Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о роли оксида азота в регуляции апоптоза (обзор литературы) 12
1.1. Образование оксида азота и внутриклеточные эффекты оксида азота 13
1.1.1. Физико-химические свойства молекулы оксида азота 13
1.1.2. NO-синтазы - ферменты синтеза оксида азота 14
1.1.3. Механизмы накопления молекулы оксида азота в клетке 16
1.1.4. Молекулярные механизмы реализации эффектов оксида азота 17
1.1.5. Механизмы утилизации молекулы оксида азота 22
1.2. Современные представления о молекулярных механизмах апоптоза 23
1.2.1. Роль белков семейства Вс1-2 в регуляции апоптоза... 25
1.3. Молекулярные основы взаимодействия окислительного стресса и апоптоза 27
1.3.1. Влияние оксида азота на молекулярные механизмы реализации апоптоза 30
1.4. Роль апоптоза нейтрофилов в реализации воспаления: молекулярные механизмы в дизрегуляции программированной гибели эффекторных клеток 33
Заключение 45
Глава 2. Материал и методы исследования 47
2.1. Материал исследования 47
2.1.1. Экспериментальный блок исследования 48
2.1.2 Клинический блок исследования 49
2.2. Методы исследования 51
2.2.1. Выделение нейтрофилов крови 53
2.2.2. Культивирование нейтрофильных лейкоцитов крови 53
2.2.3. Метод индукции наработки оксида азота в нейтрофилах крови 54
2.2.4. Метод ингибирования продукции оксида азота в нейтрофилах крови 55
2.2.5. Оценка реализации апоптоза нейтрофилов крови методом проточной лазерной цитометри и 55
2.2.6. Оценка концентрации активных форм кислорода в нейтрофилах крови 57
2.2.7. Определение концентрации ионов кальция в цитоплазме нейтрофилов крови 58
2.2.8. Оценка продукции оксида азота нейтрофилами венозной крови 58
2.2.9. Определение содержания циклических нуклеотидов цАМФ и цГМФ в нейтрофилах венозной крови. 59
2.2.10. Оценка уровня белков-регуляторов (Вс1-2, Вах) в нейтрофилах крови 60
2.3. Статистическая обработка результатов 61
Глава 3. Результаты собственных исследований 63
3.1. Особенности программированной гибели нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении 63
3.2. Оценка влияния оксида азота на апоптоз нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении 68
3.2.1. Влияние индукции и ингибирования синтеза оксида азота на содержание активных форм кислорода в нейтрофилах при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении 68
3.2.2. Изменение числа апоптотических нейтрофилов при; индукции и ингибировании синтеза NO в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении , 71
3.2.3. Содержание метаболитов оксида азота в нейтрофилах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении в условиях воздействия L-аргинина и ,
L-NAME 72
3.3. Оценка молекулярных механизмов дизрегуляции апоптоза нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении 74
3.3.1.Содержание цАМФ и цГМФ в нейтрофилах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении в условиях индукции и ингибирования синтеза оксида азота 74
3.3.2.Содержание ионов кальция в нейтрофилах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении в условиях индукции и ингибирования синтеза оксида азота 79
3.3.3. Содержание белков-регуляторов апоптоза в нейтрофилах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении 81
Глава 4. Обсуждение полученных результатов исследования 84
Выводы 115
Список литературы
- Образование оксида азота и внутриклеточные эффекты оксида азота
- Культивирование нейтрофильных лейкоцитов крови
- Особенности программированной гибели нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
- Оценка молекулярных механизмов дизрегуляции апоптоза нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
Введение к работе
Актуальность исследования. Окислительный стресс
характеризуется избыточным увеличением генерации в тканях активных форм кислорода (АФК), приводящих к повреждению нуклеиновых кислот, белков и липидов. В физиологических условиях АФК участвуют в развитии «респираторного взрыва», синтезе гормонов, процессах пролиферации клетки [Владимиров Ю.А., 2000; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. Наряду с этим АФК рассматриваются в качестве внутриклеточных мессенджеров, участвующих в регуляции метаболизма клетки. Универсальным участником регуляторных процессов в клетке является оксид азота. На организменном уровне основные эффекты оксида азота проявляют себя в поддержании тонуса сердечно-сосудистой системы, участии в синаптической передаче, регуляции воспалительного ответа и апоптоза клеток [Маеда X., Акаике Т., 1998; Меныцикова Е.Б. и соавт., 2000].
Апоптоз является важнейшим механизмом контроля клеточных популяций в многоклеточном организме [Kerr J.F.R., 1972]. Активация программированной клеточной гибели напрямую связана с развитием окислительного стресса. Активные формы кислорода вызывают открытие пор во внутренней митохондриальной мембране, набухание матрикса и разрыв внешней мембраны митохондрий с освобождением проапоптотических белков (AIF, Smac, прокаспаза 9, цитохром с) из межмембранного пространства в цитозоль [Yi J. et al., 2002; Лущак В.И., 2007]. Выход цитохрома с приводит к резкому повышению внутриклеточного содержания АФК и активации каспазного каскада [Green D.R., Reed J.C., 1998; Gordon D.M., 2000].
Важнейшим радикалом, участвующим в регуляции апоптоза, является радикал оксид азота (NO). Уникальная химическая природа и большое число внутриклеточных мишеней для NO оставляют открытым вопрос, каким образом опосредуется регулирующее влияние оксида азота на апоптоз в
7 условиях окислительного стресса [Choi В.М. et al., 2002; Меныцикова Е.Б. и соавт., 2006].
С одной стороны, известно, что оксид азота способен подавлять синтез белка Вс1-2 и увеличивать экспрессию Вах в митохондриях, провоцируя повышение проницаемости митохондриальной мембраны и выход в цитоплазму клетки АФК [Hortelano S. et al., 1997; Braene В., 1999; Лущак В.И., 2006; Кулинский В.И., 2007]. Сильный окислитель пероксинитрит, образующийся при взаимодействии оксида азота с супероксиданионом, индуцирует образование гидроксильных и липидных радикалов [Маеда X., Акаике Т., 1998], окисляет NH2- и SH-группы белков, что приводит к ингибированию супероксиддисмутазы и ДНК-лигазы.
С другой стороны, в ряде работ описаны диаметрально противоположные эффекты оксида азота на развитие программированной клеточной гибели. Так, активация NO/цГМФ-зависимого пути отменяла развитие апоптоза моноцитов клеточной линии U937 [De Nadai С. et al., 2000], гепатоцитов и В-лимфоцитов [Choi В.-М. et al., .2002]. Кроме того, блокирование апоптоза может быть связано с нитрозилированием каспазы-3 [Вшепе В., 1999; Mannick J.B., 1999]. Следует отметить, что имеются данные, указывающие на способность оксида азота индуцировать синтез белков семейства Вс1-2 [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Choi В.-М. et al., 2002].
Известно, что продукция АФК наиболее значима в нейтрофильных лейкоцитах по сравнению с другими клетками организма. Индукция окислительного стресса при воспалении инициирует развитие программированной гибели нейтрофилов. В связи с тем, что нейтрофилы быстро вступают на путь спонтанно развивающегося апотоза, не требующего какого-либо внешнего сигнала смерти [Edwards S.W. et al., 2003], состояние внутриклеточных сигнальных систем (Са~ , цАМФ и цГМФ), баланс анти- и проапоптотических белков семейства Вс1-2 являются важными регуляторными факторами продолжительности жизни клеток.
Несмотря на очевидную взаимосвязь окислительного стресса и апоптоза, роль оксида азота в механизмах реализации программированной гибели нейтрофилов в полной мере до конца не ясна. Установление молекулярных механизмов регуляции продолжительности жизни нейтрофильных лейкоцитов позволит создать селективные технологии управления воспалительным процессом.
Цель исследования: изучить роль оксида азота в механизмах регуляции апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Изучить особенности продукции нейтрофилами оксида азота при экспериментальном окислительном стрессе и у больных острыми воспалительными заболеваниями (внебольничная пневмония, острый аппендицит).
Оценить количество апоптотически измененных нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro в условиях влияния индуктора и ингибитора NO-синтазы.
Оценить содержание белков-регуляторов с про- (Вах) и антиапоптотической (Вс1-2) активностью при индукции синтеза N0 и ингибировании NO-синтазы в условиях экспериментального окислительного стресса.
Определить роль внутриклеточных сигнальных молекул (Са2+, цАМФ и цГМФ) в регуляции апоптоза нейтрофилов в условиях окислительного стресса in vitro при индукции синтеза NO и ингибировании NO-синтазы.
Установить особенности влияния N0 на апоптоз нейтрофилов в условиях окислительного стресса in vitro и острого воспаления в клинике внутренних болезней.
Научная новизна. Использование современных молекулярно-биологических и биохимических методов показало, что при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалительном процессе в клинике внутренних болезней (внебольничная пневмония, острый аппендицит) происходит увеличение продукции оксида азота нейтрофильными лейкоцитами.
Показано, что молекулярные механизмы влияния молекул оксида азота на апоптоз нейтрофилов при окислительном стрессе и остром воспалительном процессе сопряжены с участием ионов кальция, цАМФ и цГМФ. Установлено, что влияние оксида азота на реализацию программированной гибели нейтрофилов не связано с влиянием на баланс про- (Вах) и антиапоптотических (Вс1-2) белков.
Теоретическая и практическая значимость. Разработана экспериментальная модель окислительного стресса, позволяющего прогнозировать развитие программированной клеточной гибели нейтрофилов при использовании индукторов и ингибиторов NO-синтаз при острых воспалительных заболеваниях. Полученные в результате проведенного исследования данные носят фундаментальный характер и раскрывают молекулярные механизмы развития программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов, опосредованные молекулами оксида азота, в условиях окислительного стресса in vitro и острого воспаления в клинике внутренних болезней. Установленные закономерности реализации апоптотической программы нейтрофильных лейкоцитов в условиях окислительного стресса при воспалении могут быть положены в основу разработки селективных молекулярных технологий управления развитием воспалительного процесса, влияя на продолжительность жизни нейтрофильных лейкоцитов.
Полооїсения, выносимые на защиту:
1. Молекулы оксида азота оказывают протективный эффект на реализацию апоптотической гибели нейтрофильных лейкоцитов при
10 экспериментальном окислительном стрессе, индуцированным 5 мМ НгСЬ, и остром воспалительном процессе.
2. Нарушение реализации программированной гибели нейтрофилов при культивировании с индуктором синтеза оксида азота в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении сопряжено с изменением внутриклеточного содержания ионов кальция, цАМФ и цГМФ, не зависит от содержания белков Вах и Вс1-2.
Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на VII международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2007), международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной . и интегративной медицине» (Судак, Украина, 2007), на Всероссийской конференции «Национальные дни лабораторной медицины России 2007» (Москва, 2007), XX съезде физиологического общества имени И.П. Пирогова (Санкт-Петербург, 2007), II конгрессе терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации» (Москва, 2007).
В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ, по проблеме «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), РФФИ «Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150 - ориентированные фундаментальные исследования 2007-2008), а так же проекта «Разработка способов коррекции нарушений регуляции апоптоза клеток при патологических процессах в условиях окислительного стресса» (гос. контракт № 02.442.11.7276 от 20.02.2006), реализованного в рамках Федеральной целевой научно-
технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка литературы (135 страниц машинописного текста), включающего 180 источников (из них - 62 отечественных и 118 зарубежных). Работа иллюстрирована 9 таблицами и 6 рисунками.
Образование оксида азота и внутриклеточные эффекты оксида азота
Синтез N0 в организме человека и животных происходит во многих клетках и тканях при ферментативном окислении L-аргинина [Меныцикова Е.Б. и соавт., 2000; Tuteja N. et al., 2004]. Для большинства организмов аргинин является заменимой аминокислотой и синтезируется, в цикле мочевины. Образование оксида азота осуществляется семейством уникальных цитохром-Р450 подобных гемопротеинов — NO-синтаз (КФ 1.14.13.39) молекула, которых содержат домены с редуктазной и оксигеназной активностью. Специфичные для разных тканей и клеток NO-синтазы (NOS) в настоящее время хорошо изучены, определены их молекулярные массы (125-160 кДА), первичные структуры белков, установлена хромосомная локализация и нуклеотидные последовательности соответствующих генов [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Голиков П.П., 2004; Gong L.etal., 2004].
Все типы NO-синтаз уникальны, по своей организации и включают рекордное число разнообразных коферментові флавинмононуклеотид (ФМН), флавинадениндинуклеотид (ФАД), никотин амидадениндинуклеотидфосфат восстановленный (НАДФН), гем и кальций-кальмодулин. Суммарное уравнение, катализируемое NO-синтазой, включает пятиэлектронное (N -N" ) окисление атома азота аргинина, сопряженное с окислением НАДФН [Недоспаев А.А., 1998]. Конкурентными субстратами-ингибиторами синтеза оксида азота являются N -производные аргинина, в частности N -нитро-Ь-аргинина метиловый эфир (L-NAME), и ряд других соединений [Edwards R. М., 1998; Зенков ПК. и соавт., 2001]. В настоящее время известно, что синтазы оксида азота представляют собой семейство, или группу ферментов, несколько различающихся по аминокислотной последовательности белковой части молекулы.
По характеру индукции синтазы оксида азота разделяются на два класса. Первый класс составляют кальций-кальмодулинзависимые ферменты, констутивно экспрессируемые физиологическими факторами или через рецепторы NO синтаз.
Конститутивные NOS подразделяются на нейрональную (nNOS, тип I) и эндотелиальную (eNOS, тип III) формы. Обе изоформы выявляются в нейронах, эндотелиоцитах, тромбоцитах, нейтрофилах и других клетках [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Голиков П.П., 2004].
Ко второму классу синтаз оксида азота относятся кальций-независимые, индуцибельные NOS (iNOS, тип II), экспрессия которых резко увеличивается под влиянием различных цитокинов [Ванин А.Ф., 2000; Голиков П.П., 2004]. При увеличении синтеза фермента наработка NO возрастает в десятки раз и максимальных значений достигает через часы [Меныцикова Е.Б. и соавт., 2000].
NO-синтаза II типа впервые была выделена из макрофагов. Она представляет собой гомодимер с молекулярной массой 130 кДа [Голиков П.П., 1999, 2004] и-находится в клетке в растворимой форме. Максимальная скорость окисления L-аргинина и образование NO может достигать 1600 нмоль/(мг-мин). Индуцибельная NO-синтаза, так же как и конститутивная, содержит кальмодулин-связывающий участок (аминокислотные остатки 503-532) [Зенков Н.К. и соавт., 2001]. Имеются данные о том, что относительная независимость iNOS от кальция-кальмодулина обусловлена прочной связью данного белка с индуцибельной NO-синтазой [Реутов В.П. и соавт., 1998].
Получены многочисленные данные о механизмах индукции экспрессии гена NO-синтазы II типа. Классическими индукторами iNOS считаются интерлейкины IL -1(3, IL -2, фактор некроза опухоли-а (TNF-a), липополисахариды, а также интерферон-у [Маеда X., Акаике Т., 1998; Голиков П.П., 1999; Зенков Н.К. и соавт., 2001].
Супрессирующим эффектом в отношении экспрессии NO-синтазы и индуцибельного синтеза NO обладают ряд цитокинов, таких как IL-13, трансформирующий фактор роста (31, (32, (33, ростовой фактор фибробластов [Зенков Н.К. и соавт., 2001], ростовой фактор тромбоцитов, инсулиноподобный фактор роста, тромбин [Реутов В.П. и соавт., 1998], а также простагландин (Pg) Е2и глюкокортикоиды [Edwards R.M., 1998].
Предпологается наличие обратной регуляции (feedback) по конечному продукту iNO-синтазы оксидом азота. Согласно данной гипотезе NO связывается с гемом фермента и ограничивает димеризацию индуцибельной изоформы, предотвращая включение гема в ее состав [Ballou D.P. et al., 2002]. Оксид азота может осуществлять ретроградную регуляцию не только путем взаимодействия с гемом фермента, но и через ингибирование транскрипции мРНК NO-синтазы непосредственно, либо угнетая активацию NF-kB [Hanafy К. А., 2001].
Культивирование нейтрофильных лейкоцитов крови
Для выделения нейтрофилов венозную гепаринизированную кровь в соотношении 1:1 наслаивали на двойной градиент плотности Ficoll-Paque (р=1,077 г/см3) («GE Healthcare», Швеция) и Ficoll-урогрофин (р=1,095 г/см3) (Ficoll — «GE Healthcare», Швеция; урографин — «Schering/Шеринг», Россия), центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин. В результате центрифугирования получали два кольца клеток. Верхнее кольцо, образованное смесью мононуклеарных клеток, собирали пипеткой с раздела фаз и удаляли. Второе кольцо из нейтрофильных лейкоцитов аккуратно собирали пипеткой и использовали для дальнейших исследований [Bignold L.P., Ferrante А., 1987]. Суспензию нейтрофилов трижды отмывали-в среде RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), последовательно ресуспендируя и центрифугируя в течение 10 мин при 1500 об/мин, каждый раз удаляя супернатант. Для определения жизнеспособности выделенных нейтрофилов 0,1 мл суспензии клеток смешивали с равным объемом 0,5% трипанового синего («Serva», США), заполняли счетную камеру Горяева и далее оценивали содержание «мертвых» клеток, окрашенных в синий цвет. Доля живых клеток, не содержащих краситель, составляла 95 %.
Нейтрофилы крови, выделенные на градиенте плотности, ресуспендировали в полной питательной среде (90% RPMI-1640, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки ("Биолот", Санкт-Петербург), инактивированной при 5бС в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, 2 ммоль/мл HEPES («Flow», Великобритания)). Количество выделенных клеток стандартизировали, для чего суспензию нейтрофилов разбавляли питательной средой до получения клеточной взвеси 2-Ю6/ мл [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].
Процент некротизированных клеток, пропускающих в цитоплазму краситель, определялся с использованием 0,5 % трипанового синего («Serva», США). Жизнеспособность клеток составляла 95% и выше.
Клетки культивировали в стерильных пенициллиновых флаконах (для определения концентрации конечных метаболитов оксида азота, содержания белков Вс1-2, Вах, концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах) и 96-луночных круглодонных иммунологических планшетах (для определения числа аннексин-положительных клеток, концентрации внутриклеточных АФК и цитоплазматического кальция методом проточной лазерной цитометрии) в течение 18 ч при температуре 37 С и 5 % ССЬ.
Для исследования особенностей реализации апоптотической программы нейтрофилов в условиях повышенной наработки N0, клетки инкубировали с субстратом NO-синтазной реакции L-аргинином («MP», США). L-аргинин использовали в оптимальной концентрации 500 мкМ [Niu X.-F. et al., 1996], учитывающей неизбежный расход данной аминокислоты в других метаболических процессах.
Суспензию нейтрофилов крови здоровых доноров после добавления в среду инкубации 5 мМ перекиси водорода и 500 мкМ L-аргинина культивировали в течение 18 ч при температуре 37 С и 5 % ССЬ в. стерильных пенициллиновых флаконах (для определения концентрации, конечных метаболитов оксида азота, содержания белков Вс1-2, Вах, концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах) и 96-луночных круглодонных иммунологических планшетах (для определения числа аннексин-положительных клеток, концентрации внутриклеточных АФК и цитоплазматического кальция методом проточной лазерной цитометрии). Нейтрофильные лейкоциты, полученные у пациентов с аппендицитом и внебольничной пневмонией, инкубировали in vitro с L-аргинином в аналогичных условиях, но без добавления перекиси водорода.
В качестве специфического ингибитора продукции N0 в клетке использовался L-NAME («Fluka» США) в конечной концентрации 500 мкМ. Данная концентрация L-NAME является оптимальной для ингибирования синтеза NO [Beltran В. et al., 2002].
Выделенные из крови нейтрофилы здоровых доноров инкубировали в полной питательной среде с добавлением 5 мМ перекиси водорода и 500 мкМ L-NAME в течение 18 ч при температуре 37 С и 5 % СЄЬ в стерильных пенициллиновых флаконах (для определения концентрации конечных метаболитов оксида азота, содержания белков Вс1-2, Вах, концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах) и 96-луночных круглодонных иммунологических планшетах (для определения числа аннексин-положительных клеток, концентрации внутриклеточных АФК и цитоплазматического кальция методом проточной лазерной цитометрии). Нейтрофильные лейкоциты, полученные у пациентов с аппендицитом и внебольничной пневмонией, инкубировали in vitro с L-NAME в аналогичных условиях, но без добавления перекиси водорода.
Особенности программированной гибели нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
Для моделирования окислительного стресса in vitro нейтрофилы, полученные у здоровых доноров, инкубировали с перекисью водорода в конечной концентрации 1мМ, 5 мМ, 10 мМ и 50 мМ. Для оценки развития окислительного стресса в нейтрофилах методом лазерной цитометрии оценивали концентрацию внутриклеточных АФК.
Анализ внутриклеточной концентрации АФК свидетельствует, что в нейтрофилах, выделенных из периферической крови здоровых доноров, уровень активных форм кислорода составлял (0,240(0,214-0,259) усл.ед.) (рис. 4).
Однако добавление 5 мМ перекиси водорода в среду инкубации приводило к достоверному повышению значений исследованного показателя (0,678(0,596-0,705) усл.ед.) по сравнению с контролем (р 0,05). Дальнейшее увеличение концентрации перекиси водорода (10 и 50 мМ), добавляемой в культуру нейтрофильных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, приводило к дополнительному приросту количества АФК в клетках ((0,862(0,824-0,900) усл.ед.) и (1,080(1,022-1,106) усл.ед.), соответственно) как относительно контроля (р 0,05), так и относительно данных, полученных при индукции окислительных процессов перекисью водорода в концентрации 5 мМ (р 0,05).
Анализ продукции АФК нейтрофилами, полученных у больных внебольничной пневмонией, позволил выявить достоверное увеличение величины данного показателя (0,653(0,574-0,728) усл.ед.) по сравнению с таковым в контроле (р 0,05). Результаты исследования уровня АФК в нейтрофилах, выделенных из крови у лиц с острым аппендицитом, также свидетельствовали о значимом превышении значений данного параметра (0,673(0,561-0,690) усл.ед.) контрольных значений (р 0,05). Отсутствие различий содержания внутриклеточных АФК в нейтрофилах у больных острым аппендицитом (0,673(0,561-0,690) усл.ед.) и внебольничной пневмонией (0,653(0,574-0,728) усл.ед.) (р 0,05) позволило объединить пациентов в одну клиническую группу с острым воспалительным процессом (ОВ) (табл. 3).
Сравнительный анализ содержания АФК в нейтрофилах у здоровых доноров при инкубации клеток с различными концентрациями перекиси водорода и в нейтрофилах, полученных у пациентов с острым воспалением, показал, что величина исследуемого параметра лишь при экспериментальном ОС, индуцированным 5 мМ Н202 (0,678(0,596-0,705) усл.ед.), сопоставима с таковой у больных острыми воспалительными заболеваниями (0,579(0,557-0,664) усл.ед.) (р 0,05) (табл. 5).
Таким образом, добавление в среду инкубации экзогенного оксиданта - перекиси водорода в концентрации 5 мМ приводило к достоверному повышению внутриклеточного уровня АФК в нейтрофилах здоровых доноров, сопоставимому с уровнем АФК в нейтрофилах при остром воспалении. Следовательно, использование Н2Ог с концентрацией 5 мМ является оптимальным для индукции окислительного стресса в культуре нейтрофильных лейкоцитов и позволяет в определенной степени наиболее точно воспроизвести состояние окислительного стресса, характерного для острого воспаления.
Для оценки изменения количества апоптотически измененных клеток в культуре нейтрофилов был использован метод проточной лазерной цитометрии. В ходе исследования было установлено, что содержание аннексин-положительных клеток в культуре нейтрофилов, полученных у здоровых доноров, составляет (49,25(45,03-58,13)%) (табл. 3). Анализ количества клеток, подверженных некрозу, с пермеабилизированной клеточной мембраной, пропускающей краситель трипановый синий, показал, что в интактной культуре нейтрофилов здоровых доноров данный показатель составляет (3,20(2,70-3,90)%) (табл.3).
Оценка молекулярных механизмов дизрегуляции апоптоза нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
В« качестве мишени NO в. клетке могут выступать ферменты, вовлеченные в метаболизм циклических нуклеотидов - циклического АМФ и циклического ГМФ. Система циклических нуклеотидов является универсальной управляющей системой клетки. Под контролем данной системы находятся системы вторичных месенджеров, в том числе кальций-кальмодулиновая система. Исследование концентрации цАМФ в нейтрофилах здоровых доноров, проведенное с помощью радиоиммунного метода, выявило, что данный показатель составляет (114,13(101,96-120,55) нМ/106 кл). При количественной оценке содержания цАМФ в клетках, подвергшихся воздействию 5 мМ перекиси водорода, было установлено, что указанный параметр достоверно превышает контрольное значение (134,97(117,36-139,39) нМ/106 кл) (р 0,05) (табл. 6).
Определение концентрации цАМФ в нейтрофилах, полученных у больных с острым воспалением, показало, что значения данного параметра (88,58(67,42-121,71) нМ/106 кл) достоверно были ниже таковых не только в интактной культуре нейтрофильных гранулоцитов, но и в группе стресс-контроля (р 0,05) (табл. 7).
Совместное культивирование нейтрофилов, полученных у здоровых доноров с 5 мМ перекисью водорода и L-аргинином, приводило к достоверному снижению внутриклеточного содержания цАМФ (102,13(92,73-116,12) нМ/106 кл) по сравнению со стресс-контролем и аналогичным параметром в интактных нейтрофилах (р 0,05) (табл. 6).
Воздействие индуктора синтеза оксида азота на нейтрофильные лейкоциты у больных острыми воспалительными заболеваниями не приводило к изменению концентрации цАМФ (89,99(77,44-100,82) нМ/106 кл) относительно собственного базового уровня (р 0,05) (табл. 7).
При этом стимуляция синтеза оксида азота в клетках, полученных у пациентов с острым воспалением сопровождалась достоверным снижением содержания цАМФ по сравнению с аналогичными показателями в нейтрофилах контрольной группы и стресс-контроля (р 0,05) (табл. 7).
Добавление ингибитора синтеза N0 приводило к снижению концентрации цАМФ в нейтрофилах, культивированных с 5 мМ перекисью водорода, до значений (76,74(67,01-83,61) нМ/106 кл) (р 0,05) (табл. 6). Воздействие 500 мкМ L-NAME на нейтрофильные гранулоциты, полученные у больных острыми воспалительными заболеваниями, сопровождалось снижением содержания цАМФ (62,11(55,52-75,46) нМ/106 кл) относительно собственного базового уровня (р 0,05). При инактивации NO-синтазы in vitro в нейтрофильных гранулоцитах у пациентов с острым воспалением выявлялось снижение концентрации цАМФ по сравнению с контрольной группой и со стресс-контролем (р 0,05) (табл. 7).
Содержание цГМФ в нейтрофилах крови у здоровых доноров, установленное с использованием радиоиммунного исследования, составляло (12,25(10,48-17,04) нМ/106 кл). В условиях экспериментального ОС происходило снижение концентрации цГМФ в нейтрофилах относительно контрольного значения (4,16(3,91-7,88) нМ/106 кл) (р 0,05) (табл. 6). В нейтрофильных лейкоцитах у больных острым воспалением содержание цГМФ (4,06(3,48-5,79) нМ/106кл) также было достоверно ниже аналогичного параметра в контроле (р 0,05), достигая при этом уровня, близкого к.. таковому в случае воздействия на клетки in vitro 5 мМ перекисью водорода (табл. 7).
Индукция синтеза NO в нейтрофилах, полученных у здоровых доноров, инкубированных с 5 мМ Н202, приводила к повышению концентрации цГМФ (12,46(9,63-17,20) нМ/106 кл) в клетках относительно стресс-контроля до значений соответствующего показателя- в интактных клетках у здоровых доноров (табл. 6). Культивирование нейтрофилов, полученных у больных внебольничной пневмонией и острым аппендицитом, с 500 мкМ L-аргинином также сопровождалось увеличением (р 0,05) содержания цГМФ в клетках (9,28(7,62-12,51) нМ/106 кл); при этом значения данного параметра превосходило и таковой в случае экспериментального ОС, но не достигало уровня контроля (р 0,05) (табл. 7).
