Введение к работе
Актуальность проблемы. К группе оболочечных вирусов относятся многие опасные патогены, в том числе вирусы гриппа и респираторных инфекций, а также гепатитов, герпеса, геморрагических лихорадок, иммунодефицита человека и многие другие. Вакцино-профилактика в случае вируса гриппа А осложнена высокой изменчивостью поверхностных антигенов вириона. К препаратам, наиболее широко применяемым в настоящее время для лечения гриппа - ингибиторам ионного канала (белка М2) ремантадинового ряда и ингибиторам нейраминидазы - занамивиру и озелтамивиру достаточно быстро возникает резистентность. Таким образом, проблема профилактики и лечения вирусных инфекций не решена, несмотря на неустанный активный поиск и дизайн новых антивирусных препаратов (Vanderlinden & Naesens, 2013). В связи с этим не ослабевает актуальность фундаментального изучения структуры отдельных компонентов вириона и их взаимодействий, с целью целостного понимания сложной картины патогенеза оболочечных вирусов и в перспективе, для разработки новых антивирусных стратегий.
Оболочечные вирусы объединяет наличие липопротеиновой оболочки вокруг
нуклеокапсида, которую вирион получает при «выпочковывании» с клеточной
мембраны. На Рис. 1, А схематически представлен вирион вируса гриппа А,
типичного представителя семейства Orthomixoviridae. Нуклеокапсид включает 8
сегментов однонитевой РНК негативной полярности в комплексе с нуклеопротеином
(NP) и белками полимеразного комплекса (РВ1, РВ2, РА).
А Б
Нейраминидаза Гемагглютинин на ha-na na
Рис. 1. А: Схема вириона вируса гриппа А. В липидный бислой встроены «шипы» гликобелков НА, NA и белок М2 - ионный канал. Слой белка М1 ассоциирован с мембраной. Б: Реконструкция фрагмента оболочки вириона по данным криоэлектронной томографии и рентгеноструктурного анализа (Harris et al., 2006).
В состав оболочки вириона входят два гликопротеина, образующие «шипы»: мажорный гемагглютинин (НА) образует гомотримеры, а менее представленная по числу копий неираминидаза (NA) - гомотетрамеры (Рис. 1, А, Б). Гемагглютинин отвечает за связывание вириона с клеткой-мишенью и слияние вирусной и эндосомальной мембран при кислом рН, что обеспечивает проникновение генома вируса в цитоплазму клетки. Кроме того, НА является основным вирусным антигеном. Неираминидаза - фермент, который отщепляет сиаловую кислоту от клеточных рецепторов и способствует распространению вновь образованных вирионов от клетки к клетке. Минорный белок М2 (гомотетрамер) совмещает функции ионного канала и «отшнуровки» дочерних вирионов от плазматической мембраны клетки (Rossmann, 2010). К вирусной мембране изнутри прилегает слой молекул матриксного белка М1 - основного структурного белка вириона. Полагают, что белок М1 взаимодействует как с внутривирионными сегментами интегральных белков НА, NA, М2, так и рибонуклеокапсидом, обеспечивая сборку всех компонентов для формирования компетентных вирионов.
Данные рентгеноструктурного анализа (РСА) получены для водорастворимых структурно стабильных фрагментов поверхностных белков: «головы» NA (Рис. 1, Б) и эктодоменов НА (Рис. 1, Б & 2, А). Закристаллизованы также NM-фрагмент белка М1 и фрагмент М2, включающий ТМ-домен и амфифильную а-спираль в СТ-домене.
НА2(1-221)
НА,(1-328)
липидная мембрана
,76 ЛИНКЄР ,85 211
S S S
6=0 с=ос=о
жирные кислоты
Рис. 2. Схема гомотримерного эктодомена (А) и мономера (Б) молекулы НА штамма ;hi/2/68 (H3N2). ТМ-трансмембранный домен, СТ-цитоплазматический домен.
кис. z. ихема гомотримерного эктооомена (aj и мономера (Ь) молекулы п
A/Aichi/2/68 (H3N2). ТМ-трансмембранный домен, СТ-цитоплазматическиі Объяснения - в тексте.
Мономер НА состоит из двух полипептидных цепей (НА1 и НА2), связанных дисульфидной связью (Рис. 2, Б). «Тяжелая» цепь НА1 и большая часть «легкой»
цепи НА2 входят в состав гомотримера эктодомена (Рис. 2, А). Заякоривающий (С-концевой) сегмент цепи НА2, который остается в мембране вириона после удаления эктодоменов бромелаином, включает (1) линкерную область, (2) трансмембранный (ТМ) домен (подчеркнуто) и (3) внутривирионный, или цитоплазматический (СТ) домен. В то время как эктодомен гемагглютинина при кислом значении рН радикально перестраивается, гомотримерный комплекс ТМ-доменов сохраняет свою структурную целостность, создавая необходимое напряжение для формирования и расширения поры слияния. Пространственная организация гомотримера ТМ-доменов не определена. Отсутствует информация и об архитектуре «ножки» «шипа», включающей гомотример линкерных последовательностей, которые также несут функциональную нагрузку при слиянии мембран.
На сегодняшний день описаны 17 антигенных подтипов НА вируса гриппа А, которые согласно З-О-структуре эктодоменов образуют две эволюционные группы: Группу-1 (Н1-Группа) и Группу-2 (НЗ-Группа), включающие 3 клада (Н1, Н2, Н5, Н6, Н17); (Н8, Н9, Н12); (Н11, Н13, Н16) и 2 клада (НЗ, Н4, Н14); (Н7, НЮ, Н15), соответственно (Nobusawa et al., 1991, Pica and Palese, 2013). Стоит отметить, что большинство используемых в настоящее время вакцин по-прежнему остаются Групп- и подтип-специфичными. У вируса В антигенные подтипы не выделяют.
Структурные различия гомотримерных комплексов ТМ-доменов и линкерных последовательностей в контексте разных эволюционных Групп НА систематически не изучались. Можно предположить, что изучение этих характеристик, в частности, поможет лучше понять экспериментально наблюдаемые различия в параметрах слияния мембран при участии НА подтипов Н1, Н2 и НЗ (Korte et al., 1997; 1999).
Особое внимание в данной работе уделено крайне консервативной модификации определенных остатков цистеина в С-концевой области НА остатками высших жирных кислот (Рис. 2, Б). Эта пост-трансляционная модификация -пальмитилирование, или S-ацилирование - была обнаружена у вирусных белков более 30 лет назад (Schmidt & Schlessinger, 1979). Достаточно рано было показано, что не только пальмитиновая (гексадекановая, С 16:0), но и жирные кислоты других типов могут ковалентно присоединяться к белку (Schmidt, 1984). Однако настоящий интерес к этой липидной модификации возник недавно, когда были найдены ферменты - DHHC-ацилтрансферазы, выполняющие функцию переноса остатка жирной кислоты на клеточные белки-субстраты (Linder & Deschenes, 2007). В геноме человека закодировано 23 таких фермента, но ни для одного из них пока не показана функция S-ацилирования какого-либо белка вируса.
Остатки высших жирных кислот, по-видимому, присоединяются к гемагглютинину вируса гриппа в раннем Гольджи, после тримеризации белка (Veit, 1993). Все 17 антигенных подтипов НА вируса гриппа А содержат как минимум три обязательных сайта ацилирования: один расположен у большинства подтипов на С-конце ТМ-домена и два - в СТ-домене (Рис. 2, Б). Специфического паттерна «узнавания» для пальмитилирования (как, например, в случае гликозилирования), не найдено. Однако остатки цистеина, которые локализованы у НА ряда подтипов в середине ТМ-домена (Рис. 2, Б), никогда не связывают остатки жирных кислот.
Данные о структурных предпочтениях остатков жирных кислот разной химической природы и единое представление относительно функции S-ацилирования в вирионе отсутствуют. Установлено, что пальмитилирование НА не требуется ни для прикрепления белка к мембране, ни для его внутриклеточного транспорта по эндоцитозному пути на поверхность вириона (Veit et al., 1991). Однако модификация жирными кислотами существенна для репликации вируса, поскольку рекомбинантные частицы, содержащие мутантные молекулы НА с заменой более одного сайта ацилирования, либо (в зависимости от штамма) очень плохо продуцируются, либо не продуцируются вовсе при получении их методом обратной генетики (Chen et al., 2005; Wagner et al., 2005).
До сих пор нет четкого понимания, на какой из стадий жизненного цикла вируса эта модификация необходима: влияют ли ковалентно связанные остатки жирных кислот на процесс слияния мембран и/или сборки дочерних вирионов и вовлечены ли они во взаимодействия с другими белками вириона. Ситуация осложняется разноречивыми экспериментальными данными, полученными для разных антигенных подтипов НА. Тип остатка жирной кислоты представляет особенный интерес, поскольку углеводородные цепи, различающиеся по длине только на два углеродных атома, демонстрируют значительную разницу в гидрофобности. Этот параметр может влиять на силу взаимодействия белка с мембраной и на силу белок-белковых взаимодействий.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является исследование структуры С-концевой области (заякоривающего сегмента) гемагглютинина вируса гриппа и поверхностных белков других оболочечных вирусов и анализ ее роли в формировании вирионов.
Для достижения вышеописанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Создать подход для исследования структурных свойств надмолекулярного комплекса линкерных последовательностей - «ножки» «шипа» гемагглютинина
вируса гриппа разных антигенных подтипов/типов;
-
Разработать методологию изучения гомотримерной ассоциации трансмембранных доменов гемагглютинина вируса гриппа с применением экспериментальных подходов и компьютерного моделирования;
-
Отработать протокол анализа пост-трансляционной модификации остатками высших жирных кислот (S-ацилирования) поверхностных белков, выполняющих функцию слияния мембран. Использовать в качестве объекта гемагглютинин вируса гриппа и ряд белков других семейств оболочечных вирусов. Сформулировать концепцию о полноте и гетерогенности S-ацилирования белка в составе вириона;
-
Создать экспериментальные модели для исследования структурной и биологической значимости S-ацилирования вирусных белков, включая (1) серию лабораторных реассортантов вируса гриппа А с поверхностными и внутренними белками, полученными от разных родительских штаммов/хозяев; (2) синтетический пептид, стехиометрически алкилированный гексадекановыми алифатическими цепями (имитирующими пальмитилирование), встроенный в липидные везикулы;
-
Изучить с применением современных методик молекулярного моделирования принципиальную возможность участия остатков жирных кислот в образовании гомотримерного комплекса трансмембранных доменов гемагглютинина при формировании вирионов.
Решение поставленных задач должно было дать новую структурную информацию о сегментах белков, входящих в состав оболочки вириона, изучение пространственной организации которых методом РСА затруднено.
Научная новизна и практическая значимость работы. Современное представление о патогенезе вируса гриппа и других оболочечных вирусов, среди которых описано много опасных патогенов человека и животных, предполагает понимание молекулярных перестроек белков вириона при проникновении вируса в клетку и морфогенезе дочерних вирионов. Однако экспериментальных исследований для понимания роли каждого компонента вириона в жизненном цикле вируса и его взаимодействия с системой везикулярного транспорта в клетке недостаточно. Это определяет актуальность исследования особенностей структуры поверхностных белков оболочечных вирусов, в частности, гидрофобных сегментов белков, встроенных в липидную мембрану. Кроме того, в связи с высокой изменчивостью вируса гриппа, риском новых пандемий и крайне скромным арсеналом средств борьбы с ним в эпидемических условиях, существует острая необходимость планирования и разработки новых антивирусных стратегий. В связи с этим выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия
хозяина и патогена, представляется актуальным.
Протеолиз целых вирионов был впервые предложен в качестве подхода для изучения структурной организации области «ножки» шипа, включающей гомотример линкерных участков. Обнаружено, что локализация сайтов гидролиза ферментами разных классов определяется, главным образом, стерической доступностью зоны расщепления для молекулы фермента, а не собственно специфичностью фермента. В перспективе не исключена возможность прицельного разрушения поверхностных гликопротеинов специально подобранными ферментами с целью ограничить распространение вирусной инфекции.
Гидролиз протеазами поверхностных белков, выделенных из интактных вирионов неионным детергентом, непосредственно в мицелле, был предложен как способ экспериментального анализа упаковки трансмембранных доменов белков в составе природных олигомеров. Обнаруженные различия в гомотримерной упаковке трансмембранных доменов у гемагглютининов разных эволюционных групп вируса гриппа А, подтвержденные данными компьютерного моделирования, проясняют, почему невозможно формирование «смешанных» тримеров НА подтипов Н1 и НЗ, Н1 и Н7 (Sklyanskaya е al., 1988).
S-ацилирование вплоть до недавнего времени детектировали на основании метаболического мечения вирусов [ЗН]-пальмитатом и выяснения, в какой белок включается метка. Последующий хроматографический анализ пула связанных жирных кислот (Veit, 1991) не давал точной информации ни о полноте S-ацилирования белка, ни о типах реально присоединенных к белку остатков жирных кислот, ни об их распределении по потенциальным сайтам. Показано, что в клетке могут происходить метаболические трансформации меченого пальмитата в другой тип жирной кислоты еще до присоединения к белку (Schmidt, 1984). Мы предложили экстрагировать ацилированные пептиды в органическую фазу (сходно с методом экстракции липидов) из обработанных протеазами вирионов. Успешное применение масс-спектрометрического (МС) анализа для детекции гидрофобных пептидов привело к созданию уникального протокола, который до сих пор не имеет аналогов в мире.
Впервые показано, что в составе вирионов молекулы НА ацилированы
стехиометрически: все потенциальные сайты модифицированы остатками жирных
кислот. Далее, обнаружено дифференциальное S-ацилирование остатками
пальмитата (С16:0), либо стеарата (С 18:0) в зависимости от локализации сайта
ацилирования относительно границы липидного бислоя: только остаток цистеина,
расположенный на границе ТМ- и СТ-доменов, может связать стеарат, в то время
как остатки цистеина в СТ-домене ацилированы исключительно пальмитатами.
Выдвинутая гипотеза о локализации стеарата на остатке цистеина, расположенном на границе ТМ- и СТ-доменов, оказалась верной в случае гемагглютининов всех типов вируса гриппа, а также всех исследованных представителей «сливающих» белков других семейств оболочечных вирусов. Принципиально разный характер ацилирования, который был обнаружен у НА вирусов гриппа А, В и гомологичного белка гемагглютинин-эстеразы (HEF) вируса гриппа С может быть использован для типирования новых штаммов вируса гриппа.
Впервые предпринята попытка оценить биологическую роль S-стеарилирования в экспериментальной модели, использующей серию лабораторных реассортантных клонов, включающих NA и/или НА одного штамма, а внутренние белки - другого. Показано, что ни нейраминидаза, ни белки М1/М2 не влияют на гетерогенность S-ацилирования гомотримера НА в процессе созревания вирионов.
Впервые исследованы свойства пептида из 47 аминокислотных остатков, соответствующего С-концевой области штамма A/FPV/Rostock/34 (H7N1), синтезированного в бесклеточной системе (Khabibullina et al., 2010, Mineev et al., 2011) и модифицированного гексадекановыми (С 16:0) алифатическими цепями с целью имитировать пальмитилирование.
Значительная часть представленных в данной работе данных относится к вирусу гриппа, однако это не умаляет общности применения разработанных подходов для исследования белков других оболочечных вирусов, а также эукариотической клетки.
Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании ученого совета НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ. Результаты, изложенные в диссертации, неоднократно представлялись на российских и международных научных конференциях. Материалы работы докладывались на Европейских Вирусологических конгрессах (EVC-2007, ECV-2010), конференции Биохимического Общества Великобритании «Регуляция движения и функции белков при помощи пальмитилирования» (2012), конференции Федерации Американских обществ экспериментальной биологии (FASEB) "Модификация белков липидами, ее сигнальная функция и мембранные домены" (2013), Европейских и Американских пептидных симпозиумах с 2004 по 2007 гг., Китайском пептидном симпозиуме (2006), Российских симпозиумах «Белки и пептиды» (2007, 2011), Московских конференциях по вычислительной молекулярной биологии МССМВ (2007, 2009, 2011), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), а также на конференциях Немецкого общества вирусологов (2008, 2010, 2012),
Российско-Германских научных семинарах (Берлин, 2007, 2008, 2009) и на школе-
конференции для молодых ученых «Методы изучения вируса гриппа», проведенной в рамках Германо-Российского года науки, образования и инноваций (2011) на базе Института иммунологии и молекулярной биологии факультета Ветеринарной Медицины Свободного Университета г. Берлин (Германия).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 17 работ в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в том числе 2 обзорные статьи в журналах Биохимия и Biochemical Society Transactions, а также экспериментальные статьи в ведущих международных и Российских рецензируемых журналах, включая Journal of Virology, Virology, Biochimica et Biophisica Acta, Virus Research, Archives of Virology, Protein and Peptide Letters, Молекулярная биология, Вопросы вирусологии. Также опубликованы материалы работы Российских и международных конференций - 17.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на
