Введение к работе
Актуальность работы. Антитела к поверхностным антигенам вируса гриппа - гемагглютинину (НА) и нейраминидазе (NA) - являются одними из основных факторов, определяющих восприимчивость человека к гриппозной инфекции. Защитное действие антител к NA заключается в снижении частоты инфицирования и доли клинически выраженных форм при естественной инфекции дрейфовыми и шифтовым вариантами вируса гриппа A (Naikhin A.N., 1983; Найхин А.Н., 1986; Monto A.S., 1973). Однако неразрешенным остается вопрос о возможном вкладе антинейраминидазных антител наряду с Т-клетками памяти в гетеросубтипическую защиту в условиях смены подтипа НА, к примеру, при прогнозируемой адаптации и внедрении в циркуляцию высокопатогенных штаммов A(H5NI). Исследования в области перекрестной защиты и представленности в человеческой популяции антинейраминидазных антител, перекрестно реагирующих с NA пандемических и потенциально пандемических штаммов вируса гриппа, на настоящий момент немногочисленны (Sandbulte M.R., 2007; Pichyangkul S., 2009; Marcelin G., 2010).
Традиционно иммуногенность гриппозных вакцин оценивается исключительно по формированию сывороточных антигемагглютинирующих антител. Оценка поствакцинальных титров антинейраминидазных антител в сыворотке крови проводится редко. Работы датируются в основном 70-80 годами 20 века и были выполнены с привлечением имевшихся на тот момент методик, не предоставлявших возможности инструментального учета результатов или предполагавших использование токсичных реагентов в сложном каскаде химических реакций (Jennings R., 1981; Naikhin A.N., 1983; Кустикова Ю.Г., 1983; Найхин А.Н.,1986; Иванова В.Т., 1991). На совещаниях Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2004, 2007 и 2008 гг. была отмечена немаловажность разработки новых либо усовершенствования и стандартизации уже существующих методов выявления гуморального иммунного ответа к NA вируса гриппа. Указанный класс методик может быть перспективен в качестве дополнительного критерия оценки иммуногенности вакцинных штаммов, что особенно актуально в случае апробации вакцинных препаратов против потенциально пандемических вирусов гриппа.
Цель исследования: изучить продукцию антинейраминидазных антител при иммунизации волонтеров живыми вакцинами против сезонного, пандемического и потенциально пандемического гриппа А.
Задачи исследования: 1. Подготовить и охарактеризовать диагностические реассортантные штаммы, содержащие NA пандемического и потенциально пандемического вирусов гриппа А, для использования в тестах, направленных на выявление антинейраминидазных антител.
-
Отработать методики определения сывороточных антител к нейраминидазе дрейфовых и шифтовых вирусов гриппа А с применением диагностических реассортантов.
-
С помощью адаптированной твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности (РИНА), модификации теста постадсорбционной микронейтрализации и иммуноферментного анализа оценить выработку гомологичных антинеираминидазных антител у волонтеров, привитых различными живыми гриппозными вакцинами (ЖГВ).
-
Охарактеризовать фон и поствакцинальную продукцию перекрестно-реагирующих антинеираминидазных антител к пандемическому штамму вируса гриппа A(H1N1) и вирусу гриппа птиц A(H5NI) у лиц различного возраста.
-
На модели экспериментальной гриппозной инфекции определить протективные свойства сывороточных антинеираминидазных антител.
Научная новизна работы.
-
Впервые проведена оценка иммуногенности пандемической ЖГВ подтипа A(H1N1) и ЖГВ потенциально пандемического подтипа Н5 по интенсивности выработки антинеираминидазных антител. Выдвинуто положение о целесообразности использования предложенных тестов для дополнительной характеристики иммуногенности вакцинных препаратов.
-
Впервые изучено формирование сывороточных антител, специфичных к NA пандемического штамма А(НШ1) и потенциально пандемического вируса птичьего гриппа A(H5N1), в клинических испытаниях сезонной трехвалентной ЖГВ. Показано, что выраженная стимуляция продукции иммуноглобулинов, перекрестно реагирующих с NA шифтовых вариантов вируса гриппа, у молодых людей 18-20 лет при однократном введении препарата отсутствует.
-
Впервые выявлен фон сывороточных перекрестно-реагирующих антител к NA вируса A(H5N1), а также к NA пандемического штамма A(H1N1) до его внедрения и на момент начала циркуляции в человеческой популяции по результатам обследования волонтеров различного возраста, проживающих на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области.
Практическая значимость работы. В результате выполнения работы автором подготовлен ряд оригинальных диагностических реассортантных штаммов, предназначенных для выявления сывороточных антител к NA дрейфовых и шифтовых вариантов вирусов гриппа, включая вирусы гриппа птиц A(H5N1) и пандемические штаммы A(H1N1) 2009 г. С учетом биологических свойств диагностических реассортантов модифицированы реакция постадсорбционной микронейтрализации (РПН) и твердофазная РИНА. Эти методы могут быть использованы для количественной характеристики индукции сывороточных антинеираминидазных антител у людей, привитых различными гриппозными вакцинами, а также для
5 определения уровня предсуществующего в человеческой популяции иммунитета к предполагаемым пандемическим штаммам вируса гриппа А. Основные полоз/сепия, выносимые на защиту.
-
Подготовленные и охарактеризованные диагностические реассортантные штаммы на основе вируса гриппа лошади A(H7N7), обладающие NA вирусов гриппа человека, птиц и пандемического штамма 2009 г., позволяют специфично оценивать сывороточные антинейраминидазные антитела в разработанных модификациях твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности и реакции постадсорбционной микронейтрализации, а также в иммуноферментном анализе.
-
Иммунизация сезонной, пандемической и прототипом пандемической ЖГВ в 1,2-2,4 раза увеличивает продукцию антител к нейраминидазе вакцинного вируса у волонтеров 18-60 лет.
-
Часть волонтеров отвечает на иммунизацию ЖГВ достоверным приростом гомологичных сывороточных антинейраминидазных антител в отсутствие сероконверсий антител к гемагглютинину вакцинного штамма. Определение антинейраминидазных антител в сыворотке крови предоставляет дополнительную информацию об эффективности стимуляции гуморального иммунного ответа гриппозными вакцинами против сезонного, пандемического и потенциально пандемического гриппа А.
-
Перекрестно-реагирующие антинейраминидазные антитела к штамму А/Калифорния/07/09(НШ1) обнаруживаются в сыворотках крови волонтеров 18-20 лет, обследованных еще до вступления пандемического вируса A(H1N1) в активную циркуляцию. Антинейраминидазные антитела к вирусу гриппа птиц А/Вьетнам/1203/04(H5N1) выявляются у обследованных лиц 18-20 лет, не имевших контакта с указанным штаммом.
Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов. Вклад соавторов заключается в проведении вакцинации и сборе материалов в клинических испытаниях с участием волонтеров. Автор выражает благодарность Гореву Н.Е. за подготовку диагностического реассортанта RNl/99-human A(H7N1) и Дониной С.А. за постановку реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с сыворотками крови клинически здоровых в отношении респираторных заболеваний волонтеров в возрасте 1-82 лет, собранными в августе-сентябре 2010 г. Научно-исследовательской лабораторией «Диагностика».
Внедрение результатов работы. Авторские диагностические реассортантные штаммы депонированы в Государственной коллекции вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России (номера депонентов: ГКВ № 2473, 2474, 2475). По теме работы получен 1 патент на изобретение. Подана 1 заявка на патент.
Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены на Международной конференции «New Cells for New Vaccines IV — Changing the Vaccine Landscape: Recombinant Systems» (Уилмингтон, штат Делавэр, США, 11-14 октября 2009), IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 25-26 февраля 2010 г.), Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г), Международной конференции «Options for the control of influenza VII» (Гонконг, Китай, 3-7 сентября 2010), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2010 года), Международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодёжь — медицине будущего» (Одесса, Украина, 28 - 29 апреля 2011 года).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах и сборниках научных статей (из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК), 1 патент РФ и 5 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 190 страницах текста, включая 22 таблицы и 22 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 197 источников. Из них 20 отечественных и 177 иностранных.
