Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из самых тяжелых и опасных сердечно-сосудистых заболеваний нашего времени является атеросклероз и его клинические проявления, такие , как ишемическая болезнь сердца. Развитие атеросклероза , в свою очередь обусловливается различными факторами риска. Одним из них является низкое содержание в крови липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), обладающих антиатерогенным действием. Во многих исследованиях показано, что существует обратная зависимость между содержанием в крови ХС, связанным с ЛПВП (ХС-ЛПВП), и частотой развития атеросклероза. В работах А.Н. Климова с сотрудниками (1970, 1974) впервые было уделено внимание антиатерогенным свойствам ЛПВП и рассмотрена возможность использования ЛПВП и их главной белковой составляющей, аполипопротеина A-I (ano A-I), в лечебных целях. Этот подход стимулировал изучение возможностей регуляции экспрессии гена ano A-I in vitro и in vivo для повышения уровня ЛПВП в плазме крови человека и животных, а также предопределил создание лабораторных животных, трансгенных по этому гену. К настоящему времени усилиями ряда исследователей антиатерогенность ano A-I человека была убедительно продемонстрирована в экспериментах на трансгенных животных и были предприняты первые попытки использовать ген ano Л-І в иелях предотвращения развития атерогенных нарушений путем его переноса в соматические клетки нокаутированных животных.
Вместе с тем, в ведущих научно-медицинских центрах разрабатывается принципиально новое направление в лечении тяжелых наследственных, в том числе сердечно-сосудистых, заболеваний методами ге-нотерапии. Эти методы лечения появились, а точнее продолжают появляться, в 90-е годы благодаря бурному развитию таких разделов фундаментальной биологической науки как биохимия, генетика, молекулярная и клеточная биология. Суть нового подхода к лечению заключается в подавлении или замедлении развития заболевания за счет активности доставленных (трансплантированных) в организм генетических конструкций (генов или их фрагментов).
Успех в лечении заболевания путем трансплантации генов во многом определяется выбором способа доставки и вектора экспрессии "лечащего" гена. При разработке подходов к генотерапии тех или иных заболеваний необходимо апробировать каждое звено предполагаемого подхода, то есть создать эффективные векторы экспрессии, содержащие "лечащий" ген, перенести этот ген в соответствующих векторах в культивируемые клетки млекопитающих, смоделировать на животных условия развития заболевания, используя в том числе и трансгенных животных, и, наконец, доставив нужные генетические конструкции в организм животных, у которых заболевание смодели-
2 ровано, добиться коррекции нарушенных функций организма, вызванных заболеванием.
Благодаря первым успехам в гемотерапии тяжелого комбинированного иммунодефицита (вызванного наследственным дефектом гена аденозиндезаминазы) в США, а затем в ряде европейских стран были разработаны проекты лечения ряда других наследственных , а также онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний. Проекты по доставке in vivo "лечащего" муковисцидоз гена в легкие больных, после успешной апробации на животных, получили одобрение государственных контрольных органов США и стран Европы и осуществлены к настоящему времени на десятках пациентов. Разрабатываются способы генотерапии больных с недостаточностью а-1-антитрипсина (вызывающей эмфизему легких), с гемофилией, с опухолями головного мозга и ряда других органов и тканей.
Для лечения атеросклероза на пациентах использован направленный перенос гена рецептора липопротеинов низкой плотности (рЛПНП) в печень больных наследственной формой гиперхолестери-немии, вызванной дефектом гена рЛПНП. Этот подход стал возможен после успешных результатов по переносу гена рЛПНП животным, у которых это заболевание было генетически смоделировано.
К сожалению, до настоящего времени в России не было создано ни одного реального метода лечения больных сердечно-сосудистыми заболеваниями с помощью генотерапии. Более того, нет ни одной работы, в которой были бы достигнуты успехи в доставке "лечащих" генов в организм животных в условиях моделирующих генотерапшо того или иного заболевания человека.
В настоящей работе, с учетом отмеченных выше тенденций, основное внимание уделено гену апо A-I, главного белка антиатерогенных ЛПВП человека: охарактеризованы отдельные важные участки 5!- и 3'-концевых районов регуляции экспрессии гена апо А-1 человека, исследованы способы доставки гена апо А-1 в соматические клетки ряда млекопитающих и экспрессия этого гена в чужеродном окружении; приводятся данные по получению трансгенных животных с целью моделирования заболеваний человека, связанных с нарушением функции апо А-1.
Цель и задачи исследований.
Цели настоящей работы - охарактеризовать новые регуляторные участки в 5' и З'-концевых районах гена апо А-1 человека, исследовать способы доставки гена апо А-1 в клетки млекопитающих, проанализировать экспрессию гена апо А-1 человека, доставленного в соматические клетки in vitro и in vivo; получить животных, трансгенных по гену апо А-1 человека.
В задачу работы входит:
1. Исследовать структурно-функциональную организацию районов регуляции экспрессии гена апо A-I человека; охарактеризовать структуру и функцию отдельных цис-элементов в 5'- и 3'- концевых участках гена апо A-I.
-
Создать ряд генетических конструкций, представляющих собой эукариотические векторы экспрессии гена апо A-I человека.
-
Доставить рядом способов ген апо A-I человека под контролем сильных нетканеспецифических лромоторов в культивируемые клетки млекопитающих и проанализировать экспрессию этого гена.
-
Используя соответствующие генетические конструкции получить кроликов, трансгенных по гену апо A-I человека, содержащих его в прямой и обратной (антисмысловой) ориентациях, исследовать последствия воздействий перенесенного гена на трансгенный организм.
-
Доставить бактериальные гены-маркеры и ген апо A-I человека в клетки печени крысы и изучить условия длительной экспрессии перенесенных генов.
Основные положения, выносимые на защиту. В 5'- и З'-концевых районах гена апо А-Ї человека обнаружены и охарактеризованы регу-ляторные цис-элемеиты: Арі - подобные элементы и GCC-элемент, способные участвовать в регуляции транскрипции генов млекопитающих. Идентифицирован новый белковый фактор транскрипции, взаимодействующий с GCC-элементом.
Ген антиатерогеиного апо А-1 человека, поставленный под контроль сильных нетканеспецифичных эукариогических промоторов, доставлен рядом способов в культивируемые клетки млекопитающих, где его полноценная экспрессия была подтверждена молекулярно-бпологическими и пммунохнмнческими методами.
Наименее токсичным и неиммуногенным способом доставки, в виде комплекса ДНК с молекулярными конъюгатами, ген апо А-1 человека был доставлен в печень лабораторного животного (крысы), где происходила его экспрессия, с секрецией новосинтезированного апо А-I в кровь.
Подтверждено предположение о продолжительной активности перенесенных в составе эукариотического вектора экспрессии гена в печени крысы, которая была достигнута благодаря частичной гепатоэк-томии.
Научно-практическая значимость работы. Теоретическое значение работы заключается: 1) в характеристике новых цис-элементов в 5'- и 3'- концевых районах регуляции экспрессии гена апо А-1 человека, что значительно расширяет представления о возможностях регуляции этого гена в клетках млекопитающих; 2) в открытии факта экспрессии гена апо А-1 в клетках ЦНС на ранних стадиях эмбриогенеза человека;
4 3) в доказательстве возможности функционирования перенесенного гена апо A-I человека с образованием полноценного белкового продукта его деятельности в клетках млекопитающих, в которых синтеза собственного апо A-I не происходит; 4) в достижении экспрессии гена апо A-I человека в клетках печени лабораторного животного (крысы) после его доставки в печень в комплексе со специфичным для гепато-цитов молекулярным конъюгатом.
Практическая ценность работы обусловлена тем, что использованные способы доставки генов-маркеров и гена апо A-I в клетки млекопитающих выгодно отличаются от распространенного способа доставки генов в составе аденовирусов высокой избирательностью, отсутствием токсического и выраженного иммуногенного эффектов, а в отличие от нетоксичного способа доставки генов в липосомах - большей избирательностью и более высокой эффективностью доставки.
Использованный способ доставки генов в комплексе с молекулярными конъюгатами способен обеспечить продолжительную экспрессию перенесенного гена, что особенно важно для осуществления лечащего эффекта генов, переносимых с целью генотерапии.
Научная новизна работы. Обнаружены и охарактеризованы новые цис-элементы в 5' и З'-концевых районах регуляции экспрессии гена человеческого апо A-I. Впервые ген апо A-I человека был доставлен в культивируемые клетки млекопитающих в составе рекомбинантного ретровируса, показано образование полноценного белкового продукта экспрессии этого гена в инфицированных ретрозирусом клетках.
Впервые было показано, что ген апо A-I способен экспрессировать-ся на ранних стадиях эмбрионального развития человека в клетках, нервной системы.
Впервые получены кролики, трансгенные по гену апо A-I человека, у которых в зависимости от особенностей генетической конструкции, несущей ген ало А-1, развивалась дислнпопрогеидемия или наблюдался нейрологический синдром Тенжирской болезни человека.
Впервые ген апо А-1 человека был направленно доставлен в печень крысы в комплексе с молекулярным конъюгатом, при этом новосинте-зированный белок апо А-1 секретировался в кровь животного.
Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации докладывались на Всесоюзной конференции по генотерапии, Киев, 1991 г., на Сессии РАМН, 1992 г., Всероссийских симпозиумах: "Клеточное ядро", Санкт-Петербург, 1993 г., "Биохимические аспекты атеросклероза", Санкт-Петербург, 1994 г., "Липиды и липопротеиды", Санкт-Петербург, 1995 г., Конференции в рамках ГНТП "Геном человека", Черноголовка, 1996, Всероссийской школе по молекулярной биологии, Репино, Санкт-Петербург, 1996, Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 1996 г.;
5 Международном симпозиуме по вирусологии (Intern. Congress Virol., 1993, Glasgow, Scotland).
Основное содержание работы отражено в 20 научных публикациях. Объем и структура работы.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментального раздела, включающего изложение материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения , выводов и списка литературы. Работа изложена на 250 стр. машинописного текста, иллюстрирована 46 рисунками (фотографиями), 8 таблицами. Список литературы содержит 280 ссылок на публикации отечественных и зарубежных авторов.
