Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время существенно возросло количество людей, пребывающих в состоянии стресса или постоянной психологической усталости. Большое количество жителей крупных городов нуждается в психокоррегирующей помощи. Хронический стресс, быстрая утомляемость, неуверенность, неуравновешенность оказывают существенное влияние на психоэмоциональную сферу человека и, как следствие, происходит снижение уровня профессиональной надежности. Терапия этих состояний -задача, которая требует разработки эффективных физиологически активных веществ (ФАВ), влияющих на психическую сферу. Известно, что многие пептиды, в частности, аналоги гастроинтестинального гормона холецистокинина (cholecystokinin, ССК), состоящего из 33 аминокислот (ССК-33) (Deschenes et al, 1984), при парентеральном введении обладают способностью существенно влиять на психоэмоциональный статус (Bellier et al, 2000; Beinfeld, 2003).
ССК пептиды функционируют в центральной нервной системе (ЦНС) как нейромодуляторы (Radii et al, 2003; Dufresne et al, 2006) и участвуют в регуляции поведенческих реакций, болевых ощущений, процессов памяти и обучения, оказывают влияние на состояние тревоги (Strohle et al, 2000; Hernandez-Gomez et al, 2002; Zheng et al, 2005). В связи с этим следует ожидать, что модуляция ССК системы является основой для лечения и предупреждения симптомов психотических расстройств.
Наиболее перспективным направлением при поиске средств купирования психических расстройств является конструирование аналогов эндогенных пептидов, которые характеризуются минимальной токсичностью и отсутствием побочных эффектов. В этом аспекте актуальны разработка и синтез соединений на основе нейропептидов - антагонистов минимального физиологически активного С-концевого фрагмента холецистокинина - пептида ССК-4 (Trp30-Met31-Asp32-Phe33-NH2). ССК-4 - селективный агонист (способен вызывать состояние тревоги, беспокойства и страха (Hernandez-Gomez et al, 2002)) к холецистокининовым рецепторам второго типа (ССК2 рецепторы), которые локализованы в ЦНС и вовлечены в формирование психоэмоционального состояния.
Стратегии конструирования ФАВ на основе пептидов сводятся к расшифровке аминокислотной последовательности эндогенных пептидов, обнаружении фармакологически важного короткого фрагмента, соответствующего рецептору, и выявлении биологически активной конформации пептида (Гудашева и Сколдинов, 2003). Важную роль играет определение структуры белка-рецептора, мест связывания его с лигандом, механизма его функционирования (Pommier et al, 2003). Используя разработанную (на основании соединений с известной активностью) количественную модель "структура-активность" (QSAR
Quantitative Structure-Activity Relationship), предсказывающую необходимые структурные формулы, можно добиться ограничения круга синтезируемых соединений в поиске ФАВ. В итоге по структурной формуле соединения аналога прогнозируются его агонистические или антагонистические свойства.
Таким образом, исследования, направленные на поиск новых лигандов ССК2 рецепторов - средств лечения нарушений психоэмоционального статуса, проводимые на основе изучения молекулярного механизма лиганд-рецепторного взаимодействия аналогов ССК-4 и ССК2 рецепторов, являются актуальными и направлены на решение важной научной задачи, имеющей прикладное значение.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось конструирование с помощью методов молекулярного моделирования физиологически активных аналогов тетрапептида холецистокинина (ССК-4) с антагонистической активностью для коррекции психоэмоционального статуса.
Для реализации поставленной цели в ходе исследования решались следующие задачи:
построение с помощью методов молекулярного моделирования пространственной модели взаимодействия лигандов (ССК-4 и его аналогов) с активным центром рецептора ССК2;
разработка количественной модели зависимости "структура-активность" на основании существующих аналогов пептида ССК-4 с известной активностью с целью прогнозирования перспективных структур для синтеза аналогов ССК-4 с заданной физиологической активностью (антагонистической);
разработка схемы и отработка методики синтеза N-ацилированных производных ССК-4 с обоснованными структурой и активностью;
экспериментальная оценка физиологической активности вновь разработанных аналогов ССК-4 в тестах на лабораторных животных.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые на основании проведенных теоретических и экспериментальных исследований обоснована принципиальная возможность использования молекулярного моделирования посредством оценки степени сродства ФАВ к ССК2 рецепторам для прогноза агонистических и антагонистических свойств аналогов пептида ССК-4, изменяющих психоэмоциональный статус.
Впервые с помощью методов молекулярного моделирования получена пространственная модель взаимодействия лигандов (пептида ССК-4 и его аналогов) с активным центром рецептора ССК2. При этом установлен наиболее вероятный механизм лиганд-рецепторного взаимодействия, который основан на переносе протона амидной С-концевой группы фенилаланина (Phe33) молекулы ССК-4 на амидную группу бокового радикала аспарагина (Asnn5) рецептора и перераспределении электронной плотности молекулы ССК-4 на активный центр рецептора ССК2.
С помощью разработанной модели зависимости "структура-активность" определены структуры молекул новых соединений - аналогов пептида ССК-4: C6H5-NH-C(0)-CCK-4 с прогнозируемой антагонистической и С6Н5-СН2-0-С(0)-ССК-4 с агонистической активностями. Таким образом, показана возможность ограничения круга синтезируемых соединений-претендентов, а также целенаправленного их поиска.
Разработана новая схема синтеза N-ацилированных производных пептида ССК-4, осуществлен синтез прогнозируемых соединений и проведена оценка их физико-химических свойств.
Экспериментальные исследования по оценке активностей предложенных аналогов показывают, что соединение C6H5-NH-C(0)-CCK-4 превосходит ССК-4 по антагонистической активности в 4.1 раза, соединение С6Н5-СН2-0-С(0)-ССК-4 -по агонистической активности в 3.6 раза.
Таким образом, разработана методология целенаправленного поиска и конструирования высокоактивных аналогов пептида ССК-4, позволяющая получать аналогичные по физиологической активности ФАВ других классов соединений (производные олигопептидов).
Основные положения, выносимые на защиту:
Разработанная с помощью методов молекулярного моделирования пространственная модель взаимодействия лигандов (ССК-4 и его аналогов) с активным центром рецептора ССК2 может быть использована для конструирования биологически активных аналогов пептида ССК-4.
Методами молекулярного моделирования предложен вероятный механизм лиганд-рецепторного взаимодействия, основанный на одновременном переносе протона амидной С-концевой группы фенилаланина (Phe33) молекулы ССК-4 на амидную группу бокового радикала аспарагина (Asnn5) - аминокислоты первой внеклеточной петли рецептора, и перераспределении электронной плотности (0.34 ат. ед.) с молекулы лиганда ССК-4 на активный центр рецептора ССК2, формируемый аминокислотами Pheno, ТЬгш, Asnu5 и ТЬгц9 (первой внеклеточной петли), His207 и Тгр209 (второй внеклеточной петли), ІІЄ372 и Phe374 (третьей внеклеточной петли).
На основании рассчитанных значений дескрипторов количественных зависимостей "структура-фармакологический профиль" и "структура-активность" для аналогов пептида ССК-4 синтезированы N-ацилированные производные: С6Н5-NH-C(0)-CCK-4 с антагонистической и С6Н5-СН2-0-С(0)-ССК-4 с агонистической активностями. Результаты проведенных опытов на лабораторных животных по оценке физиологической активности предложенных аналогов показывают существенное (в 4.1 раза) превосходство антагонистических свойств соединения C6H5-NH-C(0)-CCK-4 в сравнении со стандартом (ССК-4).
Разработана новая схема синтеза N-ацилированных производных ССК-4,
использующая в качестве прекурсоров промышленно производимый
подсластитель аспартам (Asp-Phe-OMe), Fmoc-Met-OPcp
(9-fluorenylmethoxycarbonyl-Met-penthachlorphenyl aether) и Fmoc-Тгр-ОРср.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены автором на 2-ой Российской школе-конференции «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине» (Саратов, 2004), международной конференции «Saratov Fall Meeting - International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine» (Saratov, Russia, 2005), всероссийской конференции с международным участием «Новые информационные технологии в медицине» (Волгоград, 2006), 1-ой международной конференции «Математическая биология и биоинформатика» (Пушино, 2006), 5-ой всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 7 статей в отечественных и зарубежных научных изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 150 страницах, иллюстрирована 33 рисунками, содержит 15 таблиц и 2 приложения. Список использованных литературных источников включает 253 наименования, в том числе 201 зарубежное.
Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики, а также в лаборатории электромагнитных полей НИИ ЕН СГУ им. Н.Г. Чернышевского. Результаты работы использованы при выполнении плановых НИР СГУ «Поиск синтетических аналогов соединений пептидной природы для модулирования психоэмоционального и когнитивного статуса» (№ госконтракта 0704 от 04.03.04) и «Разработка средств диагностики, моделирования, профилактики и коррекции психических расстройств» (№ госконтракта 17/53/2006/2 от 01.04.07), а также при выполнении гранта РФФИ (проект № 07-04-13590 ОФИ_Ц).
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю, заслуженному деятелю науки Российской Федерации доктору биологических наук, профессору В.В. Игнатову за поддержку на всех ключевых этапах выполнения работы. Автор выражает личную благодарность начальнику центральной лаборатории ООО «Саратоворгсинтез», г.н.с. СГУ доктору химических наук, профессору А.В. Шантрохе, а также в.н.с. СГУ доктору медицинских наук СИ. Баулину за плодотворное сотрудничество, руководство и ценные практические указания при проведении экспериментальных работ.
Личный вклад. Соискатель принимал непосредственное участие в теоретических и экспериментальных исследованиях, анализе полученных результатов. Доля личного участия соискателя составляет не менее 80 %.
