Содержание к диссертации
1. Введение 5
2. Обзор литературы 8
2.1. Ыа,К-АТРаза: молекулярная структура, механизм функционирования и регуляция
2.1.1. Структурная организация Na,K-ATPa3M 8
2.1.2. Механизм функционирования Na,K-ATPa3bi 12 2.1.3.Изоферменты Na,K-ATPa3bi и их свойства 15
2.1.4. Роль №,К-АТРазы в функционировании различных тканей
2.1.5. Механизмы регуляции ИаД-АТРазы 20
2.1.5.1. Фосфорилирование ЫаДС-АТРазы протенкиназами 21
2.1.5.2. Взаимодействие Ыа,К-АТРазы с другими белками 25
2.2. Кардиотонические стероиды как модуляторы активности Na,K-ATPa3bi
2.2.1. Участки связывания КТС на молекуле а-субъединицы Na,K-ATPa3bi.
2.2.2. Эндогенные КТС 34
2.3. Сигнальные каскады, активируемые КТС 37
2.3.1. Сигнальный каскад, опосредованный повышением внутриклеточных концентраций Са2+ и Na+
2.3.2. Сигнальный каскад, независящий от концентрации внутриклеточного Са2+ и опосредованный изменением концентрации внутриклеточного Na+
2.3.3. Сигнальные каскады, независящие от соотношения внутриклеточных концентраций Na+ и К+
2.3.3.1. Усиление пролиферации клеток под действием низких концентрации КТС
2.3.3.2. Смерть эпителиальных и эндотелиальных клеток под действием КТС
3. Материалы и методы 52
ЗЛ. Культуры клеток 52
3.1.1. Эпителиальные клетки линии C7-MDCK 52
3.1.2. Эпителиальные клетки линии Сасо-2 52
3.2. Морфологические и биохимические методы оценки типа клеточной смерти
3.2.1. Фазово-контрастная микроскопия 53
3.2.2. Флуоресцентная микроскопия 53
3.2.3. Нарушение связи клеток с подложкой 54
3.2.4. Окрашивание МТТ 54
3.2.5. Определение активности каспазы-3 55
3.3. Методы изучения ионного гомеостаза клеток 56
3.3.1. Активность Na,K-Hacoca 56
3.3.2. Связывание [3Н]-уабаина 57
3.3.3. Содержание обмениваемого внутриклеточного натрия 58
3.3.4. Измерение внутриклеточного рН 59
3.4. Биохимические методы исследования 59
3.4.1. Измерение содержания NADH/NADPH и FADH2 в клетке
3.4.2. Измерение содержания активных форм кислорода в клетке
3.4.3. Определение синтеза РНК и белка 61
3.4.4. Иммунопреципитация белков с использованием антител на Na,K-ATPa3y
3.4.5. Измерение концентрации белка методом Брэдфорда 64
3.4.6. Одномерный электрофорез в полиакриламидном геле по методу Лэммли
3.4.7. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле
3.4.8. Вестерн-блот 67
3.4.9. Идентификация белков методом масс-спектрометрии 67
3.5. Реактивы 68
Результаты 69
4.1. Сравнительный анализ действия различных кардиотонических стероидов (КТС) как ингибиторов Na,K-ATPa3bi и индукторов независимого от [Na+]| и [К+]{ онкоза эпителиальных клеток линии C7-MDCK
4.2. Идентификация сигнального каскада, 88
вовлеченного в развитии клеточной смерти, вызванной КТС
4.2.1. Роль кальция в развитии смерти клеток под действием уабаина
4.2.2. Роль Ras, PI3K и протеинкиназ в развитии смерти клеток, вызванной уабаином
4.2.3. Роль активных форм кислорода (АФК) в индукции смерти клеток под действием уабаина
4.2.4. Роль белков цитоскелета в индукции смерти клеток под действием уабаина
4.2.5. Установление роли кавеол в индукции клеточной смерти под действием уабаина
4.2.6. Роль экспрессии генов de novo в индукции смерти клеток под действием уабаина
4.2.7. Роль рН в развитии смерти клеток под действием уабаина
4.3. Выявление белков, взаимодействующих с Na,K- 114 АТРазой
4.4. Идентификация белков, взаимодействующих а-субьединицей Na,K-ATPa3bi в ответ на связывание уабаина
Обсуждения результатов 152
5.1. Сравнительный анализ действия КТС 152
5.2. Идентификация Na ДС*"-независимого сигнального каскада, запускаемого КТС и приводящего к смерти эпителиальных клеток
5.2.1. Роль известных сигнальных каскадов, запускаемых КТС
5.2.2. РольрН 160
5.3. Идентификация белков, взаимодействующих а-субъединнцей Na,K-ATPa3bi
Заключение 170
Выводы 175
Список литературы 176
Введение к работе
Na,K-ATPa3a (№,К-активируемая, Mg-зависимая аденозинтрифосфогидролаза, КФ 3.6.1.3) была впервые описана Йенсом Скоу в 1957 году (Skou, 1957). Фермент присутствует в плазматической мембране всех клеток животных и осуществляет электрогенный обмен трех ионов внутриклеточного Na+ на два иона внеклеточного К+, используя для транспорта ионов энергию, высвобождающуюся при гидролизе АТР.
Na,K-ATPa3a состоит из полипептидных цепей двух типов, названных а- и Р-субъединицами. а-Субъединица имеет молекулярную массу около ПО кДа, а Р-субъединица представляет собой гликопротеид, и в зависимости от степени гликозилирования её молекулярная масса в различных тканях составляет от 40 до 60 кДа. а-Субъединица Na,K-ATPa3bi, содержащая участки связывания АТР, натрия и калия, способна полностью выполнять каталитическую функцию и в процессе каталитического цикла подвергается фосфорилированию-дефосфорилированию. Р-Субъединица является существенным компонентом Na,K-АТРазы, хотя непосредственного участия в катализе эта субъединица не принимает, но влияет на транспортные функции фермента, изменяя сродство к ионам К+. р-субъединица играет важную роль в поддержании нативной структуры каталитической субъединицы №,К-АТРазы. В составе очищенных препаратов Ыа,К-АТРазы почек кроме а- и р-субъединиц присутствует белковый компонент, ассоциированный с Na-насосом, и который был назван у-субъединицей (Forbush et ah, 1978). В препаратах фермента, полученных из других источников, у-субъединица не выявлена, и, по-видимому, её присутствие не является обязательным. В связи с этим принято считать, что Иа,К-АТРаза состоит только из двух типов субъединиц.
Известно, что Na,K-ATPa3a играет ключевую роль в регуляции концентрации внутриклеточных одновалентных катионов, в поддержании мембранного потенциала, объема клетки, сопряженного транспорта Na+ и аминокислот, глюкозы, нуклеотидов и некоторых ионов (например, Са2\ Н+) через плазматическую мембрану (Lang et al., 2000; Mongin, Orlov, 2001; Blanco, Mercer, 1998). Неудивительно, что ингибирование данного фермента влияет на целый ряд процессов в клетке. Так, например, уабаин и другие кардиотонические стероиды (КТС), ингибирующие Ыа,К-АТРазу путем взаимодействия с её а-субъединицей, приводят к повышению внутриклеточной концентрации Na+, что в свою очередь активирует Na+/Ca -обменник и потенциал-активируемые Са2+ каналы (Lang et al., 1998; Lang et al., 1992). При этом возрастает уровень внутриклеточного Са2+, что ведет к увеличению сокращения кардиомиоцитов (Blastein, Lederer, 1999).
За последнее время появилось большое количество работ, свидетельствующих о том, что помимо основной функции Ыа,К-АТРазы, связанной с поддержанием неравновесного распределения Na+ и К+, этот фермент выступает в роли рецептора кардиотонических стероидов, способного вызывать изменения функционального состояния клеток. В настоящее время получены многочисленные данные, показывающие, что кардиотонические стероиды, ингибируя активность Na,K-ATPa3bi, вызывают также активацию некоторых сигнальных каскадов клетки. Среди них сигнальные каскады с участием протеинкиназ Ras/Raf/MEK/Erkl/2 (р42/44 МАРК) (Kometiani et al., 1998) и аісгивньїх форм кислорода (Хіе et al., 1999), активация которых в свою очередь влияет на экспрессию ряда генов (Xie et al., 2002; Taurin et al., 2003), включая гены, вовлеченные в регуляцию пролиферации клеток и программированной клеточной смерти (апоптоза) (Orlov et al., 2005; Taurin et al., 2003). Для клеток гладкой мускулатуры сосудов (VSMC) был обнаружен защитный эффект уабаина, предотвращающий развитие апоптоза клеток, вызванного отсутствием ростовых факторов (Orlov et al., 1999). Было установлено, что важную роль в аптиапоптотическом действии уабаина играет повышение внутриклеточного содержания [Na+]i, что ведет к экспрессии антиапоптотических генов (Taurin et al., 2002а; Taurin et al., 2002b).
Недавно в лаборатории Орлова С.Н. было показано, что, в отличие от VSMC, в эпителиальных клетках почек собаки (C7-MDCK) под действием уабаина наблюдается активация сигнального каскада, приводящего к смерти клеток независимо от возрастания внутриклеточного соотношения [Na+]/[K+]j (Pchejetski et al., 2003). Это позволило предположить, что могут существовать такие КТС, которые эффективно ингибируют Na.K-АТРазу, не влияя на жизнеспособность клеток, и наоборот. Помимо клеток линии C7-MDCK, длительное воздействие уабаина приводит к гибели ряда других типов клеток, включая эндотелиальные клетки аорты свиньи (РАЕС) и эпителиальные клетки кишечника человека (Сасо-2) (Orlov et al., 2005). Как и в случае C7-MDCK клеток, смерть клеток линии РАЕК и Сасо-2 не зависит от действия уабаина на внутриклеточное соотношение [Na1 Jj/[K4 ] j. До настоящего времени механизм развития смерти клеток, индуцированный уабаином, остается мало изученным. В первой части работы мы сравнили способность ряда кардиотонических стероидов ингибировать Na,K-Hacoc, изменять соотношение [Na+]j и [К+]\ и включать сигнальный каскад, приводящий к смерти клеток линии C7-MDCK. Во второй части работы мы предприняли попытку идентифицировать сигнальной каскад, запускаемый КТС в клетках линии С7-MDCK и независимый от внутриклеточного соотношения [Na "]j/[K+]j.C целью идентификации начальных звеньев этого каскада, мы исследовали влияние КТС на взаимодействие а-субъедииицы №,К-АТРазы с другими белками, применив метод иммунопреципитации, двумерного электрофореза и масс-спектрометрии. Эти данные суммированы в заключительной части нашей работы.
