Введение к работе
Актуальность проблемы
Важная роль свободных радикалов и активных форм кислорода в процессах жизнедеятельности клеток в норме, а также при патологиях в настоящее время не вызывает сомнений Это подтверждается и тем обстоятельством, что количество оригинальных работ, опубликованных в мировой биомедицинской литературе по этой проблеме, исчисляется сотнями тысяч. Нарушение внутриклеточных процессов окисления-восстановления часто является одной из причин или сопровождает развитие таких распространённых патологий, как диабет, нейро-дегенеративные, бронхо-легочные и онкологические заболевания, инфаркт миокарда и тд Таким образом, выяснение молекулярных механизмов действия систем, сопряженных со свободными радикалами, необходимо не только для понимания фундаментальных основ физиологии клетки, но и потенциально имеет колосальное практическое приложение, посколькутералевтическое воздействие на те или иные компоненты системы окисления-восстановления теоретически может давать возможность корректировать патологические состояния К середине 70-х годов биомедицинские иследования, объединившие биохимические, молекулярные и медицинские подходы к изучению свободных радикалов оформились в самостоятельное научное направление - редокс биология
Клеточный метаболизм перекисных соединений необыкновенно сложен и включает в себя целый ряд систем, состоящих как из низкомолекулярных продуктов, так и из макромолекул Ферменты, называемые пероигидазами, представляют из себя гетерогенную группу многих белковых семейств, работающих по различным каталитическим принципам и выполняющих широкий спектр биологических функций, из которых детоксификация перекиси водорода, или классичесая «антиоксидантная» функция, является лишь одной из многих Н;Оа-зависимый синтез вторичных метаболитов среди re м-содержащих пероксидаз и родственных ферментов осуществляется транзиторным катализом с участием металлов, который часто сопровождается образованием других свободных радикалов
Другой класс ферментов-антиоксидантов, включающий кофермент-независимые глугатион пероксидазы и пероксиредоксины, катализируют дву-элекгронный перенос восстановительного эквивалента, и, таким образом, нейтрализуют перекись водорода без образования свободных ради калов, появление которых само по себе может наносить вред клетке. Однако, в дополнение к антиоксидантним эффектам, у этих тиоловых оксидоредуктаз есть способность к утилизации гидропероксида для образования специфичных дисульфидных связей внутри или между белками (Рис.1), что существенно расширяет спектр их функциональных возможностей, включающих окислительно-восстановительную регуляцию меіаболических процессов, сигнализацию и тд. Между тем, до настоящего времени не было проведено достаточно широкого исследования тиоловых оксидоредуктаз, более того, многие белки этого суперсемейства не были идентифицированы. Полагаем, что идентификация новых тиоловых оксидорелуктаз и выяснение механизмов их функционирования в живых
организмах является весьма актуальной фундаментальной проблемой редокс-биологии
Н20+02 н2о2 ..2
\кат J \ GPx / ^ Grx
НАДФН-
Pf*<SHk НЛ
4Prx-S
H,0
НАДФ*-*7тн
Prx-S.
2GSH^( yPrx-(SH)2 Hj02
H202-
Рисунок 1 Схема, иллюстрирующая метаболізм перекиси водорода и основные ферменты, вовлеченные в этот процесс Обозначения КАТ - каталаза, GSH -восстановленный глутатион, GSSG - окисленный глутатион, GPx — глутатион пероксицаза, Ргх - пероксиредоксин, GR - глутатион редуктаза, TR _ тиоредоксин редуктаза, Тп< -тиоредоксин, Grx - глутаредоксин, RSSR - окисленный субстрат, RSH - восстановленный субстрат
Цель и задачи исследования:
В соответствии с поставленной проблемой, направленной на идентификацию
неизвестных ранее тиоловых оксидорелукгаз и выяснение механизмов их
функционирования в живых системах, были определены следующие задачи:
1. Проанализировать эволюцию тиоредоксин редукгаз для выяснения
физологической значимости и причин существования их «коротких» и «длинных»
форм
-
Идентифицировать и охарактеризовать недостающий митохондриальный компонент системы глутаредоксина.
-
Выяснить структурные и функциональные характеристики тиоредоксин-глутатион редуктазы млекопитающих.
-
Провести поиск новых селен-содержащих оксидоредукгаз у разных видов животных
-
Найти закономерности в структуре и биохимических характеристиках этих новых ферментов и классифицировать их
Научная новизна. Новизна представленных в работе результатов определяется несколькими обстоятельствами. Во-первых, на основании филогенетического анализа впервые было установлено, что «большая» форма тиоредоксин рсдукгазы произошла от GR низших эукариот путем удлинения карбокситерминального конца белка с появлением Gly-SecCys-Cys-GIy мотива в новом каталитическом окислительно-восстановительном центре, который функционально заменил глутатион в качестве іранзиторноіо субстрата для этого фермента. Во-вторых, впервые был идентифицирован и охарактеризован новый митохопдриальный глутаредоксин (Grx2) На основании кинетических данных было доказано, что белок Grx2 обладает наиболее высоким сродством по отношению к L-цистеину, и ото сродство было эквивалентно таковому для HEDS и S-сульфоцистеина В-трстьих, было доказано, что TGR структурно является тиоредоюмн-глутатион редуктазой, обладающей тиолтрансферазной, глутатион и тиоредоксин редуктазной. и протеин дисульфид изомеразной активностью т vitro, а функционально - это изомераза Gpx4, вовлеченная в образование митохондриалыюй капсулы сперматозоидов В-четвергых, был идентифицирован и охарактеризован новый селен-содержащий белок SelM, имеющий новый тип SEC1S элемента На основании анализа генома человека было выявлено 25 селен-содсржаїцих белка, семь из которых ранее не были известны. Среди них имеются новая глутатион лероксидаза Gpx6, экспрсссируюшдяся в обонятельном эпителии на определённых стадиях эмбриогенеза, а также SelV - белок сперматоцитов В-пятьгх, было доказано, что Settl - это новая тиоловая оксидоредукгаза ядрышек, имеющая необычный паттерн экспрессии И, наконец, обнаружили новую тиоловую оксидоредуктазу эукариот, названную нами Rdxl2. На основании компьютерного анализа объединили Rdxl2, SeJW, SeiV, SelT и SelH в новое семейство тиоловых оксидоредукгаз с тиоредоксин-подобной укладкой Это новое семейство белков было охарактеризовано и назвало нами Rdx. Аробіщия работы. Материалы диссертации были представлены на нескольких симпозиумах и конференциях: 8th International Symposium on Selenium in Biology and Medicine, (2005) Мадисон, США, Experimental Biology 2004 (EB 2004) Восток, США; Experimental Biology 2003 (EB 2003) Сан Диего, США, Experimental Biology 2002 (EB2002) Новый Орлеан, США, 17th Joint Meeting of the International Society for Neurochernistry (ISN) and the 13lh General Meeting European Society forNeurochemistiy (ESN), 1999, Берлин, ФРГ.
Струк/itypa и объем диссертации Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 40 рисунков и 5 таблиц Список работ, опубликованных по теме диссертации, содержит 29 статей в реферируемых журналах, главу в сборнике и заявку на Патентное разрешение.
