Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Свободные радикалы и активированные кислородные метаболиты 14
1.2. Антиоксидантная система человека и животных 23
1.3. Антиоксидантная система плазмы крови 32
1.4. Модельные системы для определения антиоксидантной активности плазмы крови 45
1.4.1. Модельные системы на основе металл-индуцированного пероксидного окисления липидов 46
1.4.2. Модельные системы на основе генерации водорастворимых пероксильных радикалов 54
1.4.3. Модельные системы на основе генерации активных форм кислорода 61
Глава 2. Материалы и методы исследования 65
2.1. Использованные химические реактивы 65
2.2. Характеристика и методы получения экспериментального материалы 66
2.3. Методы биохимического анализа 71
2.4. Хемилюминесцентные измерения 76
2.5. Модельные системы для изучения антиоксидантных свойств биологически активных веществ 78
2.6. Измерение спектров поглощения и флуоресценции 80
2.7. Экспериментальные модели свободнорадикальной патологии 81
2.8. Условия изучения влияния экзогенных антиоксидантов и биологически активных добавок к пище на антиоксидантную активность плазмы крови человека и животных 82
2.9. Клиническая характеристика больных 83
2.10. Статистическая обработка результатов 86
Глава 3. Разработка новой хемилюминесцентнои системы на основе НЬ, Н202 и люминола 87
3.1. Система НЬ-НгОг-люминол как система генерации свободных радикалов 87
3.2. Механизм тушения интенсивности хемилюминесценции системы НЬ-Н202-люминол 96
Глава 4. Антиоксидантная активность плазмы крови в системе НЬ-Н202-люминол 101
4.1. Влияние плазмы крови на параметры хемилюминесценции системы НЬ-Н202-люминол 101
4.2. Определение антиоксидантной активности плазмы крови с помощью системы НЬ-НгОг-люминол 107
4.3. Антиоксидантная активность плазмы крови при некоторых патологических процессах 114
4.4. Влияние экзогенных антиоксидантов и биологически активных добавок к пище на антиоксидантную активность плазмы крови 120
Глава 5. Применение системы НЬ-Н202-люминол для определения антиоксидантной активности лекарственных препаратов и слезной жидкости 128
5.1. Антиоксидантная активность некоторых лекарственных препаратов, применяемых в офтальмологии 128
5.2. Антиоксидантная активность плазмы крови и слезной жидкости при первичной открытоугольной глаукоме 132
Глава 6. Экспериментальное обоснование применения препарата "Диквертин" в условиях оксидантного стресса 142
6.1. Влияние дигидрокверцетина на пероксидацию фосфолипидных липосом в присутствии системы Fe2+-аскорбат 143
6.2. Влияние дигидрокверцетина на фотосенсибилизированное производными гематопорфирина пероксидное окисление липидов липосомальных мембран 148
6.3. Влияние дигидрокверцетина на люминол-зависимую хемилюминесценцию полиморфноядерных лейкоцитов крови... 156
6.4. Железо-связывающая активность дигидрокверцетина 159
6.5. Исследование антиоксидантного действия дигидрокверцетина на экспериментальных моделях свободнорадикальной патологии 168
Глава 7. Применение биофлавоноидного препарата "Диквертин" для коррекции антиоксидантного статуса организма при лечении острой пневмонии 179
Глава 8. Обсуждение результатов 189
Заключение 223
Выводы 227
Литература 229
- Модельные системы на основе металл-индуцированного пероксидного окисления липидов
- Модельные системы для изучения антиоксидантных свойств биологически активных веществ
- Механизм тушения интенсивности хемилюминесценции системы НЬ-Н202-люминол
- Влияние плазмы крови на параметры хемилюминесценции системы НЬ-Н202-люминол
Введение к работе
Известно, что развитие целого ряда патологических состояний организма человека сопровождается усилением образования активированных кислородных метаболитов (АКМ) и свободных радикалов, которые могут вызвать повреждение биологически важных молекул и, в конечном итоге, привести к гибели клетки [117, 197, 268]. Так, установлено, что свободнорадикальное окисление и, в частности, пероксидное окисление липидов (ПОЛ) играет важную роль в патогенезе инфаркта миокарда, атеросклероза, злокачественного роста, бронхолегочных и других заболеваний [87, 109, 192, 268, 349]. Кроме того, активация реакций свободнорадикального окисления может наблюдаться при воздействии на организм человека ряда внешних факторов, например, ионизирующей радиации [19], УФ-излучения [140], гипербарической оксигенации [176], озона [144, 344], табачного дыма [297, 349а 394], промышленных пылей [97, 336].
В норме регуляция продукции АКМ и свободных радикалов в тканях и органах человека осуществляется многоуровневой физиологической антиоксидантной системой, которая включает в себя соединения различной химической природы: витамины, пигменты, гормоны, ферменты [44, 54, 192, 267, 370]. Несмотря на высокую эффективность антиоксидантной системы, она не всегда способна защитить организм человека от развития оксидантного стресса. В связи с этим одним из приоритетных направлений свободнорадикальной биологии и медицины является создание препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами, с целью применения их для профилактики и лечения заболеваний, сопровождающихся усилением свободнорадикальных реакций. Широкие перспективы для практического использования в качестве лекарственных препаратов антиоксидантного действия представляют биологически активные вещества природного происхождения, например, вещества флавоноидной природы [182, 183, 286, 301, 355]. Однако клиническое применение многих из них затруднено в связи с недостаточно изученным механизмом антиоксидантного действия, а также
отсутствием недорогих и эффективных способов оценки состояния антиоксидантной системы.
В настоящее время для оценки состояния антиоксидантной системы организма человека наряду с определением содержания отдельных антиоксидантов в плазме [10, 13, 48, 50, 346] и клетках крови [10, 51, 105, 122] используют показатель, обозначаемый как антиоксидантная активность (АОА) плазмы крови. АОА плазмы (сыворотки) крови - это интегральный показатель, отражающий ее способность противодействовать развитию свободнорадикальных реакций [84, 162]. Основными компонентами тест-систем для определения АОА плазмы крови являются: система генерации радикалов и субстрат или молекула-мишень, которая подвергается свободнорадикальному окислению [267, 290]. Добавление в модельную систему плазмы крови, содержащей различные водо- и жирорастворимые антиоксид анты, приводит к уменьшению образования радикалов и торможению окисления субстрата. Изменение параметров окисления субстрата в присутствии плазмы крови, регистрируемое с помощью полярографии, флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии, хемилюминесценции и других методов, используется для характеристики ее АОА [175, 240, 354].
Существует много способов определения АОА плазмы крови [84, 267, 354]. Вместе с тем, большинство из них не получило широкого внедрения в клиническую практику, что обусловлено отдельными недостатками, к числу которых можно отнести сложность в приготовлении и хранении модельных систем окисления [60, 379], значительную продолжительность процедуры определения [138, 400], низкую чувствительность некоторых тестов [10], необходимость дорогостоящего оборудования [209, 340, 362, 411] или токсичность используемых реактивов [240, 306, 392, 400]. Существенным недостатком ряда предлагаемых способов определения АОА плазмы крови является отсутствие достаточного клинического материала, подтверждающего их практическую значимость [60, 68]. В связи с этим
динамика АОА плазмы крови при многих заболеваниях организма человека, сопровождающихся усилением свободнорадикальных реакций, остается не изученной, а вопрос об использовании этого показателя для оценки эффективности антиоксидантной терапии остается до конца не решенным.
Цель и задачи исследования. Цель работы - получить экспериментальное и клиническое обоснование определения АОА плазмы крови для оценки функционального состояния антиоксидантной системы организма в условиях развития оксидантного стресса и эффективности его коррекции с помощью экзогенных антиоксидантов.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования:
Разработать новую радикал-генерирующую хемилюминесцентную систему для определения АОА плазмы крови, других биологических жидкостей, биологически активных веществ и лекарственных препаратов, отличающуюся высокой чувствительностью и адаптированную к условиям клинико-лабораторного анализа.
Исследовать влияние белков и низкомолекулярных антиоксидантов на параметры хемилюминесценции модельной системы и их вклад в общую АОА плазмы крови.
Исследовать динамику АОА плазмы крови, а также слезной жидкости при некоторых патологических процессах (острая пневмония, острый деструктивный панкреатит, первичная открытоугольная глаукома) и использовании экзогенных антиоксидантов.
С помощью различных систем свободнорадикального окисления изучить антиоксидантные свойства флавоноидного соединения дигидрокверцетина
(ДГК)-
5. Исследовать антиоксидантное действие ДГК in vivo при моделировании
свободнорадикальной патологии (внешнее общее у-облучение и тетрахлорметановый гепатит).
6. Оценить эффективность применения биофлавоноидного препарата "Диквертин" на основе ДГК для коррекции антиоксидантного статуса организма человека при лечении острой пневмонии.
Научная новизна. Разработана новая хемилюминесцентная система генерации свободных радикалов, основными компонентами которой являются гемоглобин, пероксид водорода и люминол (система НЬ-Н202~люминол). Отличительная особенность предлагаемой системы заключается в том, что образующиеся в ней радикалы-инициаторы составляют один из возможных путей инициирования свободнорадикальных реакций in vivo.
На основе системы НЬ-Н202-люминол разработан новый способ определения АОА плазмы крови, других биологических жидкостей (водянистая влага глаза, моча, спинномозговая, слезная и синовиальная жидкость), биологически активных веществ и лекарственных препаратов.
Впервые изучена АОА плазмы крови на разных стадиях развития первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ), исследована динамика АОА плазмы крови при острой пневмонии, остром деструктивном панкреатите.
С помощью системы НЬ-Н202-люминол впервые исследована АОА слезной жидкости в норме и при развитии ПОУГ. Обнаружено уменьшение АОА слезной жидкости по мере прогрессирования глаукоматозного процесса.
С использованием различных модельных систем свободнорадикального окисления и экспериментальных моделей свободнорадикальной патологии получены приоритетные данные об антиоксидантных свойствах ДГК -основного компонента нового перспективного биофлавоноидного препарата "Диквертин". Получены новые сведения об АОА антиоксидантного препарата Тистохром", приготовленного на основе хиноидного пигмента морских беспозвоночных и предлагаемого в качестве антиоксидантного средства для лечения глазных и сердечно-сосудистых заболеваний.
Впервые проведена оценка эффективности применения препарата "Диквертин" как антиоксидантного средства в комплексном лечении острой пневмонии.
Впервые проведено использование нового антиоксидантного препарата Тистохром" для лечения ПОУГ. Обнаружено увеличение АОА слезной жидкости и улучшение зрительных функций у больных ПОУГ после проведения курса парабульбарных инъекций гистохрома.
Данная работа соответствует одному из приоритетных направлений научных исследований по отделению медико-биологических наук РАМН на 2002 г., утвержденных президентом РАМН 25 мая 2002 г. (постановление № 62, протокол № 7, параграф 3) "Изучение фармакологической регуляции нормальных и метаболических процессов. Разработка новых оригинальных лекарственных средств". Диссертационная работа выполнялась также в рамках научных исследований на 2002-2005 г. Межведомственного научного Совета по медицинской биотехнологии при РАМН и Министерства здравоохранения РФ по проблеме: "Изучение факторов биорегуляции и коррекции состояний организма на молекулярном, клеточном, тканевом и организменном уровнях".
Положения, выносимые на защиту
Разработка нового способа определения АОА плазмы крови и других биологических жидкостей на основе хем и люминесцентной системы НЬ-НгОг-люминол.
Применение системы НЬ-Н202-люминол для оценки функционального состояния антиоксидантной системы организма в норме, при различных патологических процессах и использовании экзогенных антиоксидантов.
Биофлавоноидное соединение ДГК является эффективным антиоксидантом в модельных системах свободнорадикального окисления и при моделировании свободнорадикальной патологии у животных.
Биофлавоноидный препарат "Диквертин" - перспективное антиоксидантное средство для комплексного лечения острой пневмонии.
Практическая значимость. Разработанная система НЬ-Н202-люминол отличается от других аналогичных систем простотой, доступностью основных
компонентов и высокой чувствительностью. Предлагаемый способ определения АОА плазмы крови и других биологических жидкостей на основе системы НЬ-Н202-люминол может использоваться для наблюдения за состоянием антиоксидантной системы организма, оценки эффективности антиоксидантной терапии, а также для изучения антиоксидантных свойств биологически активных веществ и лекарственных препаратов.
Результаты изучения АОА плазмы крови и слезной жидкости в норме и при некоторых патологических процессах: острой пневмонии, остром деструктивном панкреатите, ПОУГ - имеют как общее медико-биологическое, так и важное клиническое значение для понимания патогенеза этих заболеваний и прогнозирования их течения. Так, в частности, предложен новый способ прогнозирования прогрессирования ПОУГ на основе определения АОА слезной жидкости (Пат. № 2139538 РФ "Способ прогнозирования прогрессирования глаукомы").
На основании результатов проведенных исследований препарат "Диквертин" разрешен для применения (приказ МЗ РФ № 302 от 29.07.96) у взрослых в качестве антиоксидантного и капилляропротекторного средства при бронхолегочных заболеваниях (острая пневмония, хронический обструктивный бронхит, бронхиальная астма) в составе комплексной терапии в сочетании с другими лекарственными средствами.
Данные, полученные в ходе экспериментальных и клинических исследований, реализованы при создании продуктов питания с добавкой диквертина (кондитерские изделия на жировой основе - АО Московская кондитерская фабрика "Красный Октябрь", сухое молоко "Флаволакт" - ВНИИ молочной промышленности) лечебно-профилактического назначения для предупреждения и коррекции состояний, связанных с недостаточным уровнем антиоксидантов в организме.
Методические подходы, разработанные на основе применения системы НЬ-Н202-люминол, имеют практическое значение и дополняют арсенал
методов, использующихся в клинико-биохимических и научно-исследовательских лабораториях.
Отдельные разделы диссертации используются в учебном процессе на кафедре биофизики медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета.
Модельные системы на основе металл-индуцированного пероксидного окисления липидов
Одной из первых систем, используемых для изучения АО А плазмы или сыворотки крови, являлась модельная система на основе гомогенатов тканей и органов, которые подвергались процессу автоокисления. Известно, что автоокисление гомогенатов органов протекает при участии эндогенного железа, выступающего в качестве инициатора реакций цепного свободнорадикального окисления липидов [295]. Так, в работах Barber А.А. [195, 194], опубликованных еще в 1959 и 1961 г., отмечалось, что сыворотка крови ряда позвоночных животных обладает способностью ингибировать автоокисление гомогенатов мозга и печени крысы. Некоторое время спустя Wills E.D. [408] обнаружено, что лошадиная сыворотка крови тормозила окисление эмульсии линолевой кислоты, катализируемое ионами Fe2+ и аскорбатом, а также ионами Со2+. Полученные результаты авторы этих исследований объясняли связыванием ионов металлов переменной валентности сывороточными белками. Vidlakova М. et al. [396] изучали АОА сыворотки крови, регистрируя торможение ею процесса липидной пероксидации, развивающегося при автоокислении гомогенатов печени крысы. Было установлено, что у людей, подвергавшихся голоданию, АОА сыворотки крови возрастала, а у мышей, наоборот, уменьшалась. Однако ни в том, ни в другом случае динамика общей АОА сыворотки крови не совпадала с изменениями в уровнях сывороточного а-токоферола. Более того, фракция апо-В содержащих липопротеинов сыворотки крови человека, выделенная с помощью метода осаждения и имевшая наибольшее количество а-токоферола, обладала низкими антиоксидантными свойствами по сравнению с цельной сывороткой крови или ее супернатантом, оставшимся после осаждения указанных липопротеинов. Это позволило экспериментаторам высказать предположение, что а-токоферол не вносит заметного вклада в величину обшей АОА сыворотки крови. Опираясь на результаты перечисленных исследований, Stock J. et al. [379, 380] предложили способ определения АОА сыворотки крови человека, основанный на торможении ею автоокисления гомогенатов мозга крупнорогатого скота. За ходом процесса автоокисления гомогенатов мозга наблюдали, определяя количество продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП). Степень торможения накопления ТБК-РП в присутствии сыворотки крови, выраженная в процентах от контроля, была пропорциональна количеству добавленной сыворотки. Исследуя влияние различных веществ, входящих в состав сыворотки крови, на ее АОА, авторы работы обнаружили, что диализ и ультрафильтрация сыворотки крови через микропористые фильтры практически не изменяли ее антиоксидантных свойств. Такой результат указывает на то, что низкомолекулярные вещества, входящие в состав сыворотки крови, представляют несущественную часть ее антиоксидантного потенциала. Нагревание сыворотки крови в течение 10 мин при +60С уменьшало ее АОА более чем на половину, а нагревание в течение 15 мин при +90С уничтожало полностью. Это свидетельствует о том, что основными компонентами антиоксидантної/! защиты сыворотки крови являются белки или связанные с ними вещества. Использование вместо сыворотки плазмы крови не приводило к изменению АОА. Разделение сыворотки крови на отдельные фракции на ДЕАЕ-целлюлозе и сефадексе G-150 с последующим изучением антиоксидантных свойств полученных фракций показало, что АОА обладали только те из них, в которых содержались трансферрин и церулоплазмин. В физиологических концентрациях а-токоферол сыворотки крови оказывал небольшой вклад (менее 10%) в ее АОА.
Один из недостатков модельной системы для определения АОА плазмы крови на основе автоокисления гомогенатов мозга заключается в том, что количество эндогенного железа в гомогенате подвержено колебаниям. В отличие от этой модельной системы, более удобными являются системы, в которых для индуцирования процесса свободнорадикального окисления субстрата добавляется известное количество ионов металлов переменной валентности, например, ионов Fe - одного из главных инициаторов реакций ПОЛ in vivo [37]. Промыслов М.Ш. и Демчук М.Л. [138] разработали способ определения АОА плазмы крови, основанный на торможении ею окисления эмульсии линолевои кислоты, индуцированного ионами Fe2+. В другой аналогичной работе, выполненной Клебановым Г.И. с соавт. [78], в качестве субстрата окисления применялась суспензия желточных липопротеинов, приготовленная из желтков куриных яиц. Ингибирование Ре2+-индуцированного окисления линолевои кислоты или суспензии желточных липопротеинов плазмой крови также регистрировали по уменьшению накопления ТБК-РП липиднои пероксидации. С помощью описаных модельных систем была изучена АОА плазмы крови у больных с черепно-мозговой травмой [138] и острым инфарктом миокарда [99]. В частности, у больных острым инфарктом миокарда, получавших комплексную терапию, включающую, кроме общепринятых лекарственных средств, антиоксидантный препарат ионол и внутривенное лазерное облучение крови (гелий-неоновый лазер), обнаружена более высокая АОА плазмы крови по сравнению с больными, проходившими курс традиционной терапии. Повышение АОА плазмы крови у больных первой группы коррелировало с улучшением результатов клинического обследования и электрокардиографии.
Следует отметить, что методы определения продуктов ПОЛ (например, ТБК-РП), как правило, являются трудоемкими. Это ограничивает их использование в тех случаях, когда необходимо наблюдать за кинетикой процесса окисления субстрата в модельной системе.
Среди методов, позволяющих следить за кинетикой свободнорадикального окисления субстрата в модельной системе, наибольшую популярность получил метод ХЛ. Так, например, Дремина Е.С. и соавт. [60] в качестве модельной системы для изучения АОА плазмы крови предложили систему Ре2+-липосомы.
Модельные системы для изучения антиоксидантных свойств биологически активных веществ
В работе исследовалась плазма крови больных острым деструктивным панкреатитом, находившихся на лечении в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. Диагноз заболевания был установлен на основании результатов комплексных клинических и клинико-лабораторных исследований. Всего было обследовано 18 больных (10 мужчин, 8 женщин) в возрасте 32-72 лет. В исследование были включены случаи тяжелого распространенного деструктивного панкреатита с выраженными явлениями панкреатогенной токсемии в первой фазе заболевания и с обширными зонами панкреатогенной деструкции во второй фазе заболевания. В фазе панкреатогенной токсемии у 15 из 18 больных наблюдались такие осложнения, как панкреатогенный интоксикационный делирий, острая сердечно-сосудистая, острая дыхательная и острая почечная недостаточность в различных комбинациях. Осложнения в фазе деструктивных изменений были у 16 из 18 больных, в том числе асептически протекавшие у 14 больных и гнойно-деструктивные у 2 больных. В контрольную группу вошли 30 здоровых донора той же возрастной категории
Работа проводились совместно с НИИ глазных болезней РАМН. Обследовано 10 клинически здоровых лиц (20 глаз), 35 больных (67 глаз) ПОУГ и 10 больных (17 глаз) с возрастной зрелой катарактой. У 32 больных ПОУГ отмечалась асимметрия: на одном глазу была глаукома 1 или 2 стадии, на контралатеральном глазу - ПОУГ 3 стадии или оперированная глаукома 2-3 стадии, поэтому при обработке результатов учитывали не общее число больных, а количество обследованных глаз. Возраст больных составил 57-70 лет, здоровых - 45-65 лет. Сопутствующими заболеваниями были гипертоническая болезнь, ишемическая болезнь сердца, атеросклероз сосудов мозга, хронический холецистит, мочекаменная болезнь.
При изучении влияния гистохрома на АОА слезы больным глаукомой (п=10) парабульбарно вводили по 1 мл 0,006% раствора этого препарата (однократное введение). Для разведения исходного препарата гистохрома использовали физиологический раствор. Определение АОА слезы проводили до введения гистохрома и в течение 4 ч после инъекции. Контрольное исследование АОА слезы осуществляли на том же глазу, но в другой день. В случае проведения курса лечения гистохромом в виде 10 парабульбарных инъекций больным ПОУГ вводили по 0,5 мл препарата в концентрации 0,003% через день. АОА слезы определяли до и после курса лечения.
Исследования проводились на базе терапевтических отделений Центрального госпиталя внутренних войск г. Москвы. Обследовано 112 больных острой очаговой пневмонией (бактериальной этиологии) мужского пола в возрасте от 19 до 40 лет, без сопутствующей патологии, госпитализированных в первые три дня заболевания. В исследование не включались пациенты с тяжелыми формами бронхолегочного воспаления, которым проводилась интенсивная терапия. Больные были разделены на три группы: 1 - контрольную группу (50 человек), получавшую стандартную терапию без антиоксидантов, которая включала антибактериальное, десенсибилизирующее, общеукрепляющее и физиотерапевтическое лечение; 2 - группу сравнения (32 человека), получавшую комплексное лечение, включающее стандартную терапию и антиоксидантный комплекс (АОК) - а-токоферола ацетат по 0,1 г в капсулах 4 раза в сутки и тиосульфат натрия 10% раствор по 10 мл внутривенно 2 раза в сутки; 3 - опытную группа (30 человек), которая на фоне основной терапии получала диквертин. Для лечения больных использовали таблетки диквертина по 0,02 г. Диквертин назначали внутрь по 0,04-0,06 г (2-3 таблетки) 4 раза в сутки. Курс антиоксидантнои терапии АОК или диквертином проводили в течение первых 14 суток после госпитализации.
Обследование больных осуществляли в разные периоды заболевания: в 1-3 сутки после поступления в стационар (острый период), на 10-14 сутки (подострый период) и на 20-25 сутки (стадия клинического выздоровления). Все показатели сравнивали с группой практически здоровых людей того же пола и возрастной категории (30 человек).
Обследовано 40 больных хроническим обструктивным бронхитом (длительность заболевания более 5 лет) мужского пола в возрасте от 17 до 65 лет, проходивших стационарное лечение в 29 клинической больнице г. Москвы. Диагноз заболевания был установлен на основании результатов клинических, лабораторных, в том числе бактериологических, а также инструментальных методов исследований. Вентиляционную функцию легких исследовали с помощью компьютерного аппарата "Пневмоскрин" (Германия). Для верификации диагноза использовались данные бронхоскопического исследования (фибробронхоскоп BF-20T "Olympus", Япония). При поступлении на фоне выраженных клинических проявлений хронического обструктивного бронхита - приступообразного кашля с трудно отделяемой мокротой слизистого характера до 100 мл в сутки и более, одышки при умеренной и даже незначительной физической нагрузки, большого количества сухих свистящих хрипов, выслушивающихся над всей поверхностью легких, у больных преобладали выраженные нарушения вентиляционной функции легких (согласно критериям J. Ellis). При выписке у пациентов на фоне удовлетворительного состояния отмечался периодический приступообразный кашель (преимущественно в утренние часы) с отделением вязкой слизистой мокроты, выявлялись клинические признаки скрытой бронхиальной обструкции, регистрировались сохранявшиеся вентиляционные нарушения. Контрольное обследование больных проводили через 1 месяц после выписки из стационара.
Результаты исследования обработаны методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и представлены как средние величины ± стандартная ошибка средних.
Механизм тушения интенсивности хемилюминесценции системы НЬ-Н202-люминол
В настоящее время полагают, что антиоксидантную защиту плазмы крови человека от процесса ПОЛ обеспечивают аскорбат, урат, а-токоферол, альбумин, церулоплазмин, трансферрин и SH-группы белков [60, 267, 392, 400J. В предыдущей главе было показано, что добавление в систему НЬ-Н202-люминол этих веществ вызывало изменение параметров ХЛ этой системы -увеличение латентного периода и уменьшение интенсивности свечения. Следовало ожидать, что плазма крови, содержащая все перечисленные антиоксиданты, тоже будет оказывать ингибирующее влияние на окисление люминола. Действительно, введение в систему НЬ-Н2Ог-люминол плазмы крови человека также сопровождалось изменениями кинетики свечения, а именно: увеличением латентного периода и понижением интенсивности ХЛ (рис. 15). С повышением количества добавленной плазмы крови наблюдалось прямо пропорциональное увеличение латентного периода и дозозависимое уменьшение интенсивности ХЛ (рис. 16).
Для подтверждения антиоксидантного действия белков и низкомолекулярных веществ, входящих в состав плазмы крови, на окисление люминола в исследуемой модельной системе плазма была подвергнута фракционированию с использованием геля TOYOPEAPL HW-40. Полученный профиль элюции содержал два пика, выходящих из хроматографической колонки с объемами равными 16-20 мл и 42-46 мл соответственно (рис. 17а). Добавление указанных фракций плазмы крови к системе НЬ-Н202-люминол приводило к уменьшению как интенсивности ХЛ, так и латентного периода модельной системы. С целью идентификации описанных пиков для хроматографии была использована смесь альбумина (0,65 мМ) и урата (0,34 мМ), взятых в концентрациях, соответствующих среднему содержанию этих антиоксидантов в плазме крови. Альбумин и урат были выбраны не случайно.
Уровни этих антиоксидантов в плазме крови являются наиболее высокими. Полученный профиль элюции также содержал два пика (рис. 176). Первый из них соответствовал альбумину (16-20 мл), второй - урату (42-46 мл). При добавлении перечисленных фракций к модельной системе обнаружено, что они влияли на интенсивность свечения аналогично соответствующим фракциям плазмы крови. Идентичность профилей элюции, полученных для плазмы крови и смеси альбумин-урат, позволяет прийти к выводу, что в случае гель-фильтрации плазмы крови первый пик соответствует выходу липопротеинов и белков, тогда как второй пик - выходу низкомолекулярных веществ.
Таким образом, гель-фильтрация плазмы крови показала, что присутствующие в ней белки и низкомолекулярные антиоксиданты влияют на параметры XXI системы НЬ-Н2С 2-люминол одинаково - уменьшают интенсивность свечения и увеличивают латентный период. Необходимо отметить, что под термином низкомолекулярные антиоксиданты в данном случае подразумеваются водорастворимые низкомолекулярные ингибиторы плазмы крови, в частности аскорбат и урат. Что касается жирорастворимых антиоксидантов, таких как витамин Е, каротиноиды и убихинолы, входящих в состав липопротеинов плазмы крови [230, 231, 410], а также билирубина, который транспортируется сывороточным альбумином [267], то, по-видимому, они будут выходить в составе первого пика элюции. Так, например, в предыдущем исследовании [162] при гель фильтрации сыворотки крови человека на геле TOYOPEAPL HW-60 было показано, что во фракциях первого пика содержалось наибольшее количество а-токоферола и холестерина - маркерных компонентов сывороточных липопротеинон
Все эксперименты, описанные выше, были проведены на плазме крови, не имеющей видимых следов гемолиза. Необходимость изучения влияния гемолизированной плазмы крови на параметры ХЛ системы НЬ-Н202-люминол была связана с тем, что в случае гемолиза эритроцитов, например, при взятии крови в плазму попадают такие внутриклеточные антиоксиданты, как СОД, ката л аза, GSH-пероксидаза и GSH. Уровень этих антиоксидантов в плазме будет зависеть от степени гемолиза и может повлиять на параметры ХЛ модельной системы. Кроме того, гемолиз эритроцитов приведет к повышению содержания НЬ в исследуемой плазме крови, что может вызвать изменение соотношения компонентов модельной системы и отразиться на результатах исследования.
Для выяснения влияния гемолиза на параметры ХЛ системы НЬ-Н?0?-люминол был проведен модельный эксперимент. К плазме крови были добавлены разные количества гемолизата эритроцитов (см. главу 2. "Материалы и методы исследования", раздел 2.2.2.). Степень гемолиза в приготовленных таким способом образцах плазмы крови определяли спектрофотометрически по разности оптических плотностей при длине волны 415 и 700 нм. Затем эти образцы вводили в систему НЬ-Н2Ог-люминол в количестве 50, 100 и 200 мкл, что эквивалентно введению 5, 10 и 20 мкл неразбавленной плазмы крови соответственно. Обнаружено (рис. 18а), что с увеличением степени гемолиза в плазме наблюдалось уменьшение интенсивности свечения. При этом, чем большее количество исследуемой плазмы крови добавлялось в модельную систему, тем при меньших значениях D415 - D70o регистрировалось полное ингибирование ХЛ. Например, при добавлении 5 мкл плазмы крови полное ингибирование ХЛ наблюдалось при D415 - D700, равной 0,66, а в случае 20 мкл эта величина составила 0,131. На рис. 186 показано изменение латентного периода ХЛ системы НЬ-Н202-люминол в зависимости от степени гемолиза в плазме крови. Из него следует, что увеличение степени гемолиза в плазме крови не влияет на величину латентного периода при добавлении в модельную систему фиксированного объема плазмы. Исключение составляет наличие сильного гемолиза, когда происходит практически полное ингибирование интенсивности ХЛ, в связи с чем определение латентного периода становится невозможным.
Влияние плазмы крови на параметры хемилюминесценции системы НЬ-Н202-люминол
Наличие АОА in vitro еще не означает, что исследуемое вещество будет проявлять указанные свойства in vivo, поскольку их проявление внутри организма также зависит от особенностей фармакокинетики конкретного вещества. Подтверждение АОА ДГК in vivo было получено с использованием экспериментальных моделей внешнего общего у-облучения мышей и тетрахлорметанового гепатита у крыс.
В случае модели внешнего общего у-облучения эксперименты проводили на мышах-самках линии BALB. Животные были разделены на три группы: 1 - интактные; 2 - контрольные, которые подвергались однократному внешнему общему у-облучению; 3 - подопытные, получавшие после облучения ДГК (см. главу 2. "Материалы и методы исследования", раздел 2.7.1.). Обнаружено, что общее радиационное воздействие на мышей в дозе 3,5 Гр вызывало активацию в их организме процесса свододнорадикального окисления липидов. Это проявлялось в повышении содержания ТБК-РП липиднои пероксидации в плазме крови и печени облученных животных по мере увеличения сроков наблюдения (рис. 47). Так, в частности, к 155 суткам уровень ТБК-РП в плазме крови и печени животных 2 группы был соответственно в 2,1 и 1,5 раза выше, чем у животных 1 группы.
Известно, что общее у-облучение сопровождается не только активацией свободнорадикальных реакций, но и усилением расходования эндогенных антиоксидантов, а также снижением активности антиоксидантных ферментов [128, 158]. В связи с этим следовало ожидать, что введение животным экзогенного антиоксиданта ДГК приведет к торможению процесса ПОЛ в организме облученных мышей. Действительно, у мышей 3 группы, получавших ДГК, содержание ТБК-РП в плазме крови в течение 70 суток с момента облучения достоверно не отличалось от такового у интактных мышей и лишь затем наблюдалось его увеличение (рис. 47а). Однако и в этом случае уровень ТБК-РП в плазме крови мышей этой группы был более низким, чем у животных 2 группы (Р 0,001). В отличие от плазмы крови, содержание ТБК-РП липиднои пероксидации в печени мышей 3 группы оставалось на уровне нормы в течение всего эксперимента (рис. 476).
Последнее, по-видимому, обусловлено тем, что печень является органом, играющим важную роль в метаболизме флавоноидов, поступающих в организм с пищей или в виде лекарственных форм [275]. Не случайно некоторые флавоноиды используются в качестве антиоксидантных и гепатопротекторных средств при лечении ряда заболеваний и токсических повреждений печени [59, 130, 148, 286]. Гепатопротекторный эффект также был обнаружен у ДГК на моделях гепатита, индуцированного с помощью подкожного введения животным тетрациклина и тетрахлорметана [93].
Аккумуляция ДГК в ткани печени может повлиять на ее способность подвергаться процессу ПОЛ, инициированному ионами Fe2+. Известно, что процесс Ре2+-индуцированого ПОЛ сопровождается развитием ХЛ [41-44, 225]. В наших экспериментах при добавлении сульфата железа к гомогенатам печени наблюдалось развитие свечения, интенсивность которого достигала максимальных значений через 15 мин после введения инициатора (рис. 48а). С увеличением количества гомогената печени, вносимого в реакционную среду, интенсивность ХЛ увеличивалась практически прямо пропорционально (рис. 486). Поскольку накопление ТБК-РП липидной пероксидации в реакционной среде за время, равное 15 мин, от количества добавленного гомогената менялось аналогичным образом (рис. 486), то правомерно с помощью регистрации ХЛ оценивать способность липидов печени подвергаться Ре2-индуцированному свободнорадикальному окислению. Эта способность зависит от соотношения в исследуемом объекте количества субстрата окисления, липидных гидропероксидов и антиоксидантов [37, 41]. В связи с тем, что количество субстрата окисления в гомогенатах печени разных животных неодинаково, в настоящей работе интенсивность ХЛ гомогената нормировали на содержание липидов в образце. Обнаружено (рис. 49), что интенсивность нормированной ХЛ гомогенатов печени животных 2 группы на 40 и 70 сутки наблюдения достоверно превышала значения этого показателя у животных 1 и 3 групп, что может быть связано, в частности, с более высоким уровнем липидных гидропероксидов в печени облученных мышей (рис. 476). В свою очередь, интенсивность нормированной ХЛ гомогенатов печени животных 3 группы к концу эксперимента (155 сутки) была соответственно в 1,3 и 1,5 раза ниже по сравнению с животными 1 и 2 групп. Не исключено, что меньшая окисляемость ткани печени животных 3 группы в присутствии ионов Fe2+ обусловлена накоплением в ней ДГК и/или продуктов его метаболизма, обладающих антиоксидантними свойствами.
Воздействие на животных внешнего общего у-облучения вызывало усиление процесса ПОЛ не только в их плазме крови и печени, но и сердце. Так, на 155 сутки с момента облучения содержание ТБК-РП липидной пероксидации в сердце мышей 2 группы было в 1,3 раза выше, чем у интактных животных (рис. 50а). Введение облученным животным ДГК в качестве антиоксидантного средства приводило к уменьшению содержания продуктов ПОЛ в их сердце по сравнению с контрольными животными. При этом содержание ТБК-РП в сердце мышей 3 группы достоверно не отличалось от его содержания у мышей 1 группы. Что касается влияния у-облучения на процесс ПОЛ в почках, то в конце эксперимента регистрируемый в них уровень ТБК-РП липидной пероксидации у животных исследуемых групп был одинаковым (рис. 506).
Сравнение АОА плазмы крови у животных всех групп проводили с помощью системы НЬ-Н202-люминол. Как видно из рис. 51, АОА плазмы крови контрольных мышей на протяжении 70 суток эксперимента достоверно не отличалась от АОА интактных мышей. В отличие от мышей 1 и 2 групп, АОА плазмы крови мышей 3 группы увеличивалась к 40 суткам эксперимента,
