Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Активные формы кислорода, окислительная модификация белков и липидов, система антиоксидантной защиты в норме и при стрессе 11
1.2. Окислительная модификация липидов и белков при стрессе и патологических состояниях 25
1.3. Биологическая роль оксида азота в норме, при стрессе и адаптации 29
1.4. Использование препаратов селена для повышения резистентности и нормализации антиоксидантного статуса организма 51
2. Объекты и методы исследования 55
2.1. Объекты исследования 55
2.2. Методы исследования 56
2.2.1. Моделирование эмоционально-болевого стресса у крыс 56
2.2.2. Методы биохимических исследований 56
2.2.2.1. Определение содержания малонового диальдегида в крови 56
2.2.2.2. Определение степени окислительной модификации белков...57
2.2.2.3. Определение активности супероксидцисмутазы в крови 58
2.2.2.4. Определение активности каталазы в крови 59
2.2.2.5. Определение активности глутатионпероксидазы в крови 60
2.2.2.6. Определение активности глутатионредуктазы в крови 61
2.2.2.7. Определение преимущественной субклеточной локализации образования супероксиданиона 62
2.2.2.8. Определение стабильных метаболитов оксида азота 64
2.2.2.9. Определение S-нитрозотиолов в плазме (сыворотке) крови 65
2.2.2.10. Определение содержания молекул средней массы в плазме (сыворотке) крови 66
2.2.2.11. Статистическая обработка данных 66
3. Результаты собственных исследований 67
3.1. Пероксидное окисление липидов и белков, состояние антиок- сидантной системы и системы оксида азота при эмоционально-болевом стрессе 67
3.1.1. Критерии развития стрессового состояния при иммобилизации 68
3.1.2. Субклеточная локализация образования супероксиданиона в печени крыс при эмоционально-болевом стрессе 69
3.1.3. Пероксидное окисление липидов и белков при эмоционально-болевом стрессе 71
3.1.4. Состояние антиоксидантной системы при эмоционально-болевом стрессе 15
3.1.5. Влияние эмоционально-болевого стресса на уровень стабильных метаболитов оксида азота и S-нитрозотиолов в плазме крови 77
3.1.6. Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние антиоксидантной системы и системы оксида азота у животных 81
3.1.6.1. Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние антиоксидантной системы и системы оксида азота у интактных животных 81
3.1.6.2. Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние антиоксидантной системы и системы оксида азота при эмоционально-болевом стрессе 84
3.2. Окислительная модификация белков и система оксида азота в период постнатальной адаптации животных 92
3.2.1. Возрастная динамика окислительной модификации белков и липидов у телят в период ранней постнатальной адаптации 93
3.2.2. Оксид азота и S-нитрозотиолы в сыворотке крови у телят в период ранней постнатальной адаптации 98
3.3. Роль оксида азота в формировании колострального иммунитета у новорожденных животных 105
3.4. Оксидативный стресс, оксид азота и формирование колострального иммунитета у новорожденных телят при применении препарата Селекор.. 116
4. Обсуждение полученных результатов 127
5. Выводы 167
6. Список использованной литературы 170
- Активные формы кислорода, окислительная модификация белков и липидов, система антиоксидантной защиты в норме и при стрессе
- Биологическая роль оксида азота в норме, при стрессе и адаптации
- Определение преимущественной субклеточной локализации образования супероксиданиона
- Влияние эмоционально-болевого стресса на уровень стабильных метаболитов оксида азота и S-нитрозотиолов в плазме крови
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из критических моментов в индивидуальном развитии животных является акт рождения и ранний постнаталь-ный период. В этот период у новорожденного развитие стрессового состояния, с проявлением всех неотъемлемых его атрибутов, (Аршавский И.А., 1976; Бузлама B.C. с соавт., 1978; Boldt Т. et al., 1998; Holtzman N.A., 2004) вызывает необходимость осуществления специфических адаптивных реакций, связанных с кардинальными изменениями условий существования индивидуума. Это, прежде всего, связано с существенными различиями в метаболизме плода и новорожденного, обусловленными как различным характером и типом поступления в организм и использования питательных веществ, так и значительными отличиями в их кислородных режимах (Хочачка П., СомероДж., 1988).
Кардинальная перестройка кислородного режима организма вследствие перехода ко внеутробному существованию сопровождается изменением баланса между про- и антиоксидантными процессами из-за усиления образования активных форм кислорода, что является причиной развития у новорожденных животных уже в первые часы жизни явлений оксидативного стресса (Dani С. et al., 2004; Martin I. et al., 2004; Comporti M. et al., 2004), в то время как антиоксидантная система новорожденного еще не полностью сформирована (Рецкий М.И. с соавт, 2004; Бурмистров СО. с соавт, 1997). Перечисленные явления могут выступать в качестве одной из причин снижения общей и иммунной резистентности, развитию патологических состояний у животных (Рецкий М.И, 1997; Зенков Н.К. с соавт, 2001; Saugstad O.D., 2001),
В последние годы важное значение в осуществлении адаптивных реакций организма придается универсальному клеточному мессенжеру - оксиду азота (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998; Проскуряков С.Я. с соавт., 2000; MacMicking J.D. et al.» 1997).
В настоящее время постулируется существование у животных так называемых стресс-лимитирующих систем, которые способны регулировать ак-
тивность стресс-системы и ограничивать чрезмерную стресс-реакцию на центральном (ГАМК-ергическая и опиоидергическая системы) и периферическом (системы простагландинов, система аденозина и система опиоидных пептидов и других соединений в самих органах и периферических нейроэн-докринных структурах) уровнях регуляции (Меерсон Ф.З., 1989).
Важную роль в ограничении повреждений при стрессе играет также относящаяся к локальным стресс-лимитирующим системам антиоксидантная система, а в последнее время появились экспериментальные и теоретические данные, позволяющие причислить к стресс-лимитирующим системам также систему генерации оксида азота (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998; Ма-нухина Е.Б., 2000), являющегося универсальным нейротрансмиттером, регулятором функций сердечно-сосудистой, пищеварительной, респираторной, мочеполовой, иммунной, репродуктивной систем организма (Moncada S. et al., 1991).
В настоящее время эффекты и механизмы взаимодействия этих двух стресс-лимитирующих систем остаются предметом активного изучения (Hogg N., Kalyanaraman В., 1999; Laskin J.D., et. al., 2001; Серая И.П., Нарциссов Я.Р., 2002; Близнецова Г.Н., 2005). В ряде работ было продемонстрировано, что NO" может фактически замедлять пероксидное окисление липидов (ПОЛ), действуя как скавенджер кислородных радикалов. Этот своеобразный «антиоксидант-ный» эффект NO* позволил некоторым исследователям предположить, что взаимодействие между супероксиданионом и NO" может быть биологически важным путем детоксикации потенциально опасных активных форм кислорода. В то же время есть и противоположные данные, свидетельствующие о том, что оксид азота способен усиливать эффекты супероксидного радикала и других активных форм кислорода (Groves J.T., 1999).
Однако в вышеперечисленных аспектах биологической роли оксида азота и его соединений еще остается достаточное количество темных пятен, а проблемы биологической роли NO* в постнатальной адаптации животных, в частности, его образования, резерва, переноса и форм депонирования на данный момент остаются практически не исследованными.
Основываясь на современных данных можно предположить, что одной из основных причин возникновения патологии у новорожденных животных, ведущих к снижению иммунной резистентности и развитию заболеваний молодняка при переходе к внеутробному развитию, является нарушение процесса становления и последующего согласованного взаимодействия антиоксидантнои и NO-эргической стресс-лимитирующих систем, обеспечивающих поддержание адекватного метаболического статуса в организме в критические периоды его развития, к числу которых относится ранний постнатальный онтогенез.
Знание механизмов и эффектов взаимодействия систем антиоксидантнои защиты и системы оксида азота, имеющее важное значение для понимания их роли в переходе стресса из необходимого звена адаптации в неспецифический механизм патогенеза заболеваний, может стать основой для разработки и использования методов, направленных на регуляцию этих взаимодействий в организме, что может оказаться весьма эффективным способом предупреждения и лечения многих заболеваний, связанных с изменением продукции NO* и нарушением антиоксидантного статуса организма.
Все вышеизложенное и определило общую направленность работы, выбор методических подходов и экспериментальных моделей.
Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования явилось изучение явлений оксидативного стресса, системы оксида азота и их взаимосвязи в условиях экспериментального и физиологически обусловленного стресса при ранней постнатальной адаптации и роли этих процессов в формировании колострального иммунитета у новорожденных телят, а также при применении им органического селенсодержащего препарата Селекор.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- изучить интенсивность процессов пероксидного окисления липидов и
белков, состояние антиоксидантнои системы и системы оксида азота в усло
виях эмоционально-болевого стресса у лабораторных животных;
— выяснить характер влияния модуляции синтеза оксида азота на про
цессы пероксидного окисления липидов и белков, образования оксида азота и
состояние антиоксидантнои системы у интактных животных и у животных в условиях эмоционально-болевого стресса;
оценить степень окислительной модификации белков и липидов, интенсивность образования оксида азота и S-нитрозотиолов и их влияние на формирование колострального иммунитета у новорожденных животных;
провести изучение влияния селенсодержащего препарата Селекор на интенсивность окислителыгой модификации белков и липидов, систему оксида азота и становление колострального иммунитета у новорожденных телят.
Научная новизна. Впервые комплексно и одновременно у одних и тех же животных в условиях эмоционально-болевого стресса изучены интенсивность процессов пероксидного окисления липидов и белков, субклеточная локализация и уровень генерации супероксиданион-радикала, состояние ферментативного звена антиоксидантнои системы и некоторые компоненты системы оксида азота. Оценено влияние индукции и ингибирования синтеза оксида азота на динамику образования супероксиданиона в митохондриальной и микросомальной электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) клеток печени, интенсивность пероксидного окисления липидов в крови и окислительной модификации плазменных белков, а также характер реакции антиоксидантнои системы при стрессе. Впервые показана роль и значение оксида азота, а также окислительной модификации липидов и белков в формировании колострального иммунитета у новорожденных телят в период ранней постнатальной адаптации. Показано, что применение органического селенсодержащего препарата Селекор новорожденным телятам уменьшает степень окислительной модификации белков, способствует повышению мощности стресс-лимитирующей системы оксида азота и формированию более высокого уровня колострального иммунитета у новорожденных телят.
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволяют углубить и систематизировать современные представления о значении окислительной модификации белков и липидов, взаимоотношений
9 антиоксидантной системы и системы оксида азота в регуляции стресс-реакции организма.
При проведении научно-исследовательских работ по проблемам, связанным с изучением системы L-аргинин - N0", могут быть использованы Методические рекомендации по определению содержания в плазме (сыворотке) крови S-нитрозотиолов, а при изучении феномена оксидативного стресса - Методические рекомендации по определению степени окислительной модификации белков плазмы (сыворотки) крови, которые рассмотрены, одобрены и рекомендованы к опубликованию Бюро Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 06.10.2004).
Результаты экспериментального исследования влияния органического селенсодержащего препарата Селекор на процессы пероксидного окисления белков и липидов, систему оксида азота и формирование колострального иммунитета могут быть использованы при создании и разработке средств фармакологической коррекции метаболических сдвигов при профилактике не-онатальных заболеваний у новорожденных телят.
Кроме того, результаты исследований вошли в Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике нарушений обмена веществ у продуктивных животных, которые рассмотрены, одобрены и рекомендованы к изданию секцией «Патология, фармакология и терапия» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № 2 от 8 июля 2005 г.), а также в Методические рекомендации по оценке и коррекции иммунного статуса животных, рассмотренные, одобренные и рекомендованные к изданию секцией «Патология, фармакология и терапия» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (№ 3 от 21.10.2005).
Апробация работы. Основные результаты исследований, выполненных в период 2002-2005 г.г. были представлены на научных сессиях Воронежского госуниверситета (2003-2005 г.г.); Международной конференции «Свободные радикалы, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003); VII и VIII Пущинской конференции молодых учёных «Биология-наука 21-го века» (Пущино, 2003 и 2004 г.г.); Международной
10 научно-практической конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004); XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004).
Публикации. Результаты работы изложены в 9 статьях и 3 тезисах докладов.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Экспериментальный эмоционально-болевой стресс у животных
сопровождается интенсификацией образования в организме супероксиданиона,
процессов пероксидной модификации белков и липидов, генерации оксида
азота и консолидированной адаптивной реакцией антиоксидантнои системы.
Модуляция интенсивности образования в организме оксида азота изменяет характер течения процессов пероксидного окисления белков и липидов, состояние антиоксидантнои системы, как в норме, так и в условиях экспериментального стресса.
Новорожденные телята характеризуются необычайно высоким конститутивным уровнем оксида азота, формируемым в период антенатального развития, который является одним из факторов, способствующим формированию у них колострального иммунитета.
Введение органического селенсодержащего препарата Селекор оказывает нормализующее влияние на интенсивность процессов окислительной модификации белков, способствует поддержанию на более высоком уровне компонентов системы оксида азота, что способствует формированию более высокого колострального иммунитета у новорожденных телят за счет увеличения периода пассивного всасывания молозивных иммуноглобулинов.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 206 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список использованной литературы содержит 387 источника, из них 126 отечественных и 261 иностранных. Иллюстративный материал включает 28 рисунков и 21 таблицу.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Активные формы кислорода, окислительная модификация белков и липидов, система антиоксидантной защиты в норме и при стрессе
Необходимым звеном жизнедеятельности любой клетки являются процессы свободнорадикального окисления (СРО). Они лежат в основе обновления и перестройки биологических мембран, регуляции их состава, проницаемости и активности мембранносвязанных ферментов (Владимиров Ю.А., 1987). Это процесс, обеспечивающий в организме фаго- и пиноцитоз, синтез простагландинов, лейкотриенов, холестерина, прогестерона (Воскресенский О.Н., Левицкий А.П., 1970).
Свободнорадикальному окислению подвержены все без исключения соединения, однако до настоящего времени наиболее чувствительными к СРО считались липиды: в первую очередь, ненасыщенные жирные кислоты (НЖК), как свободные, так и в составе фосфолипидов (ФЛ) (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972).
Инициируют СРО так называемые активные формы кислорода (АФК) или активированные метаболиты кислорода (АМК) (Зенков НДС. с соавт., 2001). Так как они содержат неспаренные электроны, то отличаются чрезвычайно высокой реакционной способностью, несмотря на короткий период жизни (табл. 1). Эти высокореакционные, радикальные, кислородные соединения, образуются в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода.
Присоединение одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии приводит к образованию супероксидного анион-радикала (Ог ). Так как анион 02? имеет заряд, он плохо мигрирует через мембраны. Данный радикал является более реакционным соединением, чем кислород; время его жизни в биологических субстратах около 10 6 с (Podczacy J.J., Wei R., 1988).
В клетках 02z является промежуточным продуктом многих биохимических реакций - таких, как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехола-минов, метаболизм ксенобиотиков (DiMascio P. et al., 1997). Однако основные источники его образования - ферментативные системы: НАДФН-оксидаза фагоцитирующих клеток, ксантиноксидаза, митохонд-риальная цитохром-с-оксидаза и микросомальные монооксигеназы. 02" - малоактивный радикал и не влияет на функционирование большинства ферментов, хотя и может инактивировать некоторые из них: Са2+ АТФазу, каталазу, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу, папаин и другие (Suzuki Y.J., Ford G.D., 1991). Будучи нуклеофильным соединением 02 окисляет липопротеи-ны сыворотки и фосфолипиды мембран (Boes М. et al., 1989), что приводит к разрушению эритроцитов (Weiss S.R., 1980), выходу лизосомальных ферментов и образованию цитотоксинов (Kalra J. et al., 1990).
Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона к аниону 02 сопровождается образованием двухзарядного аниона 022 . В свободном состоянии такой анион не существует, так как энергия связывания атомов кислорода становится отрицательной (Метелица Д.Н., 1982). Присоединяя протоны, он переходит в гидроперекисный радикал Н02 или Н202, при этом в физиологических условиях преобладает Н202. Перекись водорода относят к окислителям средней силы, при этом, не будучи радикалом, она взаимодействует с веществами как радикальным, так и нерадикальным путем. В живых организмах источником перекиси водорода служат ферментативные реакции с оксидазами, переносящими два электрона на молекулу кислорода: ксантиноксидаза, оксидазы L-аминокислот и ряд других, а так же в реакциях дисмутации, катализируемых супероксиддисмутазой (СОД) (Sohal R.S. et al, 1990).
Механизмы цитотоксического действия Н202 довольно разнообразны. Так in vitro в концентрациях 0,1-2,5 мМ перекись водорода вызывает одноните-вые разрывы ДНК. При действии Н202 в клетках наблюдается снижение интенсивности гликолиза в результате активации альдегиддегидрогеназы и уменьшения содержания лактата; индукция процессов ПОЛ приводит к изменению физических свойств цитоплазматических мембран (Block Е., 1991), в результате чего ингибируется трансмембранный перенос анионов, но увеличивается проницаемость для макромолекул (Wilson J. et al., 1990); возрастает внутриклеточ-ная концентрация Са , что приводит к активации фосфолипаз и фосфоинози-тидного обмена (Музыкантов В.Р. с соавт., 1992); наблюдается истощение пула АТФ, что сопровождается гибелью клеток (Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996).
Цитотоксическое действие Н2О2 in vivo может реализовываться через инактивацию ингибитора протеиназ (Weiss S.J., 1991). При действии перекиси водорода наблюдается инактивация ферментативных антиоксидантов ка-талазы и глутатионпероксидазы (ГПО) (Pigeolet Е. et al., 1990). Помимо этого Н2О2 вызывает деградацию гемовых белков, что, в частности приводит высвобождению ионов железа из гемоглобина и миогемоглобина (Якутова Э.Ш. с соавт., 1992). Это в свою очередь усиливает цитотоксическое действие самой перекиси, которое возрастает в 10-1000 раз (Eaton J.W., 1991). Перекись водорода является источником возникновения гидроксильного радикала.
Гидроксильный радикал (ОН") является наиболее реакционноспособ-ной АФК, с его образованием связывается цитотоксическое и мутагенное действие АКМ в условиях окислительного стресса. ОН"-радикал может разрывать любую С-Н или С-С- связь (Vanasbeck B.S., 1991). Образование ОН показано в реакциях окисления арахидоновой кислоты (Cheung К. et al., 1984), при микросомальном окислении (Сидорик Е.П. с соавт., 1989), в реакциях с флавиновыми ферментами (Shi X., Dalai N.S., 1991), убихиноном (Nohl Н., 1990) и пероксинитритом (Zhu L. et al., 1992). Однако основным источником ОН -радикала в большинстве биологических систем служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности (Fe2+, Cu+, Со2+, Мп2+, V2+, Сг4+) (Владимиров Ю.А. с соавт., 1991) главным образом Fe2+ и Си+.
Биологическая роль оксида азота в норме, при стрессе и адаптации
Помимо активных форм кислорода в последние годы исследователями все больше внимание уделяется и активным формам азота (reactive nitrogen species - RNS) и, в частности оксиду азота (N0 ) и проблема N0" является одной из ключевых проблем современной биологии и медицины, которая привлекает внимание исследователей самых различных специальностей.
В результате интенсивных исследований в настоящее время N0 признан в качестве универсального медиатора (трансмиттера), образуемого различными типами клеток, который обладает разнообразными и сложными функциями в различных органах и тканях (Moncada S., Higgs А., 1993).
Термином «оксид азота» обозначается восстановленная форма моноокиси азота (NO") (Moncada S. et al., 1991). Оксид азота по своей химической природе относится к двух атомным нейтральным молекулам. Молекулы оксида азота легко диффундируют в биологических средах; среднее время жизни в биологических тканях 5,6 с (Тій в почечной ткани крыс - 6,41 с (Меньщикова Е.Б с соавт., 2000), в миокарде - 0,1 с (Morin С. et al., 1994), в крови-0,05-0,18 с (Серая И.П., Нарциссов Я.Р., 2002).
Наличие одного электрона с неспаренным спином придает NO" высокую реакционную способность. Взаимодействуя с другими свободными радикалами, молекула NO способна образовывать ковалентные связи. Известно, что NO" образует стабильные комплексы с гемоглобином (Бусыгина О.Г. с соавт., 2000), сывороточным альбумином (Ванин А.Ф., 2001), а так же с негемовыми железо-серными белками (Винк Д.А. с соавт., 1998). Вместе с тем высокая эффективность взаимодействия NO с гемоглобином in vivo приводит к пространственной локализации биологических эффектов NO" на определенных участках сосудов (Бусыгина О.Г. с соавт., 2000). Кроме того, показано, что нитрозосое-динения оксигемоглобина (Gow A.J. et al., 1999), миоглобина (Flogel U. et al., 2001) и различных тиолов (Butler A.R., Rhodes R, 1997) могут являться своеобразным депо и сохранять NO" в биологически активном состоянии. При определенных условиях оксид азота высвобождается из них, посредством чего диапазон и длительность его функций в организме увеличивается.
Свободнорадикальная природа NO позволяет ему, как активировать цепные свободнорадикальные реакции, так и ингибировать их (Laskin J.D. et al., 2001). Кроме того, оксид азота способен вступать в окислительно-восстановительные превращения, образуя многочисленные азотсодержащие соединения, в которых валентность атома азота может изменяться от -3 до +6.
Образование оксида азота в организме человека и животных происходит при ферментативном окислении L-аргинина (Wink D.A., Mitchell J.B., 1998). Синтез NO" осуществляется семейством цитохром-Р-450-подобных гемпротеинов - NO-синтаз (КФ 1.14.13.39). Молекулы NO-синтаз содержат домены с редуктазной и оксигеназной активностью. По характеру индукции и действия ферменты разделяются на два вида: 1) наиболее мощная кальций-независимая, индуцибильно экспрессиру-емая цитокинами NO-синтаза (П-типа). Обнаружена в макрофагах, гепатоци-тах, фибробластах, миоцитах, ее активность так же выявляется в различных клеточных культурах и тканях (Mayer В. et al., 1991). При активации синтеза фермента образование NO возрастает в десятки раз, а максимальных значений достигает через часы (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998). Индуцибельная NO-синтаза (П-тип) представляет собой гомодимер с молекулярной массой 130 кДа (Porsti L, Paakkari I., 1995). Константа Миха-элиса Кт составляет 3-32 мкМ, а максимальная скорость окисления L-аргинина и образования N0 может достигать 1600 нМ/мин на 1 мг. Этот фермент преимущественно находится в растворимой форме и, в противоположность конститутивным ферментам, менее зависим от ионов Са2+ или кальмодулина. Однако индуцибельная NO-синтаза, так же как и конститутивная, содержит кальмодулинсвязывающий участок. Имеются данные о том, что относительная независимость этого фермента от кальмодулина обусловлена тем, что кальмодулин прочно связан с этим типом NO-синтазы. В последние годы было установлено, что индуцибельная форма содержится не только в макрофагах, но и в некоторых глиальных клетках, например микро-глии мозга (Vanin A.F, et al., 1992; Lopez-Belmonte et al., 1993). 2) менее мощные, постоянно присутствующие в клетках тканей кальций- и кальмодулин-зависимые ферменты - конститутивные NO-синтазы. Они подразделяются на нейрональную (1-тип) и эндотелиальную (Ш-тип) изоферменты, которые обнаружены в эндотелиоцитах, нейронах, тромбоцитах, нейтрофилах и других клетках (Ванин А.Ф., 1998; Сосунов А.А., 2000). Конститутивные NO-синтазы, выделяемые из клеток разных типов, во многом сходны между собой, но сильно отличаются от индуцибельного изо-фермента. Показано, что ингибиторы NO-синтаз обладают различной эффективностью в отношении разных изоферментов: так NG-HHTpo-L-aprHHHH в 300 раз более интенсивно ингибирует NO-синтазу мозга быка, чем NO-синтазу мышиных макрофагов (Furfine E.S. et al., 1993). Глюкокортикоиды супрессируют индуцибельную NO-синтазу, но не влияют на активность конститутивных изоферментов (Forstermann U. et al., 1994). Нейрональная NO-синтаза представляет собой растворимый гомодимер с молекулярной массой около 150 КДа. В ее состав входят по 1 моль ФАД, ФМН, тетрагидробиопте-рина, каждая молекула содержит кальмодулин-связывающий центр, осуществ-ляющий Са -зависимую регуляцию синтеза NO, и атом железа, входящий в состав гемовой простетической группы (McMillan К. et al., 1992). Показана ее существенная гомологичность цитохром-Р-450-редуктазе (Hevel J.M. et al., 1992) и наличие НАДФН-диафоразной активности (Dawson Т.М. et al., 1991). Считается, что последняя может быть использована в качестве маркера для конститутивных N0-синтаз (Loesch A. et al., 1991). Максимальная активность фермента (окисление L-аргинина 300 нМ/мг в мин) наблюдается при концентрации ионов Са2+ 0,4 мкМ. Эндотелиальная NO-синтаза несколько отличается от нейронального изофермента и представляет собой миристоилированный нерастворимый фермент с молекулярной массой около 135 кДа (Furfine E.S. et al., 1993). В растворимой форме фермент обладает более низкой активностью (Sakoda Т. et al., 1995). Хотя принцип регуляции активности конститутивных NO-синтаз схож, максимальная скорость окисления L-аргинина эндотелиальным изо-ферментом не превышает 15нМ/мг в мин. N0", продуцируемый под влиянием конститутивных изоферментов, при некоторых формах патологии, наряду с регуляторным, оказывает и про-тективное действие. Все три типа синтаз в качестве кофакторов используют НАДФН, ФАД, ФМН и, возможно, тетрагидробиоптерин (Knowles R.G., Moncada S., 1994). Синтез NO" является регулируемым процессом и может тормозиться различными аналогами L-аргинина, которые являются конкурентными ингибиторами NO-синтазы. При этом №о-циклоспорил-Ь-аргинин является селективным ингибитором конститутивных изоферментов NO-синтазы, в то время как аминогуанидин - индуцибельного изофермента NO-синтазы (Невзорова В.А. с соавт., 1997). Некоторые другие аналоги L-аргинина, такие как N-MOHOMeran-L-aprHHHH (L-NMMA), N-HHTpo-L-аргинина метиловый эфир (L-NAME), N-HHTpo-L-аргинин (L-NNA) способны тормозить выработку NO обоими типами изоферментов (Rees D.D. et al., 1990). Синтез NO" может также замедляться или прекращаться под влиянием гемопротеинов, метиленового голубого, супероксидных радикалов, этанола, глюкокортикостероидов, индометацина (Невзорова В.А. с соавт., 1997).
Определение преимущественной субклеточной локализации образования супероксиданиона
Потенциальную преимущественную генерации супероксиданиона в субклеточных фракциях определяли модифицированным методом с использованием нитросинего тетразолия (НСТ) (Близнецова Г.Н., 2004). Нитроси-ний тетразолий, вступая в реакцию с супероксиданионом, превращается в формазан, имеющий максимум поглощения в смеси хлороформ-диметилсульфоксид в пределах 515-565 нм (Metcalf J.A., 1986).
В качестве селективного индуктора генерации супероксиданиона в ми-тохондриальной ЭТЦ использовался НАДН, а в микросомальной ЭТЦ -НАДФН (Бабина О А. с соавт., 1999). Метод позволяет оценить спонтанную продукцию супероксиданион радикала, преимущественный уровень его генерации в митохондриальнои ЭТЦ, и микросомальной ЭТЦ. 0,3 г печени гомогенизируют в 2,7 мл 0,03 М фосфатного буфера рН 7,4. По 0,05 мл гомогената помещают в 3 пробирки («А», «Б» и «В»). В пробу «А» добавляют 0,05 мл фосфатного буфера раствора (рН 7,4) для определения спонтанной генерации супероксиданиона. В пробу «Б» — 0,05 мл 0,3% раствора НАДФН для определения преимущественной продукции супероксиданиона в микросомальной ЭТЦ. В пробу «В» - 0,05 мл раствора 0,3 % НАДН - для определения преимущественной генерации супероксиданиона в митохондриальнои ЭТЦ. Содержимое пробирок А, Б и В перемешивали и преинкубировали при 37 С0 в течение 30 мин для пробирки А, 10 мин для пробирок Б и В. Затем добавляли по 0.05 мл 0,2% раствора НСТ в каждую пробирку, перемешивали и инкубировали при 37 градусах С в течение 30 мин для пробирки А, 5 мин для пробирок Б и В. Для элюирования окраски использовали диметилсульфоксид-хлороформ (при объемном соотношении 2:1). В каждую пробу приливали 2,0 мл растворителя и взбалтывали 1 мин. Затем центрифугировали пробы 10 мин при 3000об/мин. Отбирали окрашенный супернатант и фотометрировали при длине волны 540 нм на спек-троколориметре Specol 210. В качестве контроля использовали: 1) для спонтанной генерации (проба А) - 0,05 мл буфера + 0,05 мл воды + 0,05 мл НСТ + 0,05 мл воды, 2) для определения генерации супероксиданиона микросомальной ЭТЦ и NO-синтазой (проба Б) - 0,05 мл буфера + 0,05 мл воды + 0,05 мл НСТ + 0,05 мл НАДФН, 3) для определения генерации супероксиданиона ЭТЦ митохондрий (пробирка В) - 0,05 мл буфера + 0,05 мл воды + 0,05 мл НСТ + 0,05 мл НАДН. Контрольные пробы инкубировали так же 10 и 30 мин, соответственно, при 37 градусах С0 и элюировали окраску тем же растворителем, имеющем тоже объемном отношение. Приготовление проб-сравнения основано на том, что сами НАДФН и НАДН не восстанавливают НСТ. Для построения калибровочной кривой 0,2 г НСТ растворяют в 100 мл трис-буфера рН 7,4, В пробирки отмеряют 0,01; 0,02; 0,05; 0,07; ОД и 0,2 мл 0,2% раствора НСТ, добавляют по ОД мл 0ДН КОН и по ОД мл 10 мМ раствора аскорбиновой кислоты, перемешивают и инкубируют 10 минут при 37С. Затем добавляют по 2 мл элюирующей смеси и определяют оптическую плотность проб при 540 нм. По калибровочному графику находят количество супероксиданиона в нМоль Ог1, содержащегося в пробе. Расчет производят по формуле: ИПС (нМоль Ог /гхсек) = Ах К, где ИПС - интенсивность продукции супероксиданиона; А - величина продукции 02" в нМоль, найденная по калибровочному графику; К - коэффициент пересчета на грамм в сек с учетом навески и времени инкубации. Для пробы «А» К=11Д1, а для проб «Б» и «В» К=66,67. 2.2.2.8. Определение стабильных метаболитов оксида азота Для определения стабильных метаболитов оксида азота использовался, разработанный Близнецовой Г.Н с соавторами спектро фотометрический метод, сочетающий восстановление нитрата и последующее определение образовавшегося нитрита с помощью реактива Грисса (Близнецова Г.Н. с соавт, 2002). Восстановление нитрата до нитрита достигается использованием хлорида ванадия (III) (Miranda К.М. et. al., 2001). Сумму NOx определяли в сыворотке (плазме) крови, стабилизированной ЭДТА-Каг. При необходимости до проведения анализа сыворотку замораживали и хранили при температуре -20 С. Образцы сыворотки (плазмы) депротеинизировали путем добавления к 0,5 мл плазмы 1,0 мл смеси метанол-диэтиловый эфир (3:1) с последующим центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 минут. К 200 мкл супернатанта добавляли 200 мкл насыщенного раствора VCI3, а затем последовательно компоненты реактива Грисса: 100 мкл 2,0 % раствора сульфаниламида и 100 мкл 0,1 % раствора Ы-1-(нафтил)-этилен-диамина в 5% Н3Р04- Пробы помещали на водяную баню на 30 минут при температуре 37 С. Оптическую плотность образцов измеряли при 540 нм после их охлаждения до комнатной температуры. Для каждого измерения проводили определение фоновых значений оптической плотности, которые затем вычитали при расчете концентрации NOx. Для построения калибровочного графика использовали соответствующие растворы NaN03 (осч) в бидистиллированной воде, которые готовили путем последовательного разведения основного раствора, содержащего 200 мкМ N03Aii. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из воды и смеси для депротеинизации. Метод основан на спектрофотометрическом измерении нитрита, присутствующего в образце до и после добавления Hg +, которая, действуя как специфический разрушитель S-N связи, катализирует высвобождение из S-нитрозированных тиолов оксида азота, который, окисляясь до Nd определяется с помощью реактива Грисса при 540 нм (Kubes P. et al., 1999; Moore К.Р. et al., 2002).
К 0,5 мл исследуемого образца добавляют 0,5 мл 0,2% HgCl2 в 1% растворе сульфаниламида (опыт). К 0,5 мл плазмы добавляют 0,5 мл 1% раствора сульфаниламида в 0,5 М НС1 (контроль). Обе пробы инкубируются в темноте при 37С 10 мин. Затем в обе пробы добавляют по 0,5 мл 0,2% раствора Ы-(1-нафтил)-этилендиамин. После этого пробы инкубируют в течение 10 минут при 37С в темноте. Далее образцы центрифугируют при 10.000g 10 минут для удаления осадка (при необходимости). Производят определение оптической плотности обоих образцов при 540 нм.
Влияние эмоционально-болевого стресса на уровень стабильных метаболитов оксида азота и S-нитрозотиолов в плазме крови
В настоящее время в литературе сложилось представление об NO как о новом, очень важном регуляторе физиологических функций организма и метаболизма клеток. Существуют данные, свидетельствующие о важной роли N0" в стрессорных и адаптивных ответах организма (Малышев И.Ю., Ману-хинаЕ.Б., 1998).
Считается, что оксид азота может поддерживать или замедлять перок-сидное окисление липидов, являясь мощным ингибитором цепных реакций свободнорадикального окисления, взаимодействую с пероксильными липид-ными радикалами (Wink D.A. et al., 2001). Оксид азота также может тормозить образование многих потенциальных инициаторов липидной пероксида-ции, снижая активность ферментов типа ксантиоксидазы, липооксигеназы, циклооксигеназы и других, взаимодействуя с Fe2+, находящимся в их активном центре (HoggN., Kalyanaraman В., 1999).
Учитывая это, нами изучена динамика суммарного содержания стабильных метаболитов оксида азота (N02 +N03 ) в плазме крови крыс при различной длительности эмоционально-болевого стресса.
Исследования проведено на трёх группах животных: 1-я- интактные (п=24), 2-я (опытная) - иммобилизация в течение 6 часов (п=12), 3-я опытная - иммобилизация в течение 18 часов (п=12). Исследования плазмы крови проводили сразу после окончания иммобилизации.
Как показали проведенные исследования, эмоционально-болевое воздействие вызывает резкое увеличение образования оксида азота в организме (табл. 6). После 6-часовой иммобилизации сумма стабильных метаболитов оксида азота (NOx) в плазме опытных животных превышает уровень у ин-тактных крыс более, чем в семь раз. Стрессорное воздействие большей продолжительности (18 часов) не приводило к дальнейшему увеличению в плазме концентрации NOx.
Такое увеличение NOx свидетельствует о повышении интенсивности образования оксида азота вследствие активации NO-ергической системы, которая играет важную роль в стрессорных и адаптивных ответах организма, являясь универсальным регулятором физиологических функций и метаболизма клеток.
Следует отметить наличие достаточно выраженной прямой зависимости между уровнем стабильных метаболитов оксида азота (табл. 6) и НАДФН-стимулируемой продукцией 021 в печени (табл. 3) при развитии эмоционально-болевого стресса.
Это подтверждается статистически достоверным коэффициентом корреляции между данными показателями, который составил + 0,642 (Р 0,05), что является одним из косвенных доказательств, того, что определение НАДФН-стимулированной продукции супероксиданиона дает представление и об активности НАДФН-диафоразы, локализованной в цитоплазме, а по активности последней можно, в какой-то мере, судить об активности NO-синтазы, колока-лизованной в печени с НАДФН-диафоразой (Koziel Е. et. al., 2000).
Таким образом, независимо от длительности стрессорного воздействия концентрация суммы стабильных метаболитов оксида азота значительно превышала уровень у контрольных животных, что связано, вероятно, с важной ролью NO-зависимой регуляции в осуществлении компенсаторно-приспособительных реакций при стрессе. Это соответствует современным представлениям об активация NO-зависимых механизмов локальной зашиты на стадии мобилизации при адекватной стресс-реакции (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998).
Ключевая роль NO-ергической системы в защитно-приспособительных реакциях организма при экстремальных воздействиях предполагает, что оксид азота должен обладать способностью к диффузии в биологических средах в течение достаточно длительного промежутка времени. Скорость диффузии оксид азота в биологических системах составляет ЗОцмхсек"1 (Серая И.П., Нарциссов Я.Р., 2002), т.е. площадь возможного его действия ограничена всего лишь несколькими микронами от места образования. Помимо это 80
го молекула NO" обладает высокой реакционной способность, что так же сокращает среднее время ее жизни. Разнообразная функциональная активность NO" предполагает наличие своеобразных переносчиков, способных потенцировать его биологические эффекты.
По современным представлениям, в качестве таких соединений выступают S-нитрозотиолы (RSNO), в которых N0" ковалентно связан с SH-группами белков и низкомолекулярными тиолами, например, глутатионом (Stamler J.S. et al., 1992).
Установлено, что параллельно с изменением продукции оксида азота при эмоционально-болевом стрессе происходит и изменение содержания в плазме крови S-нитрозотиолов.
Как видно из представленных данных (табл. 6), максимальное накопление RSNO происходит через 18 часов стрессорного воздействия, и их уровень в это время составляет 171% от контрольного, тогда как при 6- часовом воздействии их уровень незначительно превышает контрольный. Это, вероятно, связано с необходимостью использовать практически весь образуемый и депонированный N0 на нужды процессов адаптации организма и ограничения повреждающих эффектов стресса. Более длительное экстремальное воздействие связано с биологической целесообразностью депонирования NO", как одного из механизмов включения защитно-приспособительных реакций организма при длительном нахождении животного в экстремальной ситуации. Не исключено, что подобное явление имеет и негативное значение, так как оксид азота при его гиперпродукции может быть вовлечен в механизмы специфического повреждения.
Установлено наличие достаточно высокой положительной корреляции (г=+0,57) между содержанием N0 и уровнем S-нитрозотиолов в плазме крови в динамике развития стресса.
Таким образом, можно высказать предположение, что при действии экзогенных экстремальных факторов взаимодействие систем генерации и стабилизации (депонирования) NO" обеспечивает возможность для быстрой, но, вероятно, достаточно кратковременной генерации NO", обеспечивающей эффективность адаптивных реакций организма.
