3. К образцам добавляли 300 мкл хлороформа, пробирки интенсивно встряхивали в течение 1-2 минут, инкубировали 10 минут на льду, центрифугировали 15 минут при +4С, 15,000 rpm, торможение медленное) в центрифуге «Eppendorf 5410». 4. Верхнюю фазу переносили в новые пробирки, добавляли равный объем изопропанола, пробирку интенсивно встряхивали и инкубировали на льду 10 мин, центрифугировали 30 минут при +4С, 15,000 rpm, торможение медленное) в центрифуге «Eppendorf 5410». 5. Изопропанол отбирали, осадки отмывали два раза 1500 мкл 80% этанола с последующим центрифугированием в течение 5 мин. (+4С, 15000 rpm, торможение медленное) в центрифуге «Eppendorf 5410». 6. Этанол тщательно отбирали, осадки растворяли в 120 мкл деионизованной воды. К образцам добавляли 1,2 мкл ингибитора РНКаз (6 мг/мл, «Техноген»), 13,5 мкл 10х ДНКазного буфера (0,2 М трис-HCL, 0,1 М MgCL2, 5 мМ CaCL2), 1 мкл ДНКазы I (10 ед/мкл DNase I, RNase-free, «Roche Diagnostics Corporation») и 0,5 мкл экзонуклеазы I (20000 ед/мл Exo I, «New England BioLabsinc ). Образцы инкубировали на шейкере 30 минут при 37С. 7. К образцам добавляли 265 мкл 1,5х денатурирующего буфера (4,1 М гуанидин тиоцианат; 2 М аммония тиоцианат; 150 мМ натрия ацетат, рН 4,0; 7,5 мМ ЭДТА рН 8,0; 1,25 % Р-меркаптоэтанол), 950 мкл закисленной фенольной смеси, 300 мкл хлороформа и центрифугировали 15 мин. (+4С, 14,000 rpm, торможение медленное) в центрифуге «Eppendorf 5410». 8. Повторяли пункты 4 и 5 протокола. 9. Этанол тщательно отбирали, осадки растворяли в 15 мкл деионизованной воды 10.Концентрацию суммарной РНК определяли спектрофотометрически при 260 нм П.4. Проверка качества выделенной суммарной РНК. Целостность РНК оценивали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле с денатурацией формальдегидом [Т. Маниатис, 1984] по соотношению интенсивностей полос в геле, соответствующих 28S и 18S рРНК. Данные соотношения были не менее 1,0, характеризующие пригодность образцов суммарной РНК к исследованию молекулярно-биологическими методами с использованием кДНК-микрочипов и ОТ-ПЦР.
Степень загрязненности образцов суммарной РНК геномной ДНК оценивали методом ПЦР (пункт 11.10). В качестве матрицы для ПЦР использовали аликвоту образца суммарной РНК и взятую в разных разведениях геномную ДНК из сердца человека с известной концентрацией. В ПЦР использовали праймеры к ЬіЬА-антигену I класса, локусу С: смысловой праймер: 5 -GCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAG-3\ антисмысловой праймер: 5 -CATCATAGCGGTGACCACAGCTCCAA-3 . Результаты ПЦР оценивали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле, окрашенном 0,002% раствором бромистого этидия, по наличию продукта амплификации длиной 1274 п.о. (пункт 11.11). В дальнейшую работу брали образцы суммарной РНК, в которых примесь геномной ДНК составляла не более 0.01%. IL5. Приготовление кДНК-зондов для гибридизации с кДНК-микрочипами. Проводили реакцию обратной транскрипции 2 мкг суммарной РНК, выделенной из образцов лейкоцитов периферической крови человека или из образцов интимы аорты человека, в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl буфер, рН 8,3, 75 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 2,5 мкМ случайные девятинуклеотидные праймеры («Биосан», Новосибирск), 500 мкМ каждый из дезоксинуклеозидтрифосфатов (дГТФ, дЦТФ, дТТФ), 5мкМ дАТФ, 50 мкКи [а - 32Р]дАТФ (4000 Ки/ммоль, ФГУП «Институт реакторных материалов», Россия), 5мМ дитиотрейтол; 0.3 мкг обратной транскриптазы из вируса лейкемии мышей Молони (MMLV) («Техноген», Россия). Реакцию вели в течение 1 часа при температуре 37С и останавливали добавлением 1 мкл 0,1 М ЭДТА, рН 8,0. Полученные образцы радиоактивно меченых кДНК-зондов очищали от свободного [а-Р]дАТФ методом гель-фильтрации на сефадексе G-50 fine в хроматографической колонке объемом 300 мкл. К очищенным образцам кДНК-зондов (200 мкл, 2 х 106 - 2 х 106 срт) добавляли 1/10 объема (22 мкл) 10х денатурирующего раствора (1М NaOH, 10 мМ ЭДТА) и инкубировали 20 минут при 68 С. Затем добавляли равный объем (225 мкл) 1 М NaH2P04 (рН 7,0) и продолжали инкубацию при 68 С в течение 10 минут. По окончании инкубации кДНК-зонды добавляли в раствор для гибридизации с транскрипционной матрицей.
Математическая обработка гибридизационных данных
Оцифрованные данные после вычитания фона подвергали предварительной нормировке на усредненную величину интенсивности сигналов мало варьирующих генов, включая гены «домашнего хозяйства». Список мало варьирующих генов (коэффициент вариации сигнала гена по всем образцам на кДНК-микрочипах одного типа - не выше 30 %) был получен путем исключения всех сигналов, уровень которых был ниже утроенной величины среднего значения фона, а также всех сигналов, уровень которых был выше утроенного значения медианы всех сигналов, превышающих утроенный средний фон. Полученные таким образом данные повторно нормировали путем наложения кривых линейной регрессии. Для этого строили зависимости логарифмированных значений интенсивности сигналов для каждого гена на одном произвольно выбранном кДНК-микрочипе против соответствующих сигналов для другого кДНК-микрочипа. Варьируемыми параметрами служили аддитивный и мультипликативный факторы регрессии, эквивалентные по физическому смыслу вариации среднего фона кДНК-микрочипов и степени чувствительности регистрации интенсивности сигнала на разных кДНК-микрочипах. Оптимизацию коэффициентов регрессии проводили по методу наименьших квадратов. Список дифференциально экспрессирующихся генов был сформирован при построении диаграмм рассеяния нормированных данных, полученных на кДНК-микрочипах одного типа, в виде зависимости логарифмированных значений экспрессии всех генов в опытных образцах против контрольных образцов. Гены, значения уровней экспрессии которых располагались на диаграмме вне 95% доверительной области линии регрессии, рассматривались как вариабельные. И.8. ОТ Проводили реакцию ОТ с использованием 1,5 мкг суммарной РНК в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl буфер (рН 8,3), 75 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 2,5 мкМ случайные девятинуклеотидные праймеры («Биосан», Новосибирск), 1 мМ дНТФ (USB), 10 мМ дитиотрейтол; 0,3 мкг обратной транскриптазы из вируса лейкемии мышей Молони (MMLV) («Техноген», Россия). Реакцию вели в течение 60 мин при 37С и останавливали повышением температуры реакционной смеси до 95С и инкубацией в течение 10 минут с последующим добавлением 80 мкл 1х ТЕ буфера (10 мМ Трис-НСІ; 1 мМ ЭДТА, рН=8). Образцы кДНК хранили при температуре -20С. II.9. ПЦР ПЦР проводили в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл кДНК (соответствовало 15 нг суммарной РНК), ЮмМ Трис-HCL (рН 8,5 при 25С), 2 мМ MgCL2, 50мМ KCL, 10 мкг/мл желатины, 60 мМ хлорид тетраметиламмония (Fluka Chemie), 200 мкМ дНТФ (USB), по 1 мкМ прямого и обратного ген-специфических праймеров, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (Biomaster, Москва), 1 мкг антител "Taq Start" (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). К реакционной смеси добавляли 20 мкл минерального масла (Sigma). ПЦР проводили в амплификаторе - DNA Thermal Cycler (Hybaid). Программа амплификации: предварительная инкубация при 94С - 5 мин., 13-35 циклов: 94С - 30 сек., 60С - 30 сек., 72С - 40 сек. Дизайн ген-специфичных праймеров осуществляли с использованием следующих программ и баз данных: 1) программное обеспечение ОН99 (Techno&ene, Москва), 2) Fasta34 (http://facultv.virginia.ed u/wrpearson/fasta), 3) Nucleotide blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), 4) UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=::unigene). Последовательность ген-специфичных праймеров, число циклов ПЦР, необходимое для получения продукта реакции в экспоненциальную фазу реакции, длина продукта ПЦР, название исследованных генов и идентификационные номера мРНК в базе данных UniGene представлены в табл.Ш.4 и III.9. 11.10. Анализ продуктов ПЦР По окончании ПЦР отбирали 5 мкл реакционной смеси, смешивали с 3 мкл загрузочного раствора, содержащего 6,5 % Ficoll 400, 297 мМ Трис, 297 мМ Н3ВО3, 20 мМ ЭДТА, 0,024 % бромфеноловый синий, и наносили в 1,5% агарозный гель для проведения электрофореза в трис-боратном буфере (90мМ Трис; 90мМ НЗВОЗ; 6 мМ ЭДТА; рН 8,3), содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия. Интенсивность люминесценции продуктов ПЦР измеряли с помощью системы AlphalmagerTM (Alpha Innotech Corporation) и программного обеспечения ImageQuant.
