Содержание к диссертации
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 4
ВВЕДЕНИЕ 6
РАЗДЕЛ I. РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В
АДАПТАЦИИ К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ 9
1.1. СИГНАЛЬНАЯ ФУНКЦИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В
ВОЗБУДИМЫХ ТКАНЯХ 9
1.II. ГЛУТАМАТНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И РЕГУЛЯЦИЯ
ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В МОЗГЕ 17
I.III. МИШЕНИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В ЖИВОЙ
КЛЕТКЕ 26
РАЗДЕЛ П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 34
II. I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
Животные 34
Протокол введения исследуемых соединений 36
П.1.3. Физиологические методы исследования 38
Выделение нейронов из мозжечка мышей и крыс 40
Определение концентрации белка 40
Определение ферментативных активіюстей 41
Определение концентрации биогенных аминов 44
Определение окисленности белков 45
Хемилюминесцентный анализ АФК 46
11.1.10. Измерение уровня Fe * -индуцированной
хемилюминесценции 47
ILL 11. Определение уровня мРНК к Na/K-A ТФазе и глутаматным
рецепторам 49
ILL 12. Статистическая обработка результатов 54
II.II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 55
Продукция свободных радикалов нейронами грызунов 55
Влияние МРТР на биохимические характеристики мозга грызунов 62
Влияние МРТР на физиологические параметры
животных 70
II.II. 4. Экспрессия глутаматных рецепторов и Na-mpacnopmepa в
возбудимых тканях грызунов 76
II.II.5. Взаимное влияние Na/K-АТФазы и глутаматных
рецепторов 81
РАЗДЕЛ III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 86
РАЗДЕЛ IV. ВЫВОДЫ 92
РАЗДЕЛУ. БЛАГОДАРНОСТИ 94
РАЗДЕЛ VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
Сокращения, принятые в тексте диссертации для обозначения радикальных продуктов и химических групп, соответствуют рекомендации Комиссии по биохимической номенклатуре ШРАС.
Другие сокращения, используемые в диссертации:
ACPD - 1-аминоциклопентан-1,3-дикарбоновая кислота
АМРА - а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изооксазолпропионовая кислота
DHPG - 3,4-дигидроксифенилгликоль
DNP - динитрофенилгидразин
dNTP - смесь дезоксинуклеотидов АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ.
GAPDH - глицеральдегид-3 фосфат дегидрогеназа
GPCR - G-protein coupled receptors, рецепторы сопряженные с G-
белками
mGluI (II,III) - глутаматные рецепторы 1,11,III групп соответственно
M-MLV-RT - обратная транскриптаза вируса саркомы Молони
грызунов.
МРТР - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин
NMDA - N-метил-О-аспартат
OD - оптическая плотность
SAM(P/R) - Senescence Accelerated Mice (Prone/Resistant), линия мышей
с ускоренным старением (склонные/устойчивые)
АТФ - аденозинтрифосфорная кислота
АФК - активные формы кислорода
ДОБА - диоксибензиламин
кДНК - кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота
МАО А, В - моноаминооксидаза А, В соответственно
МДА - малоновый диальдегид
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
мтДНК - митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота
НСТ - нитросиний тетразолий
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
ПОЛ - перекисное окисление липидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
СОД - супероксиддисмутаза
СОШ - стандартная ошибка среднего
ТАЕ - трис-ацетат-ЭДТА буфер
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ФМА - форбол 12-миристат 13-ацетат
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
Введение к работе
Окислительный стресс, являющийся следствием дисбаланса про-и антиоксидантных систем клетки и отражающийся в избыточном образовании в клетке активных форм кислорода (АФК), может являться причиной повреждения различных структур: ДНК, белков и липидов, и может приводить к клеточной смерти. Окислительный стресс сопровождает многие нейродегенеративные заболевания, по этой причине АФК принято считать вестниками клеточной смерти.
Однако в последнее время стало понятно, что активные формы кислорода принимают участие и в нормальной жизнедеятельности клетки в качестве сигнальных молекул. Так, реакции образования супероксид-аниона и гипохлорита клетками иммунной системы используется организмом при защите от инфекций и опухолевых процессов. Свободные радикалы, возникающие в цитозоле клетки в ответ на ее стимуляцию факторами роста, участвуют в регуляции процесса пролиферации. Образование простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов требует участие супероксид аниона, взаимодействующего с другим компонентом этой системы, арахидоновой кислотой - соединением, высвобождающимся из мембранных фосфолипидов в ходе индуцируемого АФК перекисного окисления липидов (ПОЛ). Недавно показано, что АФК, наряду с другими факторами, способны активировать такой транскрипционный фактор, как NF-кВ, что приводит к экспрессии различных белков.
Для исследования окислительного стресса применяются различные экспериментальные подходы, позволяющие выяснить молекулярные механизмы этого процесса как in vitro, так и in vivo. В настоящей работе мы использовали линию животных с ускоренным процессом старения SAMP1 (Senescence Accelerated Mice Prone, Strain 1), выведенную путем близкородственных скрещиваний из линии AKR/J. Характерной особенностью этой линии является то, что животные нормально развиваются до 4-х месячного возраста, после чего наступает фаза ускоренного накопления старческих признаков, обусловленных повышенной продукцией АФК. Истинным контролем к данной линии является линия SAMR1 (Resistant), также выведенная из линии AKR/J (Takeda, 1994).
Для моделирования окислительного стресса in vitro мы использовали N-метил-О-аспартат, NMDA, - соединение, активирующее одноименную группу ионотропных глутаматных рецепторов. Инкубируя выделенные из мозжечка нейроны мышей линии SAMP1 и крыс с различными концентрациями NMDA, мы наблюдали дозо- и время-зависимое увеличение продукции АФК.
Достаточно давно известно, что центральный фермент ионного гомеостаза, Na/K-АТФаза, также может принимать участие в процессах окислительного стресса, однако в литературе отсутствует систематическое исследование роли Na/K-АТФазы в этом процессе и ее функциональной связи с другими клеточными системами, принимающими участие в реализации окислительного стресса.
Целью настоящей работы явилось установление связи между глутаматными рецепторами, окислительным стрессом и Na/K-АТФазой.
Следующие задачи были сформулированы для достижения этой цели: 1) оценить продукцию АФК в клетках мозжечка двух
исследуемых линий животных; 2) оценить влияние глутаматных рецепторов и Na/K-АТФазы на развитие окислительного стресса; 3) оценить влияние АФК на физиологические и биохимических параметры животных; 4) охарактеризовать взаимодействие между глутаматными рецепторами и Na/K-АТФазой.
