Введение к работе
Высокая чувствительность головного мозга к повреждающему действию кислорода обуславливает заболевания, при которых окислительный стресс (ОС) является одной из главных причин гибели нервных клеток - болезни Паркинсона, Альцгеймера, Пика, хорею Гентингтона и др. Прогресс в области клинической неврологии не может быть обеспечен без опережающего развития фундаментальных исследований, направленных на изучение механизмов функционирования мозга в норме и при патологии. Исследование заболеваний, в патологической картине которых важное место занимает ОС (на сегодняшний день их насчитывается более 200), невозможно без создания моделей подобных состояний разного уровня сложности. Одной из наиболее адекватных моделей для исследования механизмов ОС и его биологических последствий по праву считается гипербарическая оксигенация (ГБО) (Casey et al., 2011).
Другой важный аспект этой проблемы заключается в уточнении роли митохондрий как источника активированных кислородных метаболитов, а также их участия в реализации программы клеточной гибели. Подобные задачи можно решить при помощи соединений нового класса - митохондриально-адресованньк антиоксидантов, разработанных под руководством академика В.П. Скулачева. Эти соединения представляют собой открытые В.П. Скулачевым и Е.А. Либерманом проникающие катионы трнфенилфосфония, конъюшрованные с эффективной ловушкой кислородных радикалов - молекулой пластохинона (Скулачев, 2007).
Следует отметить, что выявление механизмов защитного действия митохондриально-адресованных антиоксидантов - инновационное направление современной биологии и медицины. Хотя список митохондриальных патологий быстро пополняется и включает в себя рак, сердечную недостаточность, диабет, ожирение, инсульт, нейродегенеративные заболевания и старение, все эти состояния имеют общие черты - нарушение митохондриального гомеостаза кальция, АТФ или метаболизма активных форм кислорода (АФК) (Sheu et al., 2006). У соединений, минимизирующих митохондриалыюе накопление АФК и улучшающих митохондрпальную биоэнергетику, есть весомый потенциал для лечения таких заболеваний.
Цель работы состояла в выяснении механизмов регуляции свободнорадикальных процессов и аиоптоза при окислительном стрессе в мозгу и крови крыс в условиях ГБО, на фоне применения митохондриально-направленного антноксиданта SkQl и при нейродегенеративном процессе в крови пациентов с болезнью Паркинсона.
Задачи исследования:
-
Оценить интенсивность свободнорадикального окисления (СРО) в митохондриях клеток больших полушарий головного мозга, плазме крови, эритроцитах и лимфоцитах крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии SkQl.
-
Оценить состояние антиоксидантной системы (АОС) в митохондриях клеток больших полушарий головного мозга и крови крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии SkQl.
-
Изучить структурное состояние и поверхностный заряд мембран эритроцитов и лимфоцитов крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии SkQl.
-
Определить интенсивность апоптоза лимфоцитов по экстернализашш фосфатидилсерина и уровень активности каспазы-3 в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток больших полушарий головного мозга при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии SkQl.
-
Изучить интенсивность свободнорадикального окисления, активность антиоксидантной системы в крови, структурное состояние и поверхностный заряд эритроцитов и лимфоцитов, уровень апоптоза лимфоцитов при болезни Паркинсона.
Научная новизна работы.
-
В работе впервые исследованы механизмы действия ГБО-индуцированного окислительного стресса (0,5 МПа, 90 минут) с корреляционным анализом показателей СРО и АОС в крови и митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс. Впервые показано, что гипероксия приводит к более, чем двукратному усилению экспрессии фосфатидилсерина (ФС) на поверхности гашфоцитарных мембран и одновременно - к увеличению активности каспазы-3 в цитоплазматической и митохондриальной фракциях клеток больших полушарий головного мозга.
-
Впервые in vivo исследованы регуляторные (антиоксидантные и антиапоптозные) эффекты SkQl в крови и митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс при нормоксии. Показано комплексное действие препарата: ингибирующее - на процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ); стимулирующее - на активность ключевых антиоксидантных ферментов и содержание в крови метаболитов NO', модулирующее - на уровень апоптоза лимфоцитов периферической крови.
-
Впервые in vivo при ГБО-индуцированном окислительном стрессе исследованы регуляторные (антиоксидантные, мембранопротекториые и антиапоптозные) эффекты SkQl в крови и митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс. Показана его способность к поддержанию стационарного уровня ПОЛ в исследованных тканях, к стимуляции или нормализации активности ферментативных антиоксидантов, к
сохранению структурных параметров и поверхностного заряда биомембран, а также выраженный антиагюптозный эффект в условиях окислительного стресса.
-
Впервые проведена комплексная биохимическая оценка про- и антиоксидантных (АО) факторов крови при нейродегенеративном процессе (на примере болезни Паркинсона). Показано, что нейродегенеративный процесс характеризуется умеренным изменением показателей хемилюминесценции (ХЛ), накоплением молекулярных продуктов ПОЛ, метаболитов N0' и депрессией активности ключевых АО ферментов -каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатион-8-трансферазы (ГСТ).
-
В работе впервые дана оценка структурному состоянию мембран эритроцитов и лимфоцитов при нейродегенеративном процессе и охарактеризован поверхностный заряд клеток крови. Показано, что интенсивность апоптотической гибели лимфоцитов при БП в полтора раза превышает норму.
Основные положения, выносимые на зашиту.
-
ГБО (0,5 МПа, 90 мин) характеризуется избыточной продукцией АФК и активных форм азота (АФА), активацией процессов СРО, напряжением и нарушением работы ключевых АО ферментов, изменением структурных параметров и поверхностного заряда клеточных мембран, увеличением экспрессии ФС на поверхности мембран лимфоцитов и активности каспазы-3 в клетках больших полушарий головного мозга.
-
Предварительное применение SkQl оказывает антиоксидантное, антиапоптозное и мембранопротекторное действие и снижает выраженность ГБО-индуцированного ОС.
-
При нормоксии SkQl оказывает активирующее влияние на некоторые АО ферменты, ингибирует начальные и промежуточные стадии ПОЛ, снижает экстернализацию ФС на поверхности лимфоцитов, не оказывая влияния на активность каспазы-3 в клетках больших полушарий головного мозга.
-
Хронический окислительный стресс при нейродегенеративном процессе характеризуется умеренным повышением продукции АФК и АФА, накоплением молекулярных продуктов ПОЛ и снижением эффективности антиоксидантной защиты. Изменение структурных параметров мембран и рост отрицательного поверхностного заряда клеток крови сопровождается увеличением уровня апоптоза лимфоцитов.
Теоретическая и практическая значимость.
Полученные в настоящей работе данные представляют существенный интерес для понимания механизмов окислительного стресса, развивающегося как при действии острого стресс-фактора (гипербарический кислород), так и в условиях хронически протекающей патологии (нейродегенеративый процесс). Проведенное исследование позволило установить ряд фундаментальных закономерностей развития окислительного стресса в условиях
гипербарооксигенации в эксперименте и при нейродегенеративном процессе на примере БП, а также показать тесную взаимосвязь окислительного стресса и апоптоза при исследованных патологических состояниях. Показано, что одной из ведущих причин повреждающего действия ГБО является сверхпродукция АФК митохондриями, приводящая к митохондриалыюй дисфункции, что определяет вовлечение этих органелл в процессы клеточной гибели. Выявлена взаимосвязь активности антиоксидантной защиты и содержания продуктов ПОЛ митохондрий клеток больших полушарий головного мозга и крови при гипероксии.
Проведенное исследование позволило продемонстрировать в эксперименте выраженное регуляторное действие катионного производного пластохинона SkQl на свободнорадикальное окисление и программируемую клеточную гибель в условиях нормо- и гипероксии, которое реализуется как за счет собственного антиоксидантного потенциала SkQl, так и за счет стимуляции им эндогенных факторов защиты. На основе полученных результатов в эксперименте разработана инновационная технология цитопротекции при ОС, вызванном ГБО, посредством применения митохондриально-адресованного антиоксиданта.
В работе впервые проведена комплексная оценка нарушений свободнорадикального и структурно-метаболического гомеостаза при хроническом нейродегенеративном процессе, сопряженном с БП, в патогенез которого вовлекается митохондриальная дисфункция и окислительный стресс. Разработана информативная тест-система, включающая определение показателей системы «про- <-» антиоксиданты», структурного состояния биомембран и уровня апоптоза лимфоцитов в крови, что может быть использовано в клинике для оценки тяжести патологического процесса и эффективности проводимого лечения. Выявленная в работе общность ряда молекулярных механизмов окислительного стресса в условиях гипероксии и нейродегенерации, с одной стороны, и эффективность применения митохондриально-адресованного антиоксиданта SkQl при гипероксии, с другой стороны, указывают на перспективность разработки нового поколения фармакологических препаратов.
Апробация диссертационной работы.
Материалы диссертации доложены на II и III научно-практических Симпозиумах «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2009, 2010 гг.); на VIII, IX и X межвузовских конференциях с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2009, 2010, 2011 гг.); на III и IV международных конференциях «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009, 2011 гг.); на XIV пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010 г.); на 8-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь
XXI века - будущее Российской науки» (Ростов-на-Дону, 2010 г.); на научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга» (Ростов-на-Дону, 2011 г.); на 7-ой национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2011 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК - 3 статьи. Личный вклад - 65%, общий объем - 1,48 п.л.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах машішогаїсного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики групп экспериментальных животных и обследованных больных, методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов н списка литературы. Работа содержит 21 таблицу, иллюстрирована 23 рисунками. Список литературы включает 266 наименование, в том числе 180 зарубежных источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
