Содержание к диссертации
Введение
2.Обзор литературы... 15
2.1. Стресси иммунная система 15
2.1.1.Взаимодействие нервной и иммунной систем 17
2.1.2.Действие стресса на иммунную и нервную системы 19
2.1.2.1 .Иммобилизациопный стресс 21
1.2.2.Психоэмоциональный стресс 22
2.2. Экспрессия генов немедленного и раннего ответа как молекулярно-бнологическая основа реализации реакций на стрессирующие воздействия ...23
2.3.Протоонкоген c-fos как маркер активации клеток ЦНС 24
2.3.1.Общие сведения 24
2.3.2.Экспрессия гена c-fos 26
2.3.2.1.Индукторы активации гена c-fos и механизмы его экспрессии 26
2.3.2.2. Экспрессия гена c-fos в клетках нервной системы 27
2.3.3.Влияние стресса на экспрессию гена c-fos 30
2.4. Интерлейкин-2 как маркер активации определенных клеток иммунной системы 33
2.4.1.Общие сведения 33
2.4.2.Общие механизмы регуляции индуцибельных генов 35
2.4.3.Регуляция экспрессии гена интерлейкина-2 белковыми
транс-факторами 36
2.4.4.Экспрессия гена интерлейкина-2 в клетках нервной системы 41
2.4.5.Влияние стресса на экспрессию гена интерлейкина-2 44
2.5.3аключение 44
З.Методы исследования 46
3.1. Анализ синтеза ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК
лимфоцитами селезенки и клетками ткани головного мозга 46
3.1.1 .Модели стрессорного воздействия 46
3.1.2. Определение содержания ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК в клетках тканей селезенки 46
3.1.2.1. Получение и инкубация лимфоцитов 46
3.1.2.2. Выделение тотальной мРНК. 47
3.1.2.3. Выявление комплекса dig^HK-мРНК 48
3.1.3. Получение меченых ДНК-зондов 49
3.1.3.1 Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК, содерэ/сащей кДНК ИЛ-2 или кДНК v-fos 49
3.1.3.2. Выделение плазмидной ДНК из E.coli методом щелочной экстракции 50
3.1.3.3. Рестрикция ДНК эндонуклеазами 52
3.1.3.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле 53
3.1.3.5. Выделение фрагментов ДНК из лекгоплавкой агарозы 53
3.1.3.6. Нерадиактивное мечение кДНК-фрагментов дигоксигеиином 54
3.1.4. Определение содержания c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках тканей головного мозга крыс 55
3.1.4.1. Получение срезов головного мозга крыс 55
3.1.4.2. Анализ содерэ/сания ИЛ-2 и c-fos мРНК методом гибридизации in situ на срезах головного мозга крыс 56
3.1.4.3.Иммунодетекция комплекса dig^MPHK-кДНК 57
3.2. Иммунохимическое выявление c-Fos- и ИЛ-2-подобных белков в тканях головного мозга 57
3.2.1. Иммунохимическое выявление c-Fos-подобных белков в тканях головного мозга крыс
3.2.1.1. Получение срезов головного мозга крыс 57
3.2.1.2. Иммунохимическое выявление c-Fos-подобного белка 58
3.2.2. Иммунохимическое выявление ИЛ-2-подобного белка с использованием моноклональных ИЛ-2 антител 59
3.2.2.1. Приготовление проб для определения содерэ/сания ИЛ-2-подобного белка в структурах головного мозга мышей 59
3.2.2.2. Шшунохішическое выявление ИЛ-2-подобного белка 59
3.3. Статистическая обработка результатов 60
Результаты исследования 61
4.1. Влияние ротационного стресса на экспрессию генов c-fos и интерлейкина-2 в лимфоцитах селезенки мышей и клетках головного мозга крыс 61
4.1.1. Влияние ротационного стресса на экспрессию гена c-fos и интерлейкина-2 в лимфоцитах селезенки мышей 61
4.1.1.1. Влияние ротационного стресса на экспрессию c-fos мРНК в лимфоцитах селезенки мышей 62
4.1.1.2. Влияние ротационного стресса на экспрессию ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах селезенки мышей 65
4.1.2.Влияние ротационного стресса на экспрессию генов c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНКв клетках головного мозга крыс 68
4.1.2.1. Влияние ротационного стресса на экспрессию c-fos мРНК в клетках головного мозга крыс 69
4.1.2.2. Влияние ротационного стресса на экспрессию ИЛ-2 мРНК в клетках головного мозга крыс 69
4.2. Влияние болевых и комплексных стрессорных воздействии на экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в клетках спинного и головного мозга крыс 72
4.2.1. Влияние стрессорных воздействий на синтез c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в головном мозге крыс через 2 часа после применения стимула 75
4.2.2.Влияние стрессорных воздействий на синтез c-Fos- и ИЛ-2-подобных белков в головном мозге крыс 83
5.0бсуждение результатов 91
6.Выводы 101
7.Список литературы
- Стресси иммунная система
- Экспрессия генов немедленного и раннего ответа как молекулярно-бнологическая основа реализации реакций на стрессирующие воздействия
- Определение содержания ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК в клетках тканей селезенки
- Влияние ротационного стресса на экспрессию генов c-fos и интерлейкина-2 в лимфоцитах селезенки мышей и клетках головного мозга крыс
Введение к работе
Актуальность темы.
Стресс-реакция, как одно из проявлений неспецифической защиты организма, является ответом на воздействия разного рода, в том числе вызванные экологическими и социальными факторами. Ответной реакцией организма является активация его защитных функций, в оптимальном случае нивелирующих негативное влияние неблагоприятных факторов внешней среды.
Реакция нервной системы (НС) на стресс проявляется при действии самых разных раздражителей - физических, химических, психоэмоциональных.
К настоящему моменту модулирующее влияние центральной нервной системы (ЦНС) на иммунную выявлено при всех известных формах иммунного реагирования организма (синтез антител, отторжение чужеродного трансплантата, противоопухолевая резистентность, аллергические реакции). Показано участие ЦНС в регуляции различных звеньев иммуногенеза (фагоцитоз, пролиферация и дифференцировка лимфоцитов, активность клеток-эффекторов иммунных реакций, миграция клеточных элементов иммунной системы) (Корнева и др., 1978; 1993; и мн. др.). Тем не менее, механизмы нейрогуморального воздействия на иммунную систему и иммунной системы на нервную не только при стрессе, но и в норме, изучены далеко не исчерпывающе.
В передаче информационного сигнала между НС и ИС могут принимать участие и такие биологически активные агенты, как интерлейкины, интерфероны, гормоны тимуса (Yaseen et al., 1993). Известно также, что цитокины играют важную роль в механизмах взаимодействия между ЦНС и клетками иммунной системы (Goldstone et al., 1995). Цитокины способны проникать через гематоэнцефалический барьер в определенных его участках (Barve et al. 1994) и воздействовать на функциональную активность мозга. Присутствие цитокинов в головном мозгу объясняется также их продукцией - экспрессией цитокиновых генов клетками глии и некоторыми нейронами (Nelson et al., 1994; Sei et al. 1995).
К сожалению, существует относительно небольшое количество сведений о возможных путях передачи информационного сигнала от ЦНС к ИС и лишь начато изучение механизмов передачи информации от ИС к ЦНС, о структурах ЦНС, вовлеченных в ответную реакцию на стресс или антигенное воздействие, и временных параметрах этого процесса.
Большое значение в исследованиях такого рода имеет совершенствование методических подходов. Появление высоко специфических, прецизионных методов анализа в различных областях биологии позволяет проводить исследования на стыке дисциплин.
Множественность путей передачи сигнала (Kemplay & Webster, 1986; Gaykema et al., 1998) создает трудности в исследовании механизмов коммуникации между обеими системами. Применение методов анализа функциональной активности той или иной системы на организменном или клеточном уровнях не позволяет решить вопрос о молекулярных механизмах изменения метаболизма клетки в ответ на внешние стимулы. Однако, появление высокочувствительных специфических методов молекулярно-биологического и молекулярно-генетического анализа и применение их в сочетании с гистохимическими и иммунохимическими методами исследования позволило подойти к изучению проблемы механизмов нейроиммуномодуляции на генном уровне. Мишенью для такого рода исследований могут служить гены немедленного и раннего ответа, экспрессирующиеся в нервных или иммунокомпетентных клетках. Изменение характера их экспрессии при действии стимулов воздействий позволяет оценивать изменение функциональной активности клеток в ходе развития реакции на определенные стимулы. Фундаментальной основой такого рода исследований является доказанное ранее положение, согласно которому клетки, участвующие в формировании ответа на примененный внешний стимул, усиливают или уменьшают экспрессию соответствующих генов, что необходимо для компенсации возникающих изменений гомеостаза (Du Bow, 1998). Определение генетически запрограммированного ответа, поиск соответствующих маркеров, позволяющих регистрировать изменения метаболизма клетки на ранних стадиях реакции на стимуляцию, и исследование экспрессии соответствующих генов создает основу для выяснения механизмов реализации влияния стресса на фунщии определенных клеток.
Признанным маркером активации нейрональных клеток является продукт гена немедленного ответа - протоонкогена c-fos, - c-Fos белок (Bullitt, 1990), выполняющий функцию регулятора транскрипции ряда индуцибельных генов и играющий существенную роль в процессах клеточного роста и дифференцировки (Heuer et al., 1996).
Примером индуцибельного гена раннего ответа, кодирующего структуру одного из ключевых медиаторов иммунной системы, может служить ген интерлейкина 2 (ИЛ-2). ИЛ-2 является одним из важнейших цитокинов, обеспечивающих контроль над процессами пролиферации и дифференцировки Т-зависимых иммунокомпетентных клеток, и синтезируется Т- лимфоцитами - хелперами под действием митогенов, ИЛ-1 и некоторых других агентов. Существует большой объем литературы, посвященной проблеме регуляции активности гена ИЛ-2 специфическими белковыми трансфакторами (Агуа et al., 1984; Novak et al., 1990; Granelli-Piperno& McHugh, 1991; Tu & Anders, 1997). К числу транс-факторов гена ИЛ-2 относится и белок c-Fos. Так, известно, что белок c-Fos (вместе с другими представителями семейства Fos) в комплексе с продуктами других протоонкогенов семейства Jun входит в состав транскрипционных факторов АР-1 и NF-AT, которые регулируют активность ряда индуцибельных генов, в том числе и гена ИЛ-2 (Vacca et al., 1992; Garrity et al., 1994; Whisler et al., 1997).
В настоящее время присутствие ИЛ-2 было обнаружено не только в Т-лимфоцитах, но и в различных структурах головного мозга, - в клетках олигодендроглии, астроцитах и нейронах (Rabber & Blom, 1994; Ram et al.,1994, Sei et al., 1995 и др.). Следовательно, можно предположить, что ИЛ-2 может участвовать в механизмах активации не только иммунокомпетентных, но и нервных клеток (Goetz, 1998).
Существует значительное количество данных, свидетельствующих об изменении экспрессии гена c-fos в ответ на неантигенные стимулы (Hunt et al., 1987; Bullitt et al, 1992, Honkaniemi, 1992, Lee & Beitz, 1993) и роли синаптической активности в синтезе иммунореактивного c-Fos белка (Morgan & Curran, 1986). Передача информационного сигнала может осуществляться через нервные пути, т.е. сигнал может поступать в мозг в очень короткие сроки (Gaykema et al., 1998) после определенного воздействия.
Однако, несмотря на интенсивные исследования физиологических и биохимических механизмов реализации реакций клеток ЦНС на неантигенные воздействия, в том числе, и стресс-индуцирующие, интенсивность экспрессии гена c-fos в иммунокомпетентных клетках и гена ИЛ-2 в клетках ЦНС практически не изучена. Решение данных вопросов представляется актуальным для фундаментальной науки и направлено на раскрытие проблемы молекулярно-генетических механизмов реализации реакций НС и ИС на стресс и механизмов нейроиммунного взаимодействия. Цель и задачи исследования
Цель данной работы заключалась в изучении молекулярных механизмов реализации реакции организма на стрессорное воздействие, а именно в сочетанном исследовании экспрессии генов немедленного и раннего ответа - гена c-fos и гена ИЛ-2 - в клетках иммунной и нервной систем, и выявлении структур головного мозга, реагирующих на конкретные виды стресса.
В задачи работы входило:
1. Исследовать экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в лимфоцитах селезенки мышей после ротационного стресса по синтезу c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК.
2. Исследовать экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в клетках различных структур головного мозга крыс после ротационного стресса по синтезу с fos мРНК и ИЛ-2 мРНК.
3. Изучить влияние болевого и комплексного стрессорного воздействия на синтез c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках различных структур головного мозга крыс.
4. Провести анализ гена синтеза c-Fos-подобного белка в клетках гипоталамических структур головного мозга крыс после болевого и комплексного стрессорного воздействия.
5. Провести анализ гена синтеза ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей после болевого и комплексного стрессорного воздействия.
6. Охарактеризовать влияние ИЛ-ір на синтез ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей. Положения, выносимые на защиту
1 .Ротационный стресс вызывает индукцию синтеза c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах селезенки мышей.
2.Ротационный стресс вызывает индукцию синтеза c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках определенных структур головного мозга крыс.
3.Раздражители, содержащие болевой компонент: укол в икроножную мышцу задней ноги крысы, внутримышечная инъекция растительного масла или 5%-ного масляного экстракта горчицы, индуцируют (в различной степени) синтез c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках одних и тех же структур головного мозга крыс, однако, ИЛ-2 мРНК синтезируется в более поздние сроки, нежели c-fos мРНК.
4.Примененные болевые раздражители стимулируют синтез c-Fos -подобного белка в клетках гипоталамических структур головного мозга крыс в более поздние по сравнению с c-fos мРНК сроки.
5.Примененные болевые раздражители стимулируют синтез ИЛ-2 белка в различных структурах головного мозга мышей через 24 часа после воздействия.
6.Инъекция ИЛ-ір приводит к повышению содержания ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей через 24 часа после воздействия.
Научное значение и новизна
По экспрессии генов немедленного и раннего ответа: c-fos и ИЛ-2 установлены структуры головного мозга крыс, активирующиеся после стресс-индуцирующих воздействий (ротационный стресс, болевые и комплексные раздражители), а также - время их активации. Показана одновременная индукция синтеза c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах селезенки и клетках ЦНС при воздействии ротационного стресса. Функциональные изменения, протекающие в клетках НС и ИС на генном уровне могут иметь значение в процессе реализации стресс индуцируемых воздействий на защитные функции организма.
Таким образом, впервые, по экспрессии генов немедленного и раннего ответа, под влиянием стимулов неантигенной (стрессорной) природы, инициирующих развитие стресса, проведено исследование молекулярно-биологических основ реализации взаимодействия нервной и иммунной систем
Научно-практическая значимость работы
Работа является экспериментальным исследованием и важным этапом в развитии приоритетного направления по изучению механизмов реализации стресс-реакции на уровне экспрессии генов немедленного и раннего ответа в клетках ЦНС и иммунной системы, что дает возможность также анализировать механизмы взаимодействия нервной и иммунной систем на генном уровне.
Реализация результатов исследования
Результаты работы могут быть использованы в научной практике, связанной с изучением молекулярных механизмов стресса, а также -вопросов регуляции экспрессии индуцибельных генов. Кроме того, возможна рекомендация по включению полученных данных в педагогическую практику медицинских университетов. Апробация работы
Материалы исследования были представлены на Российских и Международных Форумах:
4th International Congress on the Immune Consequeces of Trauma, Shock and Sepsis - Mechanisms and Therapeutic Approaches, Munich, Germany, 1997
1-я Медико-биологическая Конференция молодых ученых Санкт-Петербурга, 1997
13h European Immunology Meeting, Amsterdam, 1997.
Ill International Congress of Pathophysiology, Lahti, Finland, 1998
XVII Съезд Всероссийского физиологического общества им.И.П.Павлова, Ростов-на-Дону,Россия, 1998
The 4th International Congress of the International Society for Neuroimmunomodulation, Lugano, Switzerland, 1999
Структура и объем работы:
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, выводов и списка цитируемой литературы из 209 источников, из них 193 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 17 рисунками и 3 таблицами.
Стресси иммунная система
Стресс, как неспецифическая реакция напряжения, был впервые описан Selye (1936), который установил, что раздражители самого разного характера вызывают сходные, или одинаковые реакции, а именно -повышение уровня глюкокортикоидов и адреналина в крови, снижение массы тимуса и повышение количества нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови. Затем были описаны основные стадии стресса: стадия тревоги, стадия резистентности и стадия истощения. Причем существование стадии резистентности свидетельствует об адаптации организма к данной ситуации.
Однако, стресс при действии сильных раздражителей или при длительном воздействии раздралштелеи средней силы, молсет переходить в дистресс, реакцию негативного характера, наступающую в тех случаях, когда адаптации к данной ситуации не происходит. В последние годы большое внимание посвящено проблеме влияния стресса на функции иммунной системы. Как выяснилось, стресс может оказывать стимулирующее или подавляющее влияние на функции иммунной системы, а, следовательно, и на защиту организма от генетически чулсеродных воздействий. Поскольку стресс является постоянной составляющей лсизни человека и животных и влияние его на организм человека особенно велико при наличии экологически неблагоприятных факторов и социального напряжения, проблема "стресс и здоровье" является достаточно актуальной. Стресс-индуцированное угнетение функции иммунной системы "открывает" возможность для развития заболеваний различной природы (инфекционных, аллергических, опухолевых). Именно поэтому, изучение механизмов реализации стресс-индуцированного влияния на функции иммунной системы представляет особенный интерес, включая и молекулярно-биологические аспекты этой проблемы.
Патофизиологическое значение и механизмы стресса широко исследуются. Согласно мнению Chrousos (1998) динамическое равновесие процессов, протекающих в организме - гомеостаз, поддержание которого является непременным условием жизни, может быть нарушено при действии стрессорных агентов разного рода. В ответ на стресс организм включает защитные реакции, способствующие развитию адаптивного ,ответа.
Согласно Chrousos and Gold (1992), в развитии стрессорного ответа участвует нервная система, так называемая "система стресса", локализованная в центральной и периферической нервной системах. "Система стресса" получает и интегрирует множественные нейросенсорные сигналы и нейрогуморальные сигналы, поступающие в НС различными путями. Активация стресс-системы приводит к развитию ряда поведенческих и физиологических изменений, названных Selye "общим адаптационным синдромом" или стрессом. В реализации стрессорной реакции участвуют различные отделы ЦНС: гипоталамус и стволовая часть мозга, нейроны паравентрикулярного ядра (PVN) гипоталамуса и CRF нейроны парагигантоклеточного и парабранхиального ядер медуллы, локус церелеус (LC) и другие, в основном, норадренергические (NE) группы клеток медуллы и LC/NE-симпатической системы.
Основные стресс-реализующие структуры мозга взаимодействуют и с другими отделами ЦНС, включая амигдалу и гиппокамп, мезокортиколимбическую допаминергическую систему и аркуатное ядро (Chrousos & Gold, 1992; Tsigos & Chrousos, 1995). Все эти элементы, а также гормональные системы, включая кортикотропин-релизинг фактор (CRF), аргинин-вазопрессин, проопиомеланокортин, активируются при стрессе. Периферическими звеньями стресс-реализующей системы являются гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система, симпатоадрено-медуллярная и парасимпатическая системы.
К настоящему моменту модулирующее влияние ЦНС выявлено при всех известных формах иммунного реагирования организма (синтез антител, отторжение чужеродного трансплантата, противоопухолевая резистентность, аллергические реакции). Показано участие ЦНС в регуляции различных звеньев иммуногенеза (фагоцитоз, пролиферация и дифференцировка лимфоцитов, активность клеток-эффекторов иммунных реакций, миграция клеточных элементов иммунной системы) (Корнева и др., 1978). Тем не менее, механизмы нейрогуморального воздействия на функции иммунной системы и ее составляющих изучены далеко не исчерпывающе.
Большое значение в изучении механизмов взаимодействия НС и ИС имеет совершенствование методических подходов. Появление высоко специфических, прецизионных методов анализа в различных областях биологии позволило проводить исследования на стыке дисциплин. Так, благодаря современным гистохимическим методам, удалось показать возможность прямого контакта лимфоцита и эфферентного нервного волокна (Felten et al., 1987). В настоящее время можно выделить два канала взаимодействия мозга с клетками иммунной системы: нервно-проводниковый (с участием эфферентных нервных окончаний в лимфоидных органах и тканях) и гематогенно-гуморальный (с участием гормонов эндокринной системы (ЭС) и других биологически активных факторов, вырабатываемых клетками НС и ИС и поступающих в кровяное русло) (Гущин, 1992).
Экспрессия генов немедленного и раннего ответа как молекулярно-бнологическая основа реализации реакций на стрессирующие воздействия
Воздействие окружающей среды на организм проявляется на различных уровнях: организменном, тканевом, клеточном, молекулярном. В процессе передачи и реализации информационного сигнала могут принимать участие различные клеточные системы и структуры, и могут быть задействованы различные механизмы. Поступление сигнала в клетку отражается на ее метаболизме, причем в процесс изменения клеточных функций могут быть вовлечены и генные структуры.
Гены, быстро активирующиеся в ответ на внешний сигнал - это гены, экспрессирующиеся в ядре клетки даже в присутствии ингибиторов белкового синтеза и не нуждающиеся для инициации транскрипции в синтезе белка de novo (Lavrovsky et al., 1996). Такие гены называются генами немедленного и раннего ответа (IEG) (IEG-immediate early genes). К IEG относятся, например, протоонкогены c-fos (Curran & Teich, 1982), c-jun (Maki et al.,1987) и zif286 (Kujubu et al., 1987). В большинстве случаев IEG кодируют транскрипционные факторы, которые изменяют экспрессию других генов - генов раннего и позднего ответа (Sheng & Greenberg, 1990).
Одними из возможных претендентов на роль биологических маркеров изменений метаболизма клетки под влиянием стресса являются ген немедленного ответа - c-fos и ген раннего ответа - ИЛ-2 . Анализ экспрессии указанных генов позволяет определить наиболее ранние сдвиги в метаболизме клетки на генетическом уровне, происходящие как в нервной, так и в иммунной системах.
В настоящее время, одним из наиболее изучаемых генов IEG является протоонкоген c-fos, продукт экспрессии которого - белок c-Fos, считается признанным маркером активации клеток в ЦНС, хотя экспрессия c-Fos белка показана и для ряда клеток другого типа -макрофагов, фибробластов, лимфоцитов (Sagar et al., 1988; Bullitt, 1990).
Первоначально ген fos был описан как вирусный трансформирующий онкоген, кодируемый FBJ-MSV (FBJ-MSV - Finkel-Biskins-Jenkins murine osteogenic sarcoma virus) и был назван v-fos. Затем был найден его нормальный клеточный аналог - c-fos (Finkel et al., 1966; Curran & Teich, 1982). Гены v-fos и c-fos в большой степени гомологичны, за исключением 4-х областей ДНК, три из которых представлены нитронами. Четвертая область (104 н.п.) присутствует только в гене c-fos, этот регион представлен в геноме мыши и человека. Гомология по c-Fos белку для мыши и человека составляет 90% (Curran et al., 1985), для крысы и человека - 97%, крысы и мыши - 94%, цыпленка и мыши -79% (Foletta, 1996). c-Fos белок состоит из 380 аминокислот (на одну меньше, чем v-Fos) и локализуется в ядре клетки. c-Fos белок подвержен более интенсивной пост-трансляционной модификации, чем v-Fos белок .
К настоящему времени открыто пять представителей семейства Fos (c-Fos; Fra-1, Fra-2 - Fos-related antigene 1 и 2; Fos-B; Fos-B2) (Zerial et al.,1989; Orlandini et al., 1996). Гены, кодирующие указанные белки, имеют одинаковое число экзонов и интронов, но различаются по размерам не транслируемой области (Foletta, 1996). Синтез c-fos мРНК стимулируется связыванием соответствующих транс-факторов с сайтом SRE (serum response element) в энхансерной области гена fos (Herrera et al., 1989).
Стимуляция экспрессии гена c-fos на транскрипционном уровне не обязательно приводит к синтезу белка. Следовательно, можно предположить, наличие посттранскрипционной регуляции экспрессии гена c-fos (Triesman, 1985). Интересно отметить, что вновь синтезированный c-Fos белок (в том случае, когда синтез имеет место), накапливаясь, ингибирует по принципу обратной связи, синтез c-fos мРНК (Chaudlmri, 1997).
Белок c-Fos является ростовым фактором и, вступая в комплекс с белком c-Jun, продуктом другого протоонкогена, входит в состав трапс-активирующего комплекса АР-1, регулирующего транскрипцию ряда индуцибельных генов, в том числе и гена ИЛ-2 , и специфического для генаИЛ-2 - транс-фактора NF-AT (Grabstein, 1986; Orlandini, 1996).
Определение содержания ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК в клетках тканей селезенки
В качестве стрессорного воздействия использовали ротационный стресс и сенсорные стимулы.
При ротационном стрессе животные подвергались вращению на ротационной установке со скоростью 78 об/мин (4 раза по 10 мин с 5-минутными перерывами). Через 1 час после окончания стрессорного воздействия животных забивали.
В качестве сенсорных стимулов были выбраны: 1) Инъекция 20 мкл 5% масляного экстракта горчицы внутримышечно в заднюю правую конечность (gastrocnemius); 2) Инъекция 20 мкл растительного масла; 3) Укол инъекционной иглой.
У самцов 10-12-недельных мышей линии СВА извлекали селезенки. Суспензию клеток селезенки получали в асептических условиях мягким раздавливанием ткани в стеклянном гомогенизаторе в 2 мл RPMI 1640. Затем суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр (Becton Dickinson) и дважды промывали RPMI. Лимфоциты выделяли из субпопуляции селезеночных клеток центрифугированием в градиенте фиколл-верографин (Pharmacia) (г=1.09 г/л) в течение 40 минут при 4 000 х g. В результате эритроциты оседали на дно, а обогащенная фракция лимфоцитов оставалась на границе раздела двух фаз: среды и смеси фиколл-верографин. Лимфоциты осторожно собирали и после трехкратной отмывки доводили концентрацию клеток до 1 млн в мл. Клетки инкубировали необходимое время при 37С, 100% влажности, 5% СОг в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной сыворотки быка, 10 шМ HEPES, 2 мМ глутамина, 50 мМ 2р-меркаптоэтанола, 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина. Контроль содержал 5-20 мкг/мл КонА+ 30 ед./мл рИЛ-2 (Гущин и Неустроева, 1989; Гущин, 1992).
Выделение тотальной мРНК осуществляли методом Шомзинского и Сахи (Chomczyncki & Sacchi, 1987).
После инкубации в течение 4-6 часов в 5 мл среды RPMI с добавками (10 клеток/мл), клетки собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут, промывали стерильным lxPBS, и освобождали осадок от излишней влаги. К осадку добавляли 100 міш раствора GITC (4 М гуанидин тиоционат, 25 мМ Na-цитрат рН 7,0, 0,5% Na-лаурилсаркозинат), 10 місі Na-ацетата рН 4,0, 100 мкл фенола, насыщенного водой, 40 мкл раствора хлороформ .изоамиловый спирт (49:1). После внесения каждого из компонентов смеси пробирку осторожно встряхивали. Смесь окончательно перемешивали 10 секунд на
Вортексе и помещали на 15 минут в лед. Затем пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут и отбирали водную фазу, содержащую РНК. Добавляли 100 мкл изопропанола и оставляли на ночь при -20С. Осадок РНК получали центрифугированием проб при 8 000 об/мин в течение 1 часа, промывали 75% этанолом и основательно высушивали в вакуумном шкафу. Осадок растворяли в 5 мкл стерильной деионизированной воды и наносили на фильтр (ВА 85, 0,45 мкм, Шляхер и Шулль). РНК закрепляли на фильтре отжигом при 80С в течение 30 минут.
Выявление комплекса си кДНК-мРНК осуществляли по методу Boehringer Mannheim (1995). Прегибридизацию фильтра проводили 1 час при 37С в свежеприготовленном гибридизационнном растворе (5xSSC, 0,1% Na-лаурилсаркозинат, 0,02 % ДДС-Na, 50 мМ трис-НС1 рН 8,0, 50% формамид, 5% блокирующий реагент). Фрагмент іі -кДНК (получение меченых кДНК зондов см.п.3.1.3.) денатурировали путем кипячения в водяной бане при 100 С в течение 10 минут и мгновенного переноса на лед. Фильтр с нанесенной мРНК помещали в гибридизационный раствор, содержащий (% -кДНК. Гибридизацию вели в течение ночи при 37 С.
После гибридизации фильтры с сорбированной на них dig -кДНК отмывали при 68С 15 минут в растворе, содержащем 2xSSC и 0,1% ДДС-Na, а затем двукратно по 15 минут в растворе OJxSSC и 0,1% ДДС-Na.
Описанные далее процедуры проводили при комнатной температуре. Фильтр ненадолго помещали в буфер 1 (100 мМтрис-НС1, 150 MMNaCl, рН 7,5), после чего переносили его в буфер 2, приготовленный на основе буфера 1 и содержащий 1% блокирующий реагент. Инкубацию проводили в течение 30 минут.
Влияние ротационного стресса на экспрессию генов c-fos и интерлейкина-2 в лимфоцитах селезенки мышей и клетках головного мозга крыс
Стресс может оказывать различное действие на функции иммунной системы, что зависит от его характера, силы и продолжительности. Так, иммобилизационный стресс подавляет иммунологические функции, включая и уменьшение синтеза интерлейкина-2 (ИЛ-2) - одного из ключевых медиаторов иммунной системы (Sheridan et al., 1991). Ранее в Отделе Общей патологии и патофизиологии НИИЭМ РАМН проводились исследования по анализу влияния иммобилизационного стресса на продукцию ИЛ-2 мРНК в Т-лимфоцитах и было показано ингибирование экспрессии этого гена (Головко и др., 1996). По данным литературы, непродолжительный ротационный стресс, стимулирует активность иммунной системы (Levi-Montalcini, 1990; Korneva et al, 1992). В данной серии экспериментов ставилась задача проследить на генном уровне реакцию лимфоцитов на неантигенный стимул, в частности, изучить влияние ротационного стресса на экспрессию двух генов немедленного (c-fos) и раннего (ИЛ-2) ответа. Известно, что продукт гена c-fos - c-Fos белок является признанным маркером активации нейрональных клеток и, одновременно, - транс-фактором, регулирующим экспрессию ряда индуцибельных генов, в том числе, и гена ИЛ-2 (Grabstein, 1986; Orlandini, 1996; Heuer, К., 1996). Вместе с тем, ИЛ-2 может, соответственно, служить функциональным маркером активации иммунной системы.
С целью изучения экспрессии протоонкогена c-fos и гена ИЛ-2 в условиях стимулирования функций иммунной системы, лимфоциты, выделенные в градиенте плотности фиколла, из селезенки мышей, подвергнутых ротационному стрессу, инкубировали 4 часа в отсутствии или присутствии митогена (Кон А+ рИЛ-2). Экспрессию генов оценивали по содержанию c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах с использованием соответствующих зондов методом spot-гибридизации мРНК-кДНК.
В качестве источника зондов использовали рекомбинантные ДНК: pUC-v-fos (получена из лаборатории д.б.н. В.Поспелова, ЦИН РАН) и рРЬ32-ИЛ-2 (сконструирована д.б.н. А.Перевозчиковым, отдел биохимии НИИЭМ РАМН) (Рис.1). Плазмиды рестрицировали эндонуклеазами Pstl и BamHl+SalGl, соответственно, и фрагменты кДНК исследуемого гена выделяли после электрофореза из легкоплавкой агарозы и метили дигоксигенином.
По данным ряда авторов c-Fos белок, являясь маркером активации нейрональиых клеток, экспрессируется также и в клетках некоторых других типов, в том числе, и в лимфоцитах. На примере нейрональиых клеток было показано, что синтез белкового продукта гена c-fos, индуцируется под влиянием самых разнообразных воздействий на организм или клетку (Heuer et all., 1996; Murphy et all., 1991; Pierre et all., 1996; Bozas et al., 1997). В норме уровень экспрессии c-fos мРНК варьирует, однако, его повышение в клетке всегда свидетельствует об активации гена .
Проведенные нами эксперименты показали, что даже в отсутствии митогена КонА+рИЛ-2 количественное содержание c-fos мРНК в лимфоцитах достаточно для определения его методом spot-гибридизации.
В то же время, через 2 часа после ротационного стресса в лимфоцитах происходит повышение уровня c-fos мРНК по сравнению с контролем на 50% (Рис. 2).
При анализе экспрессии гена ИЛ-2 в лимфоцитах селезенки при стрессе, было показано, что в противоположность гену c-fos, индукции синтеза ИЛ-2 мРНК не происходит без внесения в среду митогена КонА+рИЛ-2. Вместе с тем, на фоне стимулирования активности гена ИЛ-2 (КонА+рИЛ-2), ротационный стресс приводит к усилению индукции синтеза ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах. При этом повышение содержания ИЛ-2 мРНК по сравнению с контролем у мышей, подвергшихся ротационному стрессу, составляет 40% (Рис. 3).
Более высокие величины уровня синтеза ИЛ-2 мРНК в присутствии Кон А + рИЛ-2 при ротационном стрессе могли быть обусловлены ко-стимулирующим действием ИЛ-1, синтез которого в лимфоцитах под влиянием ротационного стресса показан другими авторами (Korneva et al., 1992).
Следующей задачей являлось проследить, какие изменения происходят под влиянием неантигенного стимула (ротационного стресса) не только в клетках иммунной системы, но и в клетках нервной системы. В частности, происходит ли экспрессия гена ИЛ-2 под действием стресса в головном мозгу, имеет ли место при этом корреляция процессов активации генов c-fos и ИЛ-2, какие структуры головного мозга реагируют на стресс изменением экспрессии этих генов.
![Экспрессия генов-мишеней гормонального канцерогенеза под воздействием ДДТ, бензо[а]пирена и 3-метилхолантрена](/i/i/4712/570538.png "Экспрессия генов-мишеней гормонального канцерогенеза под воздействием ДДТ, бензо[а]пирена и 3-метилхолантрена Чанышев Михаил Дамирович")
