Введение к работе
Актуальность исследования. В функциональной биохимии и биохимии спорта огромное внимание уделяется поиску тех ключевых факторов регуляции метаболизма, воздействие на которые позволит значительно улучшить спортивный результат и облегчить переносимость интенсивной физической работы организмом. Наиболее перспективной мишенью для подобного воздействия является пептидергическая система, поскольку регуляторные пептиды играют важнейшую роль во всех физиологических процессах, участвуют в модуляции функций практически всех регуляторных систем [Гейн, 2007; Fricker, 2007; Ашмарин, 2006; Гомазков, 2007].
Результаты исследований последних лет свидетельствуют о выраженном влиянии физической активности на уровни отдельных регуляторных пептидов, однако имеется большое количество работ, свидетельствующих о разнонаправленных изменениях в концентрации индивидуальных исследуемых пептидов при сходных воздействиях, что связано, по-видимому, с различными моделями и схемами экспериментов [Bruchas, 2008; Esbjornsson, 2009; Kanarek, 2009; Ying, 2008]. Кроме того, существенным недостатком существующих работ является отсутствие комплексного анализа иерархически взаимосвязанных компонентов пептид ергической системы. Выраженные полифункциональные свойства пептидов также являются причиной однонаправленных изменений уровней индивидуальных нейропептидов при разных функциональных состояниях, что затрудняет определение биологической роли отдельных звеньев пептид ергической системы.
Также ограничением возможности оценить вклад пептидергической системы в адаптационных процессах при физической работе является практически полное отсутствие данных, характеризующих отличия в её функционировании у высокотренированных спортсменов, а именно эти отличия могут охарактеризовать ключевые звенья пептидергической системы, определяющие работоспособность и выносливость организма.
Цель исследования - на основании изучения закономерностей изменения уровня регуляторных пептидов, белковых гормонов, ростовых факторов, активности протеолитических ферментов и концентрации метаболитов у людей и у животных при физической работе в эксперименте, обосновать роль пептидергической системы в регуляторных процессах,
происходящих при физической работе.
В соответствии с поставленной целью был определён комплекс задач:
Изучение уровня регуляторных пептидов, белковых гормонов и ростовых факторов, активности ферментов их обмена, содержания метаболитов, показателей кислотно-основного состояния и уровня гормонов в сыворотке крови спортсменов и неспортсменов в состоянии покоя. Полученные данные послужат основой создания базы данных по исследуемым параметрам, которые будут использованы в качестве контрольных, исходных показателей для сравнения с данными, полученными при физической работе;
Изучение данных показателей в сыворотке крови здоровых людей и спортсменов высокой квалификации при физической работе;
Определение активности ферментов обмена регуляторных пептидов в отделах мозга и надпочечниках крыс в норме и при физической работе в эксперименте;
Экспериментальное обоснование возможности увеличения физической работоспособности путём коррекции функционирования пептидергической системы на примере препаратов семакс и селанк.
Научная новизна
Разработана принципиально новая модель участия пептидергической системы в регуляторных процессах при физической работе. Впервые продемонстрированы существенные различия в функциональном состоянии пептидергической системы у спортсменов и людей, не занимающихся спортом в состоянии покоя и при физической работе. Предложены механизмы адаптационных изменений в функционировании пептидергической системы при систематических физических нагрузках. Получены новые данные о механизмах регуляции активности нелизосомальных пептидгидролаз нервной ткани при физической работе и при действии пептидов семакс и селанк. Впервые обнаружено, что один из механизмов биологического действия новых пептидных препаратов семакс и селанк опосредован их влиянием на активность ферментов процессинга регуляторных пептидов. Впервые продемонстрировано, что введение семакса и селанка увеличивает физическую работоспособность у животных в эксперименте.
Практическая значимость
Практическую значимость имеет разработанный метод диагностики функционального состояния и уровня тренированности спортсменов высокой
квалификации, основанный на комплексном анализе изменений, наблюдаемых в пептидергической системе при лабораторном моделировании физической работы. Метод внедрён в процесс подготовки спортсменов школы высшего спортивного мастерства и училища олимпийского резерва (Пенза). Полученные сведения об уровне регуляторных пептидов и активности протеолитических ферментов нервной ткани, механизмах регуляции их активности при физической работе включены в программу спецкурсов «Нейрохимия», «Энзимология», «Современные методы в биохимии» и специального практикума по биохимии для студентов по специальностей «Биохимия» в Пензенском госпедуниверситете. Практический интерес представляют также данные о стимулирующем влиянии семакса и селанка на физическую работоспособность животных в эксперименте, что даёт основание рекомендовать использование этих препаратов для увеличения работоспособности человека в экстремальных ситуациях.
Положения, выносимые на защиту:
физическая работа активизирует функционирование пептидергической системы, что выражается в повышении уровня подавляющего большинства нейропептидов в сыворотке крови после физической активности, повышения активности ферментов обмена регуляторных пептидов в сыворотке крови человека и нервной ткани крыс;
пептидергическая система спортсменов высокой квалификации в состоянии покоя функционирует более активно, чем у неспортсменов, что выражается в существенных различиях в активности пептидгидролаз, уровне большинства регуляторных пептидов и контролируемых ими показателях;
физическая работа вызывает менее выраженные изменения в уровне регуляторных пептидов и активности ферментов их обмена у спортсменов, чем у людей, не занимающихся спортом, при более выраженных сдвигах в содержании метаболитов и показателях КОС, что свидетельствует о высокой адаптационной значимости различий в функционировании пептидергической системы у этих исследуемых групп в состоянии покоя;
биохимические изменения, вызываемые физической нагрузкой, существенно отличаются от процессов, характерных для стресс-реакции, что выражается в отличиях в уровне ростовых факторов, половых и тиреоидных гормонов при стрессе и при физической работе;
один из механизмов стимулирующего действия пептидных препаратов семакс и селанк связан с активацией пептидергической системы, в частности,
с повышением активности ферментов протеолитического процессинга пропептидов.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на 12 Международных и Всероссийских конференциях и съездах.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 58 научных работ, из них 12 в ведущих рецензируемых журналах из перечня ВАК РФ.
Структура и объём работы
Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста, состоит из введения, пяти глав, выводов, включает 4 таблицы, 25 рисунков и библиографический список, содержащий 837 наименований на русском и иностранных языках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая схема исследования
Уровень регуляторных пептидов, белковых гормонов и ростовых факторов, активность ПДА, ЛКП, ЛАП, содержание гормонов, метаболитов и показатели КОС определялись в венозной крови и сыворотке крови спортсменов ГОУ ДОД Школа высшего спортивного мастерства г. Пензы, специализации лёгкая атлетика - средний бег и триатлон, квалификации мастера спорта и мастера спорта международного класса, без заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ в возрасте 18-28 лет (п=18) и людей, не подвергающихся систематическим физическим нагрузкам -студентов и аспирантов вузов г. Пензы в возрасте 18-28 лет (п=18). Каждую группу делилась на две подгруппы - интактную и экспериментальную, выполняющую физическую работу.
Активность КПЕ и ФМСФ-КП определяли в нервной системе белых беспородных крыс, разделённых на следующие группы:
1. Интактные (п=7).
2.1 экспериментальная группа (п=7), выполнявшая физическую работу.
3. I контрольная группа - интраназальное введение дистиллированной воды, после чего крысы были разделены на подгруппы:
а) животные, подвергнутые декапитации через 0,5 (п=7), 4 (п=7) и 24 ч
(п=7) после инстилляции;
б) крысы, выполнявшие физическую работу через 0,5 (п=7), 4 (п=7) и
24 ч (п=7) после инстилляции.
4. II экспериментальная группа - интраназальное введение семакса,
после чего крысы были разделены на подгруппы:
а) животные, подвергнутые декапитации через 0,5 (п=7), 4 (п=7) и 24 ч
(п=7) после инстилляции;
б) крысы, выполнявшие физическую работу через 0,5 (п=7), 4 (п=7) и
24 ч (п=7) после инстилляции.
5. III экспериментальная группа - интраназальное введение селанка,
после чего крысы были разделены на подгруппы:
а) животные, подвергнутые декапитации через 0,5 (п=7), 4 (п=7) и 24 ч
(п=7) после инстилляции;
б) крысы, выполнявшие физическую работу через 0,5 (п=7), 4 (п=7) и
24 ч (п=7) после инстилляции.
Методы
Физическую работу для экспериментальных подгрупп спортсменов и людей, не подвергающихся систематическим физическим нагрузкам, создавали с помощью программируемого тредбана, начиная со скорости 3,5 м/с, повышая каждые две минуты на 0,5 м/с до скорости, характеризующейся подъёмом пульса до 180 уд/мин, на которой испытуемый бежал до состояния полного утомления.
Физическая работа у крыс создавалась с использованием модели острой физической нагрузки [Краснова, 1977]. Животные плавали в аквариуме с грузом 20 % от массы тела, прикреплённым к основанию хвоста. Время физической работы ограничивалось моментом полного погружения животного под воду.
Семакс и селанк вводили интраназально в виде 1 % раствора в дозе 300 мкг/кг. Вводимый объём был равен 6 мкл. Контрольной группе животных вводили равное количество дистиллированной воды. Декапитацию осуществляли через 0,5, 4, и 24 после введения для изучения активности ферментов обмена регуляторных пептидов.
Концентрацию лактата определяли с помощью ферментного электрода с иммобилизованной лактатдегидрогеназой, глюкозу с помощью глюкозооксидазы [Geir, 2005].
Активность КПЕ определяли флюориметрически по гидролизу раствора дансил-фен-ала-арг при рН 5,6, в качестве ингибитора использовали GEMS A [Fricker, 1982]. Активность ФМСФ-КП определяли флюориметрически [Генгин, 2002] по гидролизу дансил-фен-лей-арг при рН 5,6, в качестве ингибитора использовали ФМСФ. Активность ЛКП
определяли фотометрически [Lee, 1966] по гидролизу карбоксибензоил-Gly-Arg при рН 7,6, в качестве ингибитора использовали ГЭМЯК. Активность ПДА определяли фотометрически по отщеплению Gly-Arg от карбоксибензоил-Gly-Gly-Arg при рН=8,2, с использованием каптоприла в качестве ингибитора [Hurst, 1981]. Активность ЛАП определяли флюориметрически по гидролизу лей-Р-нафтиламина при рН 7,4, в качестве ингибитора использовали пуромицин.
Содержание люлиберина, АКТГ, ЛГ, ФСГ, пролактина, СГТ, ТТГ, инсулина, глюкагона, лептина, вещества Р, IGF-1, TGF la, TGF-1J3, Т З, Т 4, кортизола, кортикостерона, тестостерона и адреналина осуществлялось различными вариантами иммуноферментного анализа с использованием готовых наборов, изготовленных на заказ фирмой DRG International (Германия).
Концентрацию белка в гомогенатах отделов нервной системы крыс и в сыворотке крови человека определяли по Лоури [Lowry, 1951].
Проверка принадлежности распределения признаков к нормальному распределению производилась по критерию хи-квадрат. Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента и дисперсионного анализа [Лакин, 1990].
