Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Структурная организация капсидаВЯ 8
2.2. Структурно-функциональная организация генома ВЯ 9
2.3. Патогенез! ящура 14
2.4. Вакцинопрофилактика 18
2.5. Серодиагностика ящура 19
2.5.1. Выявление и типирование вируса 19
2.5.2. Дифференциация постинфекционных и поствакцинальных антител 21
2.6. Заключение по обзору литературы 35
3. Собственные исследования 37
3.1. Материалы 37
3.2. Методы 40
3.2.1. Выделение вирусной РІЖ из вируссодержащего материала 40
3.2.2. Расчет и синтез праймеров 40
3.2.3. ОТ-ПЦР 41
3.2.4. Молекулярное клонирование продуктов ПЦР 41
3.2.5. Нуклеотидное секвенирование 41
3.2.6. Экспрессия рекомбинантных белков 41
3.2.7. Очистка рекомбинантных белков 42
3.2.8. Электрофорез белков вПААГе 42
3.2.9. Непрямой вариант ИФА 42
3.2.10. Статистическая обработка результатов 43
3.3. Результаты собственных исследований 44
3.3.1 Конструирование плазмид, экспрессирующих рекомбинантные неструктурные белки ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура 44
3.3.2. Оптимизация условий экспрессии рекомбинантных белков ЗА, ЗВиЗАВ 46
3.3.3. Очистка рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ 49
3.3.4. Исследование антигенной активности и специфичности рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ 52
3.3.5. Исследование стабильности рекомбинантных белков ВЯ при хранении 52
3.3.6. Разработка непрямого варианта ИФА 53
3.3.7. Сравнение ИФА на основе ЗА-, ЗВ- и ЗАВ-антигенов 58
3.3.8. Разработка набора для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом 60
3.3.9. Разработка непрямого варианта ИФА для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура по одному разведению сывороток крови КРС 63
3.3.10. Разработка набора для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура по одному разведению сыворотки крови КРС в непрямом варианте ИФА 69
3.3.11. Использование наборов в серологических исследованиях 69
4.Обсуждение 73
5.Выводы 82
6.Практические предложения 83
7. Список литературы 84
Приложения 106
- Структурно-функциональная организация генома ВЯ
- Дифференциация постинфекционных и поствакцинальных антител
- Конструирование плазмид, экспрессирующих рекомбинантные неструктурные белки ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура
- Разработка набора для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом
Введение к работе
Актуальность темы. Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных, способное вызывать эпизоотии и наносить большой экономический ущерб. Для России постоянно существует опасность проникновения этой болезни из сопредельных азиатских государств, свидетельством чего являются вспышки ящура на территории РФ в 1995, 2000, 2004 и 2005г.г., вызванные заносом инфекции из Китая (20, 153). В этой ситуации разработка и совершенствование средств и методов диагностики ящура напрямую связаны с проблемой обеспечения зоосанитарной и экономической безопасности страны.
Возбудитель ящура - безоболочечный РНК-содержащий вирус семейства Picomaviridae, рода Aphthovirus. Геном вируса кодирует четыре структурных и восемь неструктурных белков. Обе группы белков вызывают выработку антител у животных во время инфекции. Однако у вакцинированных животных обнаруживаются антитела, в основном, к структурным протеинам. Это объясняется тем, что при изготовлении вакцины проводится частичная очистка вируса, в процессе которой большинство неструктурных белков удаляется вместе с клеточным дебрисом (40).
Обнаружение антител к неструктурным белкам вируса ящура является важным инструментом контроля за заболеванием. Этот метод позволяет дифференцировать вакцинированных животных от реконвалесцентов и выявлять бессимптомных вирусоносителей среди вакцинированного поголовья. В связи с тем, что Россия проводит политику противоящурной вакцинации скота вдоль своих южных границ, наличие диагностических средств, позволяющих обнаруживать в вакцинированных стадах инфицированных животных, чрезвычайно актуально.
В настоящее время на мировом рынке ветеринарных диагностикумов представлено несколько иностранных коммерческих тест-систем для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура. Они основаны на использовании в качестве антигенов синтетических пептидов или рекомбинантных белков вируса ящура, экспрессированных в E.coli или в бакуловирусной системе. Однако отечественных тест-систем до сих пор создано не было.
Цели и задачи исследования. Основная цель нашей работы заключалась в получении рекомбинантных антигенов и разработке на их основе иммуноферментной тест-системы, позволяющей выявлять антитела к неструктурным белкам вируса ящура.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- провести молекулярное клонирование и экспрессию в E.coli генов неструктурных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура;
- отработать условия экспрессии и очистки, обеспечивающие высокий выход рекомбинантных белков;
- исследовать антигенную активность и специфичность полученных белков;
- разработать на основе рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ иммуноферментные тест-системы для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура и сравнить их по чувствительности и специфичности между собой и с коммерческими наборами;
- на основе наиболее чувствительной и специфичной тест-системы разработать диагностические наборы для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови крупного рогатого скота;
- оценить с помощью разработанных наборов отечественные противоящурные вакцины на способность индуцировать антитела к неструктурным белкам вируса ящура у животных;
- применить разработанные наборы в диагностических исследованиях. Научная новизна исследования. Впервые в России получены рекомбинантные неструктурные белки ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура и на их основе разработаны иммуноферментные тест-системы для дифференциации вакцинированного и инфицированного КРС.
Показано, что ИФА на основе белка ЗА превосходит по диагностической чувствительности и специфичности ИФА на основе белков ЗВиЗАВ.
На основе ЗА-ИФА разработаны два отечественных диагностических набора для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом, позволяющие дифференцировать вакцинированный против ящура и инфицированный вирусом ящура КРС.
Практическая значимость исследований. В результате проведенных исследований были разработаны следующие методики:
«Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках КРС иммуноферментным методом», одобренная ученым советом и утвержденная директором Центра 30.09.04;
«Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении», одобренная ученым советом и утвержденная директором Центра 21.12.04.
На основе этих методик разработаны два диагностических набора: «Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом», одобренный ученым советом и утвержденный директором Центра 30.09.04;
«Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении», одобренный ученым советом и утвержденный директором Центра 21.12.04.
Публикации научных работ. По теме диссертации опубликовано три научных работы.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научной конференции «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» в 2004 году, на заседаниях ученого совета в 2003-2005 гг.
Основные положения, выносимые на защиту.
Рекомбинантные антигены ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура.
Иммуноферментные тест-системы на основе рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС и результаты их сравнительных испытаний.
Диагностический набор для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура методом последовательного разведения сывороток крови КРС.
Диагностический набор для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура методом одного разведения сывороток крови КРС.
Результаты серомониторинга ящура с использованием разработанных диагностических наборов за 2004-2005гг.
Структура и объем работы. Диссертация изложена 110 на страницах, иллюстрирована 12 рисунками и 12 таблицами. Список используемой литературы включает 192 источника, из которых 171 иностранный.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 2002-2005гг. в Федеральном центре охраны здоровья животных (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир).
Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю к.б.н. А.В. Щербакову и сотрудникам института: д.в.н. В.Л. Узюмову, к.в.н. А.В. Каныниной, СР. Кременчугской, к.б.н. Н.С. Мудрак, вед. биологу Н.В. Вавиловой, вед. вет. врачу Фоминой С.Н. - за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы и оформлении диссертации.
Структурно-функциональная организация генома ВЯ
Геном ВЯ, длиной около 8500 нуклеотидов представлен позитивной молекулой РНК. Вирусная РНК включает открытую рамку считывания, фланкированную двумя некодирующими областями на 3 - и 5 -концах. РНК-геном ВЯ не содержит на 5 -конце кэп-структуры 7-метил-О, необходимой для трансляции мРНК, а начинается с pUp. РНК пикорнавирусов на 5 -конце ковалентно соединена с коротким вирусным полипептидом VPg (ЗВ). Белок ЗВ, представленный в геноме ВЯ тремя копиями, играет роль праймера в репликации РНК (89, 191). 5 -нетранслируемая область, длиной около 1300 и.о., содержит короткий S-фрагмент, за которым следует участок, состоящий из 100 н.о. и содержащий около 90% С-остатков, с небольшим количеством U- и А-остатков (поли(С) тракт) (145). За S-фрагментом и поли(С) трактом расположен фрагмент РНК, длиной 700 и.о., который содержит высоко консервативные вторичные структуры, включающие тандемно повторяющиеся псевдоноты, си-активный репликативный элемент (cw-acting replication element, ere) и внутренний сайт связывания с рибосомой (the Internal Ribosome Entry Site, IRES), участвующий в инициации трансляции. Подобное сочетание элементов характерно только для вируса ящура. S-фрагмент, поли (С) и псевдоноты занимают первые 600 оснований генома вируса ящура. Предполагают, что S-фрагмент, поли(С) и псевдоноты участвуют в репликации генома вируса ящура. S-фрагмент, длиной в 360 и.о., обладает способностью закручиваться в длинную стебельковую петлю (185). Структура S-фрагмента, содержащая высокое число спаренных оснований, способна предотвращать экзонуклеазное расщепление вирусного генома в инфицированных клетках.
Обнаружение поли(С) тракта различной длины в геномах различных изолятов вируса ящура тут же привело к предположению о том, что поли(С) тракт играет определенную роль в патогенезе. Однако в дальнейшем было показано, что рекомбинантный ВЯ с поли(С) трактом, состоящим из двух С-остатков вирулентен для мышей (91). В настоящее время предполагают, что данная часть генома вируса ящура участвует в процессах жизненного цикла вируса (126). За поли(С)-трактом вируса ящура расположены три-четыре псевдонота (147). Псевдоноты также обнаружены в геноме вируса энцефаломиокардита, однако они расположены на 5 -конце перед поли(С)-трактом (68). Функция этих структур пока неизвестна.
За псевдонотами расположена шпилечная структура, являющаяся сге генома вируса ящура. Сге представляет собой стебельково-петлевую структуру с консервативным пентануклеотидом АААСА в области петли и является необходимым в репликации генома пикорнавирусов (128). Было показано, что замена в этой консервативной последовательности петли приводит к ингибиции репликации генома, но не оказывает влияния на трансляцию РНК (125). Все cre-последовательности, известные на сегодняшний день, находятся внутри рамки считывания генома каждого вируса, однако cre-структура вируса ящура находится в нетранслируемой области генома.
Непосредственно за cre-структурой расположен IRES-элемент вируса ящура, составляющий 450 нуклеотидов в длину (33, 148). IRES-элементы пикорнавирусов подразделены на три группы, имеющие различия в высоко консервативных вторичных и третичных структурах (46, 47, 188). Первая группа IRES встречается в геномах энтеро- и риновирусов, вторая группа обнаружена у афто- и кардиовирусов, третья группа - у гепатовирусов. Pilipenko и соавт. (46) сконструировали модель вторичной структуры IRES второй группы, проведя анализ известных нуклеотидных последовательностей, а также химического и ферментативного расщепления этих элементов. Согласно данной модели, IRES состоит из пяти доменов, некоторые из которых участвуют в регуляции трансляции. Более поздние исследования IRES вируса ящура показали, что эти домены взаимодействуют с рядом клеточных факторов, в том числе с эукариотическими факторами инициации (elF), необходимыми для кэп-зависимой трансляции (171).
Транслируемая область генома ВЯ кодирует единственный полипротеин, который расщепляется вирусными протеазами с образованием различных вирусных белков. Область Р1-2А кодирует структурные белки VP1, VP2, VP3 и VP4. Пептид 2А (16 а.о.) катализирует отщепление Р1-2А от 2С. Области L, Р2 и РЗ кодируют 8 различных неструктурных белков.
В пределах L-гена всех семи серотипов вируса ящура находятся два инициирующих кодона (84), с которых инициируется синтез протеинов Lab и Lb. Лидерная протеаза (Lnp0) отщепляет себя от растущей полипептидной цепочки на ее карбоксильном конце (65) и разрушает клеточный фактор инициации трансляции eIF4G (119, 186), что приводит к прекращению кэп зависимой трансляции мРНК клетки-хозяина (119, 107). Lnpo также участвует в расщеплении эукариотических циклинов, однако роль данного события в инфекции вируса ящура пока не определена (87).
Белки пикорнавирусов, кодируемые Р2 и РЗ областями генома, участвуют в репликации РНК и сборке структурных белков. Р2 предшественник пикорнавирусов расщепляется на три полипептида: 2А, 2В и 2С(161). Пептид 2А остается связанным с Р1, предшественником структурных белков, после первичного расщепления полипротеина (175) и является автопротеазой (179). Протеолитическая активность короткого пептида 2А использовалась в разных системах для выщепления чужеродных протеинов в различных клетках-хозяинах. (75, 78, 83, 93, 148).
Белок 2В увеличивает мембранную проницаемость и блокирует секрецию клеточных белков (48, 68, 112). Белок 2С и его предшественник 2ВС связаны с клеточной мембраной и индуцируют в ней пролиферацию везикул. Мутации, приводящие к устойчивости вируса к гуанидину, ингибитору репликации вирусной РНК, локализованы в 2С, что указывает на роль этого белка в репликации генома ВЯ. Barton и Flanegan (30) показали, что 2С полиовируса необходим для инициации синтеза минус-цепи РНК. 2С протеины всех пикорнавирусов имеют сходные с хеликазами структуры и, предположительно, обладают хеликазной активностью (58, 67, 92). Кроме того, белок обладает АТФ- и ГТФ-азными активностями (105, 116, 141).
Дифференциация постинфекционных и поствакцинальных антител
В настоящее время описано два альтернативных подхода к решению проблемы дифференциации постинфекционных и поствакцинальных антител при ящуре. Первый основан на выявлении специфических IgA в слюне инфицированных животных. В связи с тем, что для вакцинации против ящура используются инактивированные вакцины, IgA, специфичные к ВЯ, выявляются только у инфицированных животных (104, 166). Однако Моопеп и соавт. (52) показали, что данный метод не подходит для выявления вирусоносителей среди вакцинированного поголовья.
Наиболее широкое применение для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных нашли методы обнаружения антител к неструктурным белкам ВЯ. Первым в истории разработки данного подхода был метод иммунодиффузии в агарозном геле с использованием VIA-антигена, полученного из культуры клеток, зараженной ВЯ (129). В дальнейшем был разработан более чувствительный метод -иммуноферментный анализ, в котором также использовался нативный VIA-антиген (9, 55). Более поздние исследования показали, что антитела к 3D выявляются у многократно вакцинированных животных, что объясняется наличием этого белка в вакцинных препаратах (56).
В дальнейшем, внимание исследователей было сосредоточено на использовании в качестве индикатора инфекции других неструктурных белков. Berger и соавт. (101) анализировали сыворотки от вакцинированного и инфицированного КРС методом радиоиммунопреципитации. Они обнаружили, что сыворотки от инфицированных животных отличаются от сывороток, взятых от вакцинированного КРС, по способности преципитацитировать неструктурные белки ЗАВ, ЗС, 2С и, особенно, ЗА и ЗВ. Lubroth и Brown (121) показали, что белок 2С может использоваться для дифференциации потенциальных вирусоносителей среди переболевших и вакцинированных животных. Отсутствие антител к 2С в сыворотке от вакцинированных животных объяснялось ассоциацией этого вирусного белка с клеточным дебрисом во время изготовления вакцинного препарата (111).
Rodriguez и соавт. (159) исследовали иммуногенность различных белков ВЯ, экспрессированных в E.coli. Проанализировав сыворотки от инфицированных свиней с использованием прямого варианта ИФА, данная группа исследователей пришла к выводу, что ЗАВС является наиболее иммуногенным среди вирусных неструктурных протеинов и может быть использован для дифференциации вакцинированных и инфицированных животных. Было также показано, что антитела к ЗАВС обнаруживаются через две недели после инфицирования.
О. Marquardt (124) проводил иммуноблоттинг с использованием рекомбинантных белков Lb, 2С, ЗА и ЗС и гипериммунных сывороток КРС. В ходе эксперимента было обнаружено, что сыворотка хорошо реагировала с 2С и ЗА, при этом с белком Lb реакция проходила хуже, а с белком ЗС не наблюдали какой-либо реакции. На основании полученных результатов, исследователи пришли к выводу, что белок ЗС не содержит линейных эпитопов, распознаваемых антителами КРС. Кроме того, рекомбинантный белок ЗС был токсичен для клеток E.coli (123).
Meyer и соавт. (28) проводили, экспрессию 2С и 3D белков в бакуловирусной системе. Они показали, что белок 3D при экспрессии выходит в клеточную среду, тогда как белок 2С прикрепляется к клеточным мембранам и высвобождается при экстракции клеточного лизата растворами детергентов. Подобные свойства для белков 2С и 3D наблюдали и при культивировании вируса ящура в культуре клеток ВНК-21. При разработке
ИФА неочищенные лизаты клеток Hi-Five вносили в лунки планшет, в качестве отрицательного антигена применяли лизаты клеток Hi-Five, не экспрессирующих белки 2С и 3D. Наибольшее соотношение специфического сигнала к неспецифическому наблюдали при разведении исследуемой сыворотки 1:1000 - 1:2000. Количественное сравнение относительных концентраций анти-2С и анти-ЗО антител на ограниченном количестве сывороток от вакцинированных и переболевших животных указывало на возможность применения белка 2С при дифференциальной диагностике указанных категорий сывороток.
Foster и соавт. (169) исследовали гуморальный и клеточный иммунитет к неструктурным белкам у животных, инфицированных разными серотипами вируса ящура. Данная группа исследователей получила рекомбинантные неструктурные белки вируса ящура (2В, 2С, ЗА, ЗС и 3D) экспрессией в Е.соН. На основе данных белков были разработаны непрямой вариант ИФА и кожный тест на реакцию гиперчувствительности замедленного типа.
Сыворотки от инфицированного КРС отбирали на 7, 14, 21, 28 и 42 после инфекции. После первичной инфекции антитела к неструктурным белкам ЗА и 3D выявляли в большем титре, чем антитела к белкам 2В, 2С и ЗС. В тесте на реакцию гиперчувствительности замедленного типа наиболее надёжными индикаторами инфекции оказались белки 2В, 2С и 3D. De Diego и соавт. (49, 60) разработали непрямой улавливающий вариант ИФА, в котором использовали Мат к рекомбинантным белкам ЗА и 2С, экспрессированным в Е.соН. Рекомбинантный белок получали экстракцией бактериального лизата раствором 7М мочевины и использовали без дальнейшей очистки. Связавшиеся с ЗАВС антитела, выявляли анти кроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой. Реакцию считали положительной при условии, что оптическая плотность (ОП) в лунке с антигеном ЗАВС, за вычетом ОП в лунке без антигена, составляла более 0,2. При постановке ИФА наблюдали неспецифическую реакцию, если в буфер для разбавления не добавляли бактериальный лизат. Чувствительность метода составила 100%, а специфичность - 99,5%. Антитела к ЗАВС выявляли на 8-10 дни после инфицирования в течение года (срок наблюдения). Все сыворотки от инфицированных животных имели положительный результат в ЗАВС-ИФА, независимо от серотипа вируса ящура, которым животные были инфицированы. Более 99,5% сывороток от неиммунных животных также имели отрицательный результат.
Silberstein и соавт. (86) проводили экспрессию белка ЗАВІ в Е. coli и бакуловирусной системе и исследовали сыворотки от КРС на наличие антител к данному белку иммуноблоттингом и в непрямом варианте ИФА. Авторы отметили, что белок хорошо экспрессировался в клетках Е. coli, однако им не удалось полностью избавиться от примесей бактериальных белков в процессе очистки. В связи с этим, они перешли к использованию бакуловирусной системы для получения ЗАВІ. Данный белок очищали гель-фильтрацией с использованием сефакрила S300. На основе белка ЗАВІ авторы разработали непрямой вариант ИФА. С помощью данного метода исследовали сыворотки от невакцинированного КРС из свободного от ящура юга Аргентины, от КРС, экспериментально заражённого вирусом ящура, и от многократно вакцинированного КРС. При исследовании сывороток от вакцинированных и невакцинированных здоровых животных получили отрицательные результаты. Все сыворотки от экспериментально заражённых животных оказались положительными. Антитела к ЗАВІ обнаруживали в период от 7 до 560 дней после заражения. Lopez и соавт. (98) также получили рекомбинантный белок ЗАВІ, но в качестве экспрессирующей системы использовали личинки Rachiplusia nu. Nanni и соавт. (132) экспрессировали белок ЗАВІ в Е. coli. Очистку белка данная группа исследователей проводила методом электроэлюции из ПААГ. Полученный белок был использован в качестве антигена в непрямом варианте ИФА. Антитела выявляли, начиная с 7-го ДЛИ. Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы составили 97,5% и 100% соответственно.
Конструирование плазмид, экспрессирующих рекомбинантные неструктурные белки ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура
ДНК-копии генов ЗА, ЗВ и ЗАВ ВЯ А22550 были получены с вирусной РНК методом ОТ-ПЦР, при амплификации использовали праймеры, в структуру которых были заложены сайты рестрикции Bam HI и Hind III. Для амплификации гена ЗА применяли праймеры 3AF и 3AR, гена ЗВ - 3BF и 3BR, гена ЗАВ -3AF и 3BR. В качестве термостабильного фермента в ГИДР использовали Pfu ДНК-полимеразу, обладающую корректирующей активностью. После обработки соответствующими рестриктазами продукты ПЦР были встроены в экспрессирующий вектор pQE при помощи Т4 ДНК-лигазы. Вектор также был предварительно обработан рестриктазами Ват Ш и Hind III.
Лигазные смеси трансформировали в клетки E.coli Ml5. В качестве селектирующего маркера использовали устойчивость к ампициллину, заложенную в вектор. В результате трансформации на всех трёх чашках Петри (ЗА, ЗВ и ЗАВ) выросло несколько десятков колоний. На наличие рекомбинантных плазмид с каждой чашки было проанализировано по 12 колоний. По результатам рестрикционного анализа были отобраны 6 клонов, содержащих плазмиду с геном ЗА, 8 клонов, содержащих плазмиду с геном ЗВ и 8 клонов, содержащих плазмиду с геном ЗАВ.
Все отобранные клоны были проанализированы на способность экспрессировать рекомбинантные белки. Для этого культуры каждого клона в объеме 3 мл каждая растили до достижения логарифмической фазы роста, добавляли индуктор ИПТГ до конечной концентрации 1мМ и инкубировали еще 4 часа. Клеточный осадок лизировали в сэмпл-буфере и наносили лизат на 12% ПААГ.
Анализ гелей показал, что почти все отобранные клоны экспрессируют рекомбинантные белки (рис. 3). Молекулярная масса рекомбинантных белков соответствовала расчетной, существенных различий в уровне экспрессии между клонами, экспрессирующими рекомбинантные белки, не наблюдалось.
Из клонов, экспрессирующих белки ВЯ, были выделены рекомбинантные плазмиды и проверены методом нуклеотидного секвенирования на отсутствие нуклеотидных замен и сдвигов в рамке считывания, приводящих к изменению аминокислотного состава рекомбинантных белков.
Культуры всех клонов E.coli, экспрессирующих рекомбинантные белки, были заложены на хранение на -70С для дальнейшего использования в работе. экспрессии. Оптимизацию проводили по двум параметрам: концентрации индуктора и времени экспрессии.
Согласно инструкции фирмы-производителя конечная концентрация ИПТГ должна составлять 1мМ. Однако в различных работах по получению рекомбинантных белков экспрессией в E.coli используются различные концентрации индуктора. В связи с этим, мы провели работу по определению оптимальной концентрации ИПТГ.
Влияние концентрации индуктора на уровень экспрессии изучали в диапазоне от 0,01 до 2мМ. Уровень экспрессии белков определяли визуально по электрофореграмме. Накопление рекомбинантных белков ВЯ достигало максимума при концентрации ИПТГ 0,2мМ и при дальнейшем повышении концентрации индуктора не менялось. На рисунке 4 приведена электрофореграмма экспрессии белка ЗА при различных концентрациях индуктора. С белками ЗВ и ЗАВ наблюдали такую же картину.
После определения оптимальной концентрации индуктора исследовали кинетику экспрессии белков. Для этого аликвоты дневной культуры отбирали через 0,25; 0,5; 1; 2; 4 и 18 часов после индукции и анализировали в ПААГе (рис.5). Было обнаружено, что все белки являются относительно стабильными, поскольку даже после 18 часов экспрессии не наблюдалось их протеолиза. Как видно из рисунка 5, накопление белков ЗВ и ЗАВ достигало максимума через 4 часа после индукции и далее не менялось. Максимальный уровень накопления белка ЗА наблюдался после 18 часов индукции. Через 4 часа после внесения индуктора количество белка ЗА в клетках было лишь незначительно меньше, чем через 18 часов, поэтому 4 часа было принято за достаточное время экспрессии для всех белков, и все последующие эксперименты проводились именно с таким временным режимом.
Следующий этап исследований заключался в отработке условий очистки и концентрирования рекомбинантных белков ВЯ. Все три рекомбинантных белка накапливались в клетках в нерастворимой форме, поэтому их очистку проводили в денатурирующих условиях. 1-3-осадки клеток, экслрессирующих ЗА, ЗВ и ЗАВ соответственно, после обработки лизирующим буфером, содержащим 8М мочевину; 4-6- осадки клеток, экспрессирующих ЗА, ЗВ и ЗАВ соответственно, после обработки лизирующим буфером, содержащим 6М гуапидинхлорид.
При использовании в качестве денатурирующего агента 8М мочевины в раствор переходила лишь незначительная часть рекомбинантных белков, большая же часть их при центрифугировании выпадала в осадок вместе с клеточным дебрисом (рис. 6).
С помощью 6М гуанидинхлорида белок ЗВ удалось перевести в растворимое состояние полностью, белки ЗА и ЗАВ растворялись в гуанидинхлориде значительно лучше, чем в мочевине. В связи с этим, 6М гуанидинхлорид был включен в состав буфера для лизиса клеток и промывки. Очистку растворенных рекомбинантных белков проводили методом металл-хелатной хроматографии с применением Ni-NTA-agarose ("Qiagen").
Рекомендуемые фирмой-изготовителем сорбента условия элюции рекомбинантных белков оказались непригодными, поскольку все три белка не снимались с сорбента при использовании стандартных условий: низких значений рН или 0,2М имидазола. Лишь при повышении концентрации имидазола в элюирующем буфере до 0,4М удалось добиться элюции большей части каждого из белков. Дальнейшее повышение концентрации имидазола в элюирующем буфере не повлияло на выход белков в элюате (рис.7) .
Разработка набора для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом
На основе ЗА-ИФА, как наиболее специфичного и чувствительного метода, был разработан диагностический набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС. Данная работа включала в себя отработку технологических вопросов изготовления биологических и химических компонентов набора, а также комиссионные испытания опытных серий набора. Технология приготовления антигена подробно описана в разделе 3.3.3. Помимо антигена обязательными компонентами набора являются контрольная специфическая (положительный контроль) и нормальная (отрицательный контроль) сыворотки. Нормальную сыворотку получали путем взятия крови от здорового КРС, не имеющего антител к ВЯ. Для получения специфической сыворотки животных заражали вирусом ящура в слизистую оболочку языка. Через 14-21 дней после появления первых признаков заболевания у животных отбирали кровь из яремной вены. Титр антител к неструктурным белкам в ИФА был не ниже 1:6400. В качестве меченых детекторных антител был использован иммунопероксидазный конъюгат против IgG КРС, выпускаемый НИИЭМ им. Гамалеи (г. Москва). Этот препарат оказался эффективным при введении в разрабатываемую тест-систему, стабилен при длительном хранении и удобен для стандартизации. В качестве субстрата в наборе применяли пероксидазный субстрат АБТС фирмы ISN (США). Важным этапом исследования был подбор оптимальной схемы постановки иммуноферментного анализа. Целью данного этапа работы было обеспечить минимальные затраты реагентов, максимально упростить и ускорить процесс анализа, добиться четкого воспроизведения результатов реакции.
Схема постановки ИФА с использованием набора подробно описана в разделе 3.3.6. «Результатов собственных исследований». Одним из этапов работы было исследование стабильности биологических компонентов набора. Срок хранения планшетов с рекомбинантным белком составил не менее года (рис. 10). Для консервации сывороток крови и антивидового конъюгата добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,05%. Данные компоненты набора хранили при температуре 4С один год. В течение этого срока контрольные сыворотки и конъюгат периодически использовали для исследования сывороток с различным уровнем антител к неструктурным белкам вируса ящура. Результаты представлены в табл.5. Как видно из таблицы, титр антител исследуемых сывороток практически не изменился. Это указывает на то, что активность контрольных сывороток и конъюгата не уменьшалась в течение года. В окончательном варианте набор включал необходимые компоненты и химические реагенты, рассчитанные на диагностические исследования в ИФА 50 сывороток КРС. «Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом» прошел комиссионные испытания, был одобрен ученым советом и утвержден директором ФГУ ВНИИЗЖ (Приложение 2). В феврале 2005 года были проведены межведомственные комиссионные испытания разработанного набора. Описанные в разделах 3.3.6. и 3.3.8 метод и диагностический набор позволяют дифференцировать вакцинированных и инфицированных ВЯ животных в зависимости от титра антител к неструктурным белкам вируса. При этом для каждой сыворотки делается восемь последовательных разведений. Такой метод удобен тем, что позволяет проводить визуальную оценку результатов реакции, что немаловажно при использовании набора в условиях диагностических лабораторий, не оснащенных приборами для учета результатов ИФА. Однако для массовых серологических исследований более предпочтительным является метод определения антител по одному разведению сыворотки, так как он позволяет значительно сократить объем работы и стоимость анализа каждой сыворотки.
