Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Ыа,К-АТРазы 10
Структура Ыа,К-АТРазы 10
Механизм функционирования Na,K-ATPa3bi 14
Изоформы Na,K-ATPa3bi 16
Синтез, топогенез и деградация Na,K-ATPa3bi 18
Роль Na,K-ATPa3bi в функционировании различных клеток и тканей 19
Роль Na,K-ATPa3bi в поддержании ионных градиентов Na+ иКҐ ив осуществлении
связанных с этим функций 19
Роль Ка,К-АТРазы в структурной организации клетки и клеточной адгезии 20
ft-субъединща Ыа,К-АТРазы-молекула клеточной адгезии. 21
Разделительные контакты 22
Регуляция активности Na,K-ATPa3bi 24
Белки семейства FXYD 25
Регуляция активности Ыа,К-АТРазы путем
фосфорилирования/дефосфорилирования 26
Регуляция активности Ыа,К~АТРазы посредством изменения количества молекул
фермента, расположенных в плазматической мембране 29
ЭНДОГЕННЫЕ ИНГИБИТОРЫ Na,K-ATPa3bi 32
Разновидности и свойства эндогенных ингибиторов Na,K-ATPa3bi 32
Параметры, характеризующие взаимодействие эндогенных ингибиторов Na,K-
АТРазы с ферментом 33
Белки крови, связывающие уабаин и уабаин-подобные соединения, Перенос
сердечных гликозидов внутрь клетки и обратно , 34
Na,K-ATPa3a- РЕЦЕПТОР НОВОГО КЛАССА ГОРМОНОВ -
КАРДИОТОНИЧЕСКИХ СТЕРОИДОВ 35
Роль Na,K-ATPa3bi в регуляции ионных потоков. Инотропный эффект
кардиотонических стероидов 35
Токсическое действие уабаина и других кардиотонических стероидов 37
2 Кардиотонические стероиды как стимуляторы роста клеток. Влияние на экспрессию
белков 38
Влияние кардиотонических стероидов на перестройки плазматической мембраны и
внутриклеточных везикул 40
Влияние кардиотонических стероидов на прикрепление клеток к субстрату и
межклеточную адгезию , 41
МЕЛИТТИН-ПОДОБНЫЕ БЕЛКИ И ИХ СВЯЗЬ С АТРазами Р-ТИПА 42
Структура и свойства мелиттина 42
Взаимодействие мелиттина с клеточными белками 43
Мел иттин-подобные белки 44
МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕСЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕЖБЕЛКОВЫХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ 46
Аффинная хроматография 46
Химические сшивки 46
Иммунопреципитация 47
Лиганд-блоттинг (протеин-оверлей) 47
Двугибридные системы 49
Иммуноцитохимические методы 50
Метод флуоресцентного резонанса 50
Микрочипы , 51
Влияние детергентов на белки 51
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 53
МЕТОДЫ 55
МАТЕРИАЛЫ 55
ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ 55
Получение фракции микросом из почек свиньи 55
Получение фракции микросом из солевых желез уток 56
Получение препарата очищенной Ыа,К-АТРазы 56
Выделение а-субъединицы Ыа,К-АТРазы 57
Получение поликлональных сывороток против alpl-изофермента Na,K-ATPa3bi, al-
субъединицы Na,K-ATPa3bi и мелиттина 57
Очистка сыворотки от альбуминов путем осаждения белков сульфатом аммония 58
Очистка антител на Ыа,К-АТРазу методом аффинной хроматографии 58
Очистка антител на мелиттин методом аффинной хроматографии 59
Выделение белков гомогената, взаимодействующих с антителами на мелиттин 59
АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 60
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA, enzyme-linked immunosorbent
assays) 60
Точечный твердофазный иммуноферментный анализ (dot-ELISA, dot enzyme-linked
immunosorbent assays) 60
Определение концентрации белка 61
Электрофорез по методу Леммли 62
Окрашивание гелей Кумасси бриллиантовым голубым G-250 (или R-250) 62
Окрашивание гелей серебром 62
Анализ результатов электрофореза 63
Иммуноблоттинг 63
Иммунопреципитация Ыа,К-АТРазы .....63
Авторадиография 64
Метод протеин-оверлей 65
Измерение активности Na,K-ATPa3bi 66
Измерение ингибирования Na,K-ATPa3bi мелиттином 67
Оценка степени олигомеризации Na,K-ATPa3bi в присутствии мелиттина 67
Включение флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) в препараты Ыа,К.-АТРазы солевых
желез утки и почек кролика 67
Измерение флуоресценции ФИТЦ-меченных препаратов Ыа,К-АТРазы из солевых
желез утки и почек кролика 68
Подготовка образцов для определения N-концевой последовательности белков по
методу Эдмана 68
Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа трипсинолизных
фрагментов 69
Компьютерный анализ последовательностей 69
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 70
Получение и характеристика поликлональных антител на ЫаД-АТРазу и мелиттин ....70 Выявление белков, взаимодействующих с Ыа,К-АТРазой, с использованием метода
иммунопреципитация 73
Подбор условий для проведения иммунопреципитации 73
Иммунопреципитация Na,K-ATPa3bi в комплексе со взаимодействующими с ней
белками 78
Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-ATPa3oft, с использованием метода
протеин-оверлей 84
Влияние уабаина на белки, преципитирующие совместно с Na,K-ATPa30fi 86
Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-ATPa3oS и фосфорилируемых
эндогенными протеинкиназами 89
Влияние мелиттина на ферментативную активность и олигомерное состояние Na,K-
АТРазы 90
Исследование взаимодействия Ыа,К-АТРазы с мелиттин-подобными белками 93
Выделение мелиттин-подобных белков 93
Взаимодействие мелиттин-подобных белков с Na,K-ATPa30U 94
Идентификация мелиттин-подобного белка 67 кДа 99
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 105
ВЫВОДЫ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ANF — натриуретический фактор предсердий (atrial natriuretic factor)
АР-1 -адапторный белок 1 (adaptor protein 1)
АР-2 - адапторный белок 2 (adaptor protein 2)
ATP - аденозинтрифосфат
cAMP - циклический аденозин-3\5'-монофосфат
DARPP-32 - белок с молекулярной массой 32 кДа, регулируемый дофамином и с AMP (dopamine- and cAMP-regulated 32-kDa protein)
dot-ELISA - точечный твердофазный иммуноферментный анализ
ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ (enzyme-linked immunosorbent assay)
EGFR - рецептор эпидермального фактора роста (Epidermal Growth Factor Receptor)
Erk'/i - киназы 1 и 2, регулируемые внеклеточными сигналами (Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2)
FAK. — киназа фокальной адгезии (focal adhesion kinase)
FRET - метод флуоресцентного резонанса (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
HPLC - жидкостная хроматография под высоким давлением
IRS —субстрат инсулинового рецептора
МАРК - митогенактивируемая протеинкиназа
MDCK. - клеточная линия из почек собаки (Madin Darby Canine kidney)
MDR - белки, ответственные за множественную лекарственную устойчивость (multidrug resistanse)
МЕК - MAPK/ERK киназы
MOPS - 3-(К-морфолино)сульфоновая кислота
NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
NF-kB - ядерный фактор кВ (nuclear factor kappa В)
PBS - фосфатно-солевой буфер
PBST - фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,05% Tween -20
РІЗ К. - киназа-3-фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата
PLAP - белки, активирующие фосфолипазу А2 (phospolipase А2 activating protein)
PMSF - фенилметансульфонилфторид
pNPP -л-нитрофенилфосфат
PP1 - протеинфосфатаза 1
PP2A - протеинфосфатаза 2А
SDS - додецилсульфат натрия
SNARE - растворимый чувствительный к N-этилмалеимиду фактор, обеспечивающий прикрепление белков (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)
TCF/LEF - Т-клеточный транскрипционный фактор/лимфоидный транскрипционный фактор (Т cell-specific transcription factor (TCF)/lymphoid enhancer factor (LEF))
БСА - бычий сывороточный альбумин
ДАБ — 3,3'-диаминобензидин
ДМФА — диметилформамид
ДТТ - дитиотреитол
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
ПААГ - полиакриламидный гель
ПК - пируваткиназа
ПКА - протеинкиназа А
ПКС — протеинкиназа С
СР - саркоплазматический ретикулум
СФК - свободные формы кислорода
ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат
ФЕГЇ - фосфоенолпируват
ЭГТА - (этилендиокси)диэтилендинитрилотетрауксусная кислота
ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭПР — эндоплазматический ретикулум
Введение к работе
Na,K-ATPa3a представляет собой олигомерный интегральный белок плазматической мембраны клеток животных, состоящий из субъединиц двух типов: каталитической а-субъединицы с молекулярной массой около 100 кДа и регуляторной р-субъединицы, являющейся гл и ко протеидом с молекулярной массой около 55 кДа. Основная функция этого фермента заключается в поддержании гомеостаза ионов натрия и калия: Na.K.-АТРаза осуществляет АТР-зависимый перенос ионов натрия наружу, а ионов калия внутрь клетки. Образующийся ионный градиент используется для поддержания объема и мембранного потенциала клеток, обеспечения вторичного транспорта различных веществ, например ионов кальция и фосфата, аминокислот, Сахаров и др.
Благодаря своей значимости и разнообразию функций, активность №,К-АТРазы во всех тканях тонко регулируется со стороны как нервной, так и эндокринной системы. В течение последних трех десятилетий механизмы регуляции интенсивно изучаются, однако несмотря на это большинство путей регуляции остаются недостаточно изученными, а в некоторых случаях и неизвестными.
В течение последнего десятилетия было установлено, что помимо своей классической функции, Na,K-ATPa3a выполняет еще одну, не менее важную — участвует в рецепции и передаче клеточных сигналов. Оказалось, что специфические ингибиторы Na,K-ATPa3bi, относящиеся к классу стероидных гликозидов и обнаруженные первоначально в растениях и слизи кожи амбифий, присутствуют также в организме человека и животных. В конце 90-х годов прошлого века было установлено, что такие сердечные гликозиды, как уабаин и дигоксин, синтезируются в надпочечниках и гипоталамусе млекопитающих и являются гормонами, оказывающими различное влияние на разные ткани,
В настоящее время наиболее полно изучено влияние уабаина на кардиомиоциты. Связывание этого сердечного гликозида с №,К-АТРазой приводит к активации двух различных, хотя и тесно взаимосвязанных, путей регуляции жизнедеятельности клетки. С одной стороны, ингибирование Ыа,К-АТРазы вызывает повышение внутриклеточной концентрации натрия, в результате чего активируется Ыа+/Са2+-обменник, который переносит ионы кальция внутрь клетки. За счет увеличения концентрация ионов кальция в цитоплазме усиливается сократимость миоцитов (положительный инотропный эффект уабаина). С другой стороны, взаимодействие уабаина с Na,K-ATPa3ofi приводит к активации экспрессии определенных генов, в том числе актина, натриуретического фактора из предсердия, аЗ-субъединицы Na,K-ATPa3bi (Kometiani P. et al., 1998), a также
»^
8 генов раннего ответа, например, c-Fos и c-Jun, и к ингибированию экспрессии маркерных генов позднего ответа (ХІе Z., Askari А., 2002). Изменение экспрессии белков в конечном счете приводит к гипертрофии кардиомиоцитов. Показано, что в результате связывания уабаина с Ыа,К-АТРазой происходит ее взаимодействие с Src-киназой, сопровождающееся активацией тирозинкиназ, повышается уровень активных форм кислорода, играющих в клетке роль вторичных мессенджеров, активируется МАР-киназный каскад. Известно, что уабаин оказывает похожее влияние на гладком ышечные клетки сосудов и скелетные мышцы (ХІе Z., Askari А,, 2002). Однако в настоящее время ясно, что в разных тканях уабаин и его аналоги могут вызывать совершенно разные эффекты. На данный момент точный механизм влияния уабаина и причина дифференцированного воздействия сердечного гликозида на клетки различного происхождения неясна.
Известно, что АТРазы Р-типа, к которым относится и Na,K-ATPa3a, ингибируются пептидом из яда пчелы, мелиттином, образующим амфипатическую а-спираль. Установлено, что мелиттин влияет на функционирование некоторых белков, участвующих в передаче клеточных сигналов, например активирует фосфолипазу Аг и взаимодействует с кальмодулином, препятствуя связыванию с ним эффекторных белков. Мелиттин непосредственно взаимодействует с каталитической субъединицей Са-АТРазы саркоплазматического ретикулума и а-субъединицей Н,К- и Na,K-ATPa3. Во многих тканях обнаружены белки, взаимодействующие с антителами на мелиттин, то есть имеющие в своем составе структуры, похожие на него. Представителями таких белков являются белки-активаторы фосфолипазы Ai, относящиеся к семейству G-белков, и мелиттин-подобный белок, взаимодействующий с Н,К- и Са-АТРазой. Установлено, что эти белки участвуют в передаче клеточных сигналов, регуляции роста клеток и способны подавлять развитие раковых опухолей. Возможно, что мелиттин-подобные белки способны взаимодействовать с Na,K-ATPa3ofi, имеющей в своем составе участок связывания мелиттина, и принимать участие в передаче клеточных сигналов от этого фермента или в регуляции самого ионного насоса.
Таким образом, выявление и идентификация белков, непосредственно взаимодействующих с Na,K-ATPa3ofi в различных тканях при различных условиях, является очень важной задачей, позволяющей понять механизмы регуляции активности самого фермента, а также его роли в передаче внутриклеточного сигнала. В настоящее время интенсивно развиваются технологии изучения межбелковых взаимодействий, позволяющие понять механизмы передачи клеточных сигналов, однако практически все они направлены на исследование растворимых белков, тогда как межбелковые взаимодействия мембранных белков ввиду отсутствия подходов для их изучения часто
9 остаются неизученными. Поэтому прежде чем приступать к изучению белков, взаимодействующих с Ыа,К-АТРазой, необходимо разработать методы, позволяющие работать с мембранными белками.
В настоящей работе предпринята попытка использовать методы иммунопреципитации и протеин-оверлей для выявления комплексов Na,K-ATPa3bi со взаимодействующими белками, исследовать влияние уабаина на взаимодействия белков с этим ферментом и идентифицировать один из белков-партнеров Na,K-ATPa3bi.
