Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 13
1.1 Современная концепция окислительного стресса 13
1.1.1 Свободнорадикальные процессы 13
1.1.2 Роль окислительного стресса в развитии воспалительных процессов и старения 23
1.2 Антиоксиданты с потенциальным системным эффектом. 27
1.2.1 Каротиноиды 30
1.2.2 Экранированные фенолы 38
1.2.3 Липофильные катионы 42
1.2.4 Олигопептиды 44
1.2.5 Бактериальные пробиотические препараты 46
2 Материалы и методы исследования 50
2.1 Материалы исследования 50
2.1.1 Биосенсорные штаммы 51
2.1.2 Индукторы окислительного стресса 54
2.1.3 Потенциальные протекторы. 57
2.1.4 Экспериментальные животные 60
2.2 Методы исследования 62
2.2.1 Энзимологические исследования и тесты in vitro. 62
2.2.2 Биолюминесцентный тест 64
2.2.3 Культивирование Deinococcus radiodurans 66
2.2.4 Определение концентрации каротиноидов Deinococcus radiodurans 68
2.2.5 Тест на антимутагенную активность. 68
2.2.6 Работа с экспериментальными животными 69
2.3 Статистическая обработка данных и достоверность результатов 77
3 Результаты 78
3.1 Изучение антиоксидантной и ДНК-протекторной активностей ряда соединений в биолюминесцентном тесте 78
3.1.1 Определение эффективных нелетальных доз прооксидантов и оптимальной плотности культуры для системы биосенсоров . 78
3.1.2 Сравнительный анализ результатов биохимического теста на активность каталазы и уровня экспресии Kat-оперона в клетках биосенсорного штамма E.coli MG 1655 (pKatG-lux) 78
3.1.3 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности контрольных соединений: тролокс, аскорбат, -токоферол 79
3.1.4 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности липофильных катионов 81
3.1.5 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности олигопептидов 84
3.1.6 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности бактериальных пробиотических препаратов 93
3.2 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности потенциальных адаптогенов в биолюминесцентном тесте 95
3.2.1 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности экранированных фенолов 95
3.2.2 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности каротиноидов Deinococcus radiodurans 108
3.3 Оптимизация параметров культивирования Deinococcus radiodurans для экстракции каротиноидов. 116
3.4 Изучение антимутагенной активности каротиноидов D.radiodurans. 117
3.5 Изучение влияния каротиноидов Deinococcus radiodurans на динамику заживления ран у млекопитающих 118 3.5.1 Динамика уровня глюкозы в крови мышей CD-I при моделировании стрептозоцинового сахарного диабета и на фоне перорального введения каротиноидов 118
3.5.2 Анализ данных планиметрических исследований влияния каротиноидов в модели механической раны на фоне сахарного диабета I типа 121
3.5.3 Анализ спонтанной и металл-катализируемой деструкции белков сыворотки крови мышей CD-I при моделировании стрептозоцинового сахарного диабета и на фоне введения каротиноидов 127
4 Обсуждение полученных результатов 129
Выводы 146
Список использованных источников
- Роль окислительного стресса в развитии воспалительных процессов и старения
- Энзимологические исследования и тесты in vitro.
- Определение эффективных нелетальных доз прооксидантов и оптимальной плотности культуры для системы биосенсоров
- Анализ данных планиметрических исследований влияния каротиноидов в модели механической раны на фоне сахарного диабета I типа
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время в биологии и медицине широкое распространение приобретает концепция системного подхода, рассматривающая живой организм в качестве сложной системы прямых и обратных связей. Многие патологические явления при детальном исследовании их механизмов демонстрируют свою «системность», являясь, по сути, результатом не столько активации, либо инактивации отдельных молекулярных механизмов, сколько результатом дисбаланса в общеорганизменных процессах.
Одним из наиболее ярких примеров системного дисбаланса в живых организмах является окислительный стресс. Существует мнение, что за счет этого механизма (роста свободнорадикальных повреждений на молекулярном уровне, нарушения баланса в работе антиоксидантной системы организма, нарушения регуляции клеточного гомеостаза) реализуются такие явления, как феноптоз (Skulachev, 1997), старение и связанные с ним патологии (Зенков, 2001; Хавинсон, 2003; Дубинина, 2006, Skulachev, 2007). Генерация активных форм кислорода (АФК) значительно усиливается также при развитии стрессорных реакций и воспалительных процессов (Часовских, 2009). Поэтому актуальным является поиск соединений, обладающих системным биологическим эффектом, среди антиоксидантов, способных противостоять окислительному стрессу. При скрининге этих соединений необходимо рассматривать как биохимические, так и генетические аспекты их функционирования – и способность прямо или опосредованно инактивировать АФК (антиоксидантную активность), и способность защищать генетический аппарат клетки от окислительных повреждений (антигенотоксическую, или ДНК-протекторную активность).
Первые шаги в этом направлении уже были предприняты российскими и зарубежными геронтологами при изучении свойств олигопептидов (Хавинсон, 2001), фуллеренов (Baati, 2012), соединений ряда SkQ (производных пластохинона) (Skulachev, 2007; 2011; 2012). Геропротекторные и прочие системные эффекты этих соединений могут быть частично или полностью основаны на их антиоксидантной активности.
Однако исследования in vivo на животных достаточно трудоемки и требуют длительного времени. Очевидно, что необходимы более простые и информативные модельные системы. В качестве таковых систем можно использовать бактериальные биосенсоры – генно-модифицированные штаммы бактерий, способные сигнализировать об изменении внутриклеточной среды, увеличивая экспрессию определенных генов. Было сформулировано предположение о возможности прогнозирования системного биологического эффекта у млекопитающих путем оценки способности соединений снижать окислительный стресс в ходе экспресс-скрининга с применением системы LUX-биосенсоров (Чистяков и др., 2013). Возможность подобной экстраполяции логически вытекает из общности антиоксидантных механизмов для всех живых организмов, поскольку поддержание редокс-статуса клетки является одной из первых эволюционных задач, решенных природой еще на уровне прокариот.
Согласно данным литературы, смеси антиоксидантов могут проявлять более высокую протекторную активность, чем отдельные вещества, т.е., для таких смесей наблюдается синергетический эффект (Greul, 2002; Lin, 2003). В связи с этим были исследованы как отдельные вещества, так и комплексные смеси.
Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование антиоксидантной и ДНК-протекторной активностей ряда соединений в экспресс-тестах с применением бактериальных LUX-биосенсоров и прогнозирование их антимутагенной и системной биологической активности на основе результатов тестов.
Были поставлены следующие задачи:
-
Провести сравнительный анализ чувствительности к индукторам окислительного стресса энзимологических методов и метода, основанного на детекции уровня экспрессии оперонов, объединяющих стресс-промоторы, промоторы SOS-репарации и структурные гены люциферазного оперона.
-
Изучить способность ряда веществ с подтвержденной в опытах на млекопитающих геропротекторной и адаптогенной активностью (SkQ1, олигопетиды) защищать клетки биосенсоров от повреждения индукторами окислительного стресса и генотоксинами.
-
Изучить антиоксидантную и антигенотоксическую активности синтетических и природных соединений (экранированных фенолов, каротиноидов бактерии Deinococcus radiodurans) c целью отбора наиболее эффективного протектора для дальнейших испытаний на экспериментальных животных.
-
Оптимизировать условия культивирования D. radiodurans для получения максимального содержания каротиноидов.
-
Изучить способность диоксидина индуцировать устойчивость к рифампицину у Escherichia coli.
-
Изучить антимутагенную активность каротиноидов D. radiodurans в модели индуцированного мутагенеза у E.coli.
-
Определить влияние каротиноидов, экстрагированных из D. radiodurans, на динамику заживления ран у мышей линии CD-1 и уровень окислительных модификаций белков в сыворотке крови.
Научная новизна. С помощью системы бактериальных биосенсоров впервые изучены антиоксидантная, антигенотоксическая и антимутагенная активности каротиноидов D. radiodurans, ионола и соединений из ряда экранированных фенолов: 4(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфоний бромида и 3-бис(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодида, липофильного катиона с антиоксидантной нагрузкой (SkQ1), четырех олигопептидов (панкраген, пинеалон, везуген, изовилона), ряда пробиотических препаратов бактериальной природы.
Впервые продемонстрирована супероксидустраняющая активность SkQ1 (производного пластохинонилдецилтрифенилфосфония) в опытах in vivo. Показано, что соединения, для которых в литературе описана адаптогенная и/или геропротекторная активность, обладают еще и свойствами антиоксидантов и антигенотоксинов.
Впервые показана способность нелетальных для бактерий доз диоксидина вызывать значительное усиление частоты устойчивых к рифампицину мутантов E. coli, а также способность природных каротиноидов снижать интенсивность этого эффекта.
Практическая значимость. Экспериментально подтверждена возможность прогнозирования системной биологической активности соединений на основании результатов экспресс-тестов на антиоксидантную и антигенотоксическую активности.
Показано, что каротиноиды D. radiodurans стимулируют заживление ран как при наружном, так и при сочетанном (наружном и пероральном) введении, и более эффективно повышают скорость регенерации кожных ран у мышей со стрептозоциновым диабетом I типа, чем ликопин.
Подобраны оптимальные параметры культивирования D.radiodurans, позволяющие повысить прирост биомассы и содержание каротиноидов по сравнению с культурой, выращенной на стандартной среде.
Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых фармакологических и косметических препаратов. Область применения – медицина, фармакология, косметология.
Материалы работы используются при чтении лекций на кафедрах биохимии и генетики Южного федерального университета в спецкурсах «Свободные радикалы в биологических системах», «Современные проблемы генетики», «Мутагены окружающей среды».
Положения, выносимые на защиту.
-
Оценка уровня экспрессии плазмидного KatG оперона в биолюминесцентном тесте является более чувствительным методом определения уровня перекиси водорода, чем стандартный энзимологический тест на активность каталазы.
-
Препарат, проявивший максимальный протекторный эффект в экспресс-тестах, проявляет также антимутагенную активность и стимулирует заживление ран у экспериментальных животных.
-
Механизмы системной биологической активности ряда веществ могут быть в значительной мере обусловлены их влиянием на антиоксидантный баланс и стабильность генетического аппарата клетки, поэтому возможно прогнозирование подобной активности на основании экспресс-тестов на антигенотоксическую и антиоксидантную активность веществ.
Апробация результатов исследований. Материалы, положенные в основу работы, были представлены на следующих конференциях: на XLIX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», 2011 г. (Новосибирск); IV Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины", 2011г. (Ростов-на-Дону); Международной конференции «Биология – наука XXI века», 2012 г. (Москва); Научно-практической конференции на базе Южного Федерального Университета «Миссия молодежи в науке», 2012 г. (Ростов-на-Дону); Научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии», 2013 г., (Ростов-на-Дону); V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 2013 г. (Ростов-на-Дону).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 5 статей в журналах, рецензируемых ВАК Минобрнауки РФ. Получено одно свидетельство о регистрации электронного ресурса «База данных по бактериальным LUX-биосенсорам». Общий объем публикаций составил 2,88 п.л., личный вклад – 35,4 %.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов, списка литературы (199 источников) и 2 приложений. Иллюстрационный материал включает 68 рисунков, 13 таблиц.
Работа выполнена при финансовой поддержке НИИ митоинженерии МГУ, Министерства здравоохранения и социального развития РФ, и Министерства науки и образования РФ в рамках проекта 4.5835.2011 «Исследование механизмов действия негативных антропогенных и экстремальных факторов среды с помощью клеточных биосенсоров».
Роль окислительного стресса в развитии воспалительных процессов и старения
У человека оксидативный стресс является причиной или важной составляющей многих серьёзных заболеваний, а также является одной из составляющих процесса старения. Было показано, что генерация АФК значительно усиливается в условиях патологии, при развитии стрессорных реакций и воспалительных процессов (Часовских, 2009). Окислительный стресс развивается, в частности, и при воспалении, сопровождающем заболевания ЖКТ. Кроме того, в условиях окислительного стресса на образование АФК может расходоваться до 20-30 % кислорода, поступающего в клетки, что само по себе усугубляет кислородное голодание тканей. Установлено, что более 200 различных патологий и многие экстремальные состояния протекают на фоне повышенной генерации свободных радикалов. К настоящему времени накопились доказательства того, что окислительное повреждение ДНК является неспецифическим побочным эффектом воспаления, в том числе и вызванного аллергическими процессами. Эндогенные факторы, повреждающие ДНК, наиболее интенсивно вырабатываются при развитии патологических процессов, особенно хронического воспаления, которое имеет место при аллергических заболеваниях (Новик, 2009). В результате развиваются злокачественные заболевания, диабет, патологии органов зрения, ослабевает способность к регенерации (Khansari, 2009; Sirisinha, 2011).
Одной из актуальных проблем современной медицины является лечение раневых процессов, которые независимо от этиологии характеризуются наличием болевого синдрома, патогенной микрофлоры, гнойного экссудата, избыточной гидратации и т.д. (Кузин, 1990). Раневой процесс, как и любое патологическое состояние, сопровождающееся повреждением ткани, приводит к активации свободно-радикальных процессов. Активация нейтрофилов и тканевых макрофагов способствует накоплению в области раны АФК, что, с одной стороны, приводит к поражению клеточных мембран патогенных микроорганизмов, а с другой вызывает развитие эндотоксикоза. В раневой области система антиоксидантной защиты нарушается, что может привести к повреждению клеток, не только в зоне раневого дефекта, но и в перифокальной области, что в свою очередь задерживает протекание раневого процесса (Menke, 2007; James, 2003). Одной из неизбежных сторон этого процесса является повреждение ДНК. Феномены усиления окислительного повреждения ДНК при воспалительных процессах описаны многими исследователями. Так, было обнаружено девятикратное превышение уровня окисленных оснований ДНК в опухоли по сравнению с окружающими нормальными тканями (Malins, 1991). Позже появились сообщения об аналогичных эффектах для печени, пораженной гепатитом и циррозом (Shimoda, 1994), печени трансгенных мышей, трансформированных геном одного из белков вируса гепатита В, тканей желудка у больного желудочной инфекцией, вызванной Helicobacter pylori и т.д. (Farinati, 1998). Трехкратное увеличение содержания окисленных оснований в ДНК печени отмечено для больных болезнью Вильсона, у которых гипернакопление меди ведет к развитию окислительного стресса. Содержание вышеназванных аддуктов проявляет обратную корреляцию с концентрацией антиоксидантов.
При заболеваниях, сопровождающихся таким клиническим симптомом, как гипергликемия (при сахарном диабете), окислительный стресс играет значительную роль в развитии заболевания. Гипергликемия способствует возникновению окислительного стресса многочисленными путями: дисбаланс окислительно-восстановительного потенциала клеток, опосредованный повышением активности редуктазы альдозы (Yagihashi et al., 2001) повышение уровня продуктов гликозилирования (Brownlee, 1988), изменение активности протеинкиназы С (PKC), особенно -изоформ (Cameron, 1999), дисбаланс простагландинов (Pop-Busui, 2002; Kellogg, 2005) и повышение синтеза перекиси водорода митохондриями (Nishikawa, 2000; Brownlee, 2003).
Пероксид водорода ослабляет инсулиновый сигналинг (Rudich, 1997) и снижает транспорт глюкозы (Rudich, 1998), что может являться одной из причин возникновения инсулин-резистентности. В свою очередь, инсулин поддерживает продукцию пероксида в липоцитах (Krieger-Brauer, 1992). Окислительный стресс на фоне гипергликемии приводит к микроваскуляторной дисфункции. Сосудистая недостаточность вызывает ишемизацию раны, что в свою очередь, способствует накоплению и активации нейтрофилов и др. клеток воспаления, синтезирующих АФК (Moseley, 2004).
Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что генерация АФК является следствием гипергликемии. Наблюдается положительная корреляция между уровнем окислительного стресса метаболическим синдромом, ожирением и инсулин-резистентностью (Vincent, 2004; Keaney, 2003). Известно, что клетки сосудов и особенно клетки эндотелия – основные источники АФК при гликемии даже в случае умеренного повышения уровня глюкозы (Rosen, 2001; Pagano, 1995; Bouloumie, 1997; Suzuki, 1995).
Таким образом, очевидно, что рост генерации АФК является одним из ведущих факторов в возникновении и развитии диабета и его осложнений (катаракта, нефропатия, невропатия и др.).
Основным источником экзогенных АФК при воспалении в ранах является NADPH-оксидаза фагоцитов (Babior, 2004). В тканях раневой области происходит активное образование АФК, которые выполняют как бактерицидную, так и регуляторную функцию (Ojha, 2008). Концентрация пероксида водорода в раневом экссудате на фазе воспаления достигает сотен микромолей на 1 л и затем постепенно снижается.
В фазе регенерации АФК в низких концентрациях стимулируют новообразование грануляционной ткани и ангиогенез. При хроническом воспалении снижения АФК в ранах не происходит, что является одной из основных причин нарушения процесса ранозаживления у больных диабетом, атеросклерозом, а также у пожилых людей. Возникающие в результате различных патологий длительно незаживающие или хронические раны остаются одной из существенных медицинских проблем. Антиоксиданты в ряде случаев (в частности, при диабете) способствуют заживлению таких ран (Sen, 2010), что однозначно указывает на важную роль АФК в данном патологическом процессе. Роль АФК в процессе старения была отмечена еще в 60-е гг. ХХ века, когда была сформулирована свободнорадикальная теория старения (Harman, 1956). Механизм старения и широкий спектр связанных с ним патологических процессов - сердечно-сосудистые заболевания, возрастные иммунодепрессия и дисфункция мозга, катаракта, рак и др. - объясняются в рамках этой теории накоплением окислительные повреждений макромолекул
Энзимологические исследования и тесты in vitro.
В живой клетке в норме присутствует широкий спектр низкомолекулярных олигопептидов. Одной из основных функций эндогенных пептидов является регуляция интенсивности процессов свободнорадикального окисления, в том числе ПОЛ. Эта функция осуществляется за счет изменения уровня потребления кислорода, интенсивности образования свободных радикалов и продуктов окисления (Лысенко, 2005). Регулируя антиоксидантный баланс, олигопептиды принимают значительное участие в противодействии организма окислительному стрессу, возникающему при патологических процессах и стрессовых состояниях (Болдырев, 1998; Хавинсон 2003).
Выделенные к настоящему моменту из тканей животных олигопептиды, обладающие доказанным геропротекторным и адаптогенным эффектом, представляют собой низкомолекулярные соединения пара- и аутокринной природы, обеспечивающие перенос информации как внутри клеток, так и между группами клеток. Широкий спектр функциональной активности этих соединений объясняется их влиянием на фундаментальные механизмы, составляющие основу разнообразных патологических процессов. Так, установлено, что они способны увеличивать продолжительности жизни у млекопитающих, замедлять развитие опухолей, а также обладают иммуномодулирующим действием – способны к усилению клеточного и гуморального иммунитета, к улучшению коагулогических показателей, повышению нейрональной активности, оптимизации когнитивных функций (Анисимов, 2003; Лысенко, 2005).
Для ряда низкомолекулярных олигопептидов (эпиталона, вилона и кортагена) экспериментально показано влияние на свободнорадикальные процессы и основные системы антиоксидантной защиты в крови, печени и мозге лабораторных животных. Особенно высокую эффективность данные соединения демонстрировали в качестве геропротекторов. При этом показано, что короткие пептиды (эпиталон, кортаген, вилон, пинеалон и везуген) обладают антиоксидантными свойствами в экспериментах in vivo и in vitro (Козина, 2008).
Пептидная регуляция существует на всех уровнях функционирования организма (Гомазков, 1995; Шерстнев, 1999). Существует мнение, что пептиды могут включаться в контроль экспрессии генов, осуществляя регуляцию еще и на этом уровне (Хавинсон, 2003; Пальцев, 2008). Показано, что пептиды, обладающие антиоксидантной активностью, способны корректировать нарушения взаимодействия генов в условиях окислительного стресса, возникающего при старении вследствие развития ряда патологических процессов (сердечно-сосудистые патологии, нарушение мозгового кровообращения, онкологические заболевания, нейродегенеративные болезни и т.д.) (Козина, 2008). В частности, существует гипотеза о вызываемой пептидными регуляторами модификации характера экспрессии генов, кодирующих белки, являющиеся структурными компонентами митохондриальных мембран. Благодаря таковой регуляции пептиды, ингибируя свободнорадикальные процессы в мембране, способствуют сохранению ее целостности и обеспечивают нормальное функционирование клетки (Khavinson et al., 2002, 2007).
Механизмы действия регуляторных пептидов объясняют, с одной стороны, с точки зрения существования так называемого пептидного каскада. Суть данной гипотезы в том, что каждый пептид, помимосвоей непосредственной биологической активности, обладает также способностью индуцировать выход иных эндогенных регуляторных пептидов. Те, в свою очередь, также могут служить индукторами выхода других регуляторов, благодаря чему возникает сложный каскадный процесс, продолжающийся в течение промежутков времени, значительно превышающих время существования в организме отдельных молекул пептидов (Ашмарин, 1986; Козина, 2008). В качестве иного механизма действия регуляторных пептидов называют их процессинг. В короткие сроки путем активации определенных протеолитических ферментов в нужном компартменте образуется необходимое количество требуемых пептидов. При этом образующиеся короткие фрагменты длиной в 3-4 аминокислотных остатка могут оказаться значительно более эффективными, чем исходные соединения (Гомазков, 1995).
Бактериальные пробиотические препараты Применение пробиотических препаратов является сейчас одной из наиболее эффективных и безопасных технологий, применяемых при лечении и профилактике заболеваний желудочно-кишечного тракта. Они используются также для нормализации микрофлоры после приема антибиотиков и иммуномодуляции (Бондаренко, 2005; Isolauri, 2002; Matsuu, 2003). Многочисленные исследования подтвердили эффективность использования пробиотиков в акушерстве, гинекологии, стоматологии, дерматологии, ревматологии, при заболеваниях опорно-двигательного аппарата, туберкулезе, сахарном диабете и т.д. (Воробьев и др., 2004). Пробиотические и синбиотические препараты широко используются для профилактики илечения аллергических заболеваний, обладают противовоспалительной активностью (Khansari, 2009; Снарская, 2011). Столь широкий спектр терапевтической активности пробиотических препаратов можно объяснить действием ряда механизмов: укрепление цитоскелета клеток кишечного эпителия (усиливается экспрессия гена тропомиозина ТМ-5, синтез актина и окклюзина); снижение проницаемости слизистой кишечника за счет повышения фосфорилирования белка межклеточных соединений; повышение синтеза муцина (стимуляция гена МUC-3) и др. (Урсова, 2006; Vonk, 2002), а также содержанием в них веществ, способных противостоять окислительному стрессу, за счет которого реализуется множество патогенных эффектов на клеточном и организменном уровнях.
Определение эффективных нелетальных доз прооксидантов и оптимальной плотности культуры для системы биосенсоров
Определение окислительной деструкции белков плазмы крови мышей по уровню карбонильных производных
Забор крови у экспериментальных животных проводили после декапитации в группах, получавших каротиноиды per os в течение 14 и 21 суток (группы 4 (А-Е), 5 (А-Е), 7 (А-Е), 8 (А-С) - табл.1). В сыворотке крови определяли степень спонтанного и металл-катализируемого окисления белков по методу Левина (Levine et al, 1990) в модификации Дубининой (Дубинина и др., 1995). Для инициации окислительной модификации белков использовали среду Фентона: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), Fe+2 (4мМ), ЭДТА (1мМ) и Н2О2 (0,3мМ) (Halliwell, 1990). Для регистрации окислительной модификации белков проводили предварительно их осаждение с помощью 20% раствора ТХУ.
К денатурированным белкам приливали 1,0 мл 0,1 М 2,4-ДНФГ, растворенного в 2 М НСl. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 1 часа, затем пробы центрифугировали при 3000 g в течение 20 минут. Осадок промывали 3 раза смесью этанол-этилацетат (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Полученный осадок высушивали для удаления растворителей и затем растворяли в 8 М мочевине. Мочевину приливали к осадку в объеме 3,0 мл. Для лучшего растворения осадка добавляли одну каплю 2 М НСl. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали на спектрофотометре Beckman DU 800 при длине волны 363 нм. Степень окислительной модификации белков выражали в единицах оптической плотности, отнесенных на 1 мл сыворотки крови.
Все полученные результаты обработаны методами математической статистики. При этом были использованы утвержденные методы и компьютерные программы статистического анализа.
Исследования проведены с соблюдением требований инструкций (с постановкой контрольных экспериментов, стандартной шкалы, внутреннего контроля качества). Достоверность полученных результатов контролировалась путем регулярного проведения внутрилабораторного контроля качества.
Результаты, полученные в разделе 3.5, обработаны методами математической статистики с помощью программы STATISTICA 5,5. В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по t-критерию Стъюдента для независимых выборок. Нормальность распределения оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова.
Для штаммов с конститутивными промоторами в качестве «индукторов» использовались потенциальные протекторы. Эти штаммы применялись для подбора концентраций, не токсичных для биосенсоров и не влияющих на работу генноинженерного Lux-оперона. В дальнейших тестах использовались именно эти концентрации потенциальных протекторов. Сопоставление результатов биохимического теста на активность каталазы и оценки уровня экспресии Kat-оперона в клетках биосенсорного штамма E.coli MG 1655 (pKatG-lux)
Чтобы оценить правомерность экстраполяции данных, полученных на генно-модифицированных биосенсорах, на природные системы, был проведен ряд экспериментов по сопоставлению индукции биосенсорного штамма пероксидом водорода и увеличения активности каталазы в его клетках. На рисунках 5-6 представлены результаты данного эксперимента.
Как можно видеть из представленных данных, максимальная экспрессия генноинженерной конструкции с промотором pkatG вызывается концентрацией перекиси водорода, в десять раз превышающей концентрацию, вызывающую максимальную индукцию каталазы, измеряемую при помощи биохимической методики (510-3 и 510-4 М соответственно).
Степень увеличения активности каталазы в обоих случаях значительно различается: если измеренная в биохимическом тесте активность фермента увеличивается в 3,08 раза, то в биолюминесцентном тесте наблюдается усиление экспрессии в 62,7 раз по сравнению с контролем. Для концентрации перекиси, давшей максимальную индукцию в традиционном биохимическом тесте, биолюминесцентный тест выявляет пятнадцатикратное усиление экспрессии. Данные различия определяют большую чувствительность теста, основанного на детекции активности кодирумой плазмидой люциферазы, поставленной под контроль katG промотора, к изменениям внутриклеточной концентрации пероксида водорода. Причины различий чувствительности анализируются в разделе 4.
Анализ данных планиметрических исследований влияния каротиноидов в модели механической раны на фоне сахарного диабета I типа
Результаты исследования спонтанной и металл-катализируемой окислительной модификации белков сыворотки крови мышей с СД и при введении перорально каротиноидов D. radiodurans или ликопина представлены в таблице 10. Поскольку статистически значимых различий между показателями ОМБ в контрольных группах, а также группах получавших каротиноиды перорально и сочетанно не наблюдалось, данные этих групп были объединены в одну выборку. сыворотки крови мышей с СД 1 типа было обнаружено снижение интенсивности ОМБ на фоне сочетанного введения каротиноидов D. radiodurans в большей дозе в течение 21 суток. При пероральном введении каротиноидов D. radiodurans или ликопина в течение 14 суток и ликопина в течение 21 суток не было выявлено никаких различий от значений контроля в уровне 2,4-ДНФгидразонов белков сыворотки крови.
Определение активности антиоксидантных ферментов считается классическим методом изучения окислительного стресса (Хасанов, 2004). Однако если речь заходит о создании специализированных модельных систем, совершенно очевидна необходимость усиления сигнала, детектирующего окислительные повреждения. Данный подход был реализован при создании бактериальных Lux-биосенсоров. Как было показано в разделе 3.1.2., экспрессия генноинженерного оперона pkatG::luxCDABE, введенного в плазмиду, приблизительно в 20,3 раз интенсивнее, чем экспрессия kat-оперона, находящегося в бактериальной хромосоме, определенная биохимически по его продуктам. Весьма вероятно, что это достигается за счет более высокой копийности плазмиды, несущей генноинженерный оперон, по сравнению с хромосомой. Кроме того, классические методы определения активности каталазы отличаются невысокой специфичностью. Рост концентрации индуцибельной бактериальной каталазы, кодируемой геном katG, может маскироваться присуствием множества белков, обладающих пероксид-устраняющей активностью. В их числе могут быть пероксидазы и другие гемсодержащие белки (Imlay, 2008). Очевидно, что оценка уровня экспрессии плазмидного оперона с помощью биолюминесцентного теста является более чувствительным методом. Однако максимальная экспрессия генноинженерной конструкции с промотором pkatG вызывается концентрацией перекиси водорода, в десять раз превышающей концентрацию, вызывающую максимальную индукцию каталазы, измеряемую при помощи биохимической методики (510-3 и 510-4 М соответственно). И в том, и в другом случае после достижения максимума кривая активности падает. По-видимому, при добавлении высоких доз перекиси происходит инактивация ферментов, а затем и гибель клеток, снижающая значения в обоих тестах. Таким образом, модернизация биохимических методов при помощи генной инженерии позволяет получить достаточно экономичные конструкции для более точной оценки экспрессии важных для антиоксидантной защиты оперонов. Преимуществом использования бактериальной люциферазы в качестве биохимического репортера является также возможность оценки ее активности люминометрическим методом, без разрушения клеток.
Проверка экспресс-методики с использованием Lux-биосенсоров на стандартных веществах, чья антиоксидантная активность широко известна и не подлежит сомнению (тролокс, аскорбат, токоферол) показала, что, по крайней мере, два из них проявляют в биолюминесцентном тесте среднюю или высокую протекторную активность (раздел 3.1.3).
Для аскорбата максимальное значение ДНК-протекторной активности составляет 40,16 % при действии концентрации 10-9 М, диапазон эффективных концентраций – 10-4-10-9 М, агентом взаимодействия среди АФК является супероксид-анион, его инактивация максимально эффективна также при концентрации 10-9 и достигает 30, 19%. Для токоферола максимальное значение ДНК-протекторной активности составляет 46,14% при действии концентрации 10-13 М, диапазон эффективных концентраций – 10-4-10-15 М, агентом взаимодействия среди АФК является супероксид-анион, его инактивация максимально эффективна при концентрации 10-5 и достигает 70, 44 %, и пероксид водорода – его инактивация максимально эффективна также при концентрации 10-5 и достигает 49,3 %. Тролокс в данной системе проявляет относительно слабую антиоксидантную активность
При изучении антиоксидантной и ДНК-протекторной активности веществ, для которых показан адаптогенный и геропротекторный эффект, было показано, что эти соединения в той или иной мере обладают свойствами антиоксидантов. Поскольку окислительный стресс лежит в основе множества патологических процессов, механизмы адаптогенной и геропротекторной активности веществ могут быть в значительной мере обусловлены их влиянием (прямым или опосредованным) на антиоксидантный баланс в клетке. 130 Было показано, что (6 -пластохинонил) децилтрифенилфосфоний (SkQ1) обладает способностью перехватывать супероксид-анион радикал (раздел 3.1.4). Данная способность проявляется как in vitro, так и in vivo в опытах на аэробных бактериях. Для SkQ1 максимальное значение ДНК-протекторной активности составляет 94,68 % при действии концентрации 10-8 М, диапазон эффективных концентраций – 10-7-10-9 М, агентом взаимодействия среди АФК является супероксид-анион, его инактивация максимально эффективна при концентрации 10-5 и достигает 61, 26 %.
Cупероксидустраняющая активность SkQ1 проявляется in vitro в концентрациях на 9 порядков меньше, чем in vivo. По-видимому, это связано, с одной стороны, с накоплением вещества в клетках бактерий за счет описанного ранее (см. раздел 1.2.3.) электрохимического механизма, и, с другой стороны, за счет формирования циклов окисления/восстановления, сопряженных с ферментами дыхательной цепи, в результате чего баланс окисленной и восстановленной форм остается постоянным без жесткой зависимости от концентрации (Skulachev, 2010).
Аналогичные процессы идут, по-видимому, и в митохондриях при введении в клетку SkQ1. Косвенно об этом свидетельствуют многочисленные данные по снижению SkQ1 генерации митохондриями перекиси водорода (Skulachev, 2010), которая является в основном продуктом дисмутации супероксидных радикалов.
