Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Молекулярные детерминанты, ответственные за функциональное взаимодействие между рецепторами и гетеротримерными G-белками 28
1.1. Теоретический анализ первичной структуры рецепторов серпантинного типа для выявления в них молекулярных детерминант, взаимодействующих с G-белками 29
1.1.1. Участие первой цитоплазматической петли рецепторов в связывании G-белков 29
1.1.2. Участие второй цитоплазматической петли рецепторов в сопряжении с G-белками 32
1.1.3. Ключевая роль третьей цитоплазматической петли рецепторов в функциональном взаимодействии с G-белками 36
1.1.4. Участие С-концевого домена рецепторов в сопряжении с G-белками 46
1.2. Молекулярные детерминанты в молекулах а-субъединиц G-белков, определяющие их взаимодействие с рецепторами 50
ГЛАВА 2. Применение пептидов, производных первичной структуры сигнальных белков, для изучения молекулярных механизмов передачи гормонального сигнала в клетку 53
2.1. Обзор литературы 53
2.1.1. Пептиды, производные рецепторов серпантинного типа 53
2.1.2. Пептиды, производные а-субъединиц G-белков 57
2.1.3. Перспективы использования пептидной стратегии 59
2.2. Результаты экспериментальных исследований 62
2.2.1. Исследование молекулярных механизмов действия биогенных аминов на активность АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных с применением С-концевых пептидов а-субъединиц Gs- и Gj-белков 62
2.2.2. Исследование регуляции биогенными аминами активности АЦС в тканях моллюска Anodonta cygnea и применение С-концевых пептидов для идентификации типа G-белков, участвующих в этом процессе 70
2.3. Обсуждение результатов исследования 76
2.3.1, Разработка принципов применения С-концевых пептидов Ga-субъединиц для изучения сопряжения рецепторов с различными типами G-белков 76
2.3.2. Применение С-концевых пептидов для идентификации типа G-белков, участвующих в регуляторном действии биогенных аминов на АЦС в нервной и мышечной тканях моллюска 79
ГЛАВА 3. Молекулярные механизмы действия релаксина и инсулииоподобных пептидов моллюска на аденилатциклазу и участие в этом процессе гетеротримериых G-белков 83
3.1. Обзор литературы и теоретические исследования 83
3.1.1. Множественность молекулярных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства на клетку и участие в них гетеротримериых G-белков 83
3.1.2. Структурно-функциональная организация релаксиновой сигнальной системы 86
3.1.3. Структурно-функциональная характеристика и молекулярные механизмы действия инсулииоподобных пептидов моллюсков 92
3.2. Результаты экспериментальных исследований 97
3.2.1. Исследование молекулярных механизмов передачи релаксинового сигнала через трехкомпонентную АЦС 97
3.2.2. Исследование шестикомпонентного аденилатциклазного сигнального механизма действия релаксина
3.2.3. Молекулярные механизмы регуляторного влияния ИПП моллюска A. cygnea на активность АЦС в тканях моллюска и крысы 116
3.3. Обсуждение результатов исследования 123
3.3.1. Регулируемая релаксином трехкомпонентная АЦС, включающая рецептор серпантинного типа LGR7 123
3.3.2. Шестикомпонентный аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина 128
3.3.3. Молекулярные механизмы регуляторного действия ИПП моллюска на АЦС 132
ГЛАВА 4. Нарушения функционального сопряжения рецепторов с G-белками при экспериментальном диабете 136
4.1. Обзор литературы 136
4.2. Результаты исследований 138
4.2.1. Регуляторное влияние биогенных аминов на активность АЦС в миокарде и скелетных мышцах крыс со стрептозотоциновым диабетом 1-го типа 138
4.2.2. Регуляция биогенными аминами и пептидными гормонами функциональной активности АЦС в тканях крыс с неонатальным СТЦ диабетом 2-го типа 145
4.3. Осуждение результатов исследования 150
ГЛАВА 5. Молекулярные механизмы действия поликатионных пептидов, мимикрирующих рецепторы, на функциональную активность АЦС 155
5.1. Обзор литературы 155
5.2. Результаты исследований 157
5.2.1. Характеристика поликатионных пептидов 157
5.2.2. Влияние поликатионных пептидов на активность АЦ и ГТФ-связывание G-белков 159
5.2.3. Влияние поликатионных пептидов на связывающие характеристики рецепторов и их сопряжение с G-белками 163
5.2.4. Исследование молекулярных механизмов действия поликатионных пептидов на компоненты АЦС - G-белки и рецептор 167
5.3. Осуждение результатов исследований 174
5.3.1. Стратегия синтеза поликатионных пептидов и изучение чувствительности к ним АЦС 174
5.3.2. Механизмы действия поликатионных пептидов на АЦС и идентификация G-белков, мишеней их действия 181
ГЛАВА 6. Структурно-функциональная организация аденилатциклазной системы инфузорий и ее чувствительность к гормональным агентам 187
6.1. Обзор литературы и теоретический анализ первичных структур сигнальных белков низших эукариот 187
6.1.1. Обнаружение у низших эукариот гормонов, подобных таковым высших эукариот 188
6.1.2. Рецепторы серпантинного типа 189
6.1.3. Гетеротримерные G-белки 202
6.1.4. Аденилатциклазы и протеинкиназы А низших эукариот 206
6.1.5. Многообразие АЦС низших эукариот 210
6.2. Результаты экспериментальных исследований 213
6.2.1. Объекты исследования 213
6.2.2. Обнаружение и функциональная характеристика аденилатциклазы инфузорий 214
6.2.3. Чувствительность аденилатциклазы инфузорий к биогенным аминам 218
6.2.4. Идентификация и характеристика рецепторов катехоламинов
у инфузорий 220
6.2.5. Стимуляция биогенными аминами ГТФ-связывания G-белков инфузорий 224
6.2.6. Чувствительность аденилатциклазы и G-белков инфузорий к пептидным гормонам млекопитающих 225
6.2.7. Характеристика цАМФ-зависимой протеинкиназы у инфузорий 230
6.3. Обсуждение результатов экспериментальных исследований 231
ГЛАВА 7. Методическая часть 244
Заключение 256
Выводы 267
Литература 270
- Участие первой цитоплазматической петли рецепторов в связывании G-белков
- Исследование молекулярных механизмов действия биогенных аминов на активность АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных с применением С-концевых пептидов а-субъединиц Gs- и Gj-белков
- Множественность молекулярных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства на клетку и участие в них гетеротримериых G-белков
- Регуляторное влияние биогенных аминов на активность АЦС в миокарде и скелетных мышцах крыс со стрептозотоциновым диабетом 1-го типа
Введение к работе
Актуальность исследования. Регуляция большинства жизненно важных функций и процессов в организме позвоночных и беспозвоночных животных осуществляется с помощью гормонов и гормоноподобных веществ. Их действие реализуется через высоко специализированные гормональные сигнальные системы. Предметом нашего исследования была наиболее широко распространенная гормоночувствительная аденилатциклазная система (АЦС). Ее основными компонентами являются рецептор, расположенный в плазматической мембране (ПМ) и специфически опознающий гормональный сигнал, гетеротримерный G-белок стимулирующего (Gs-белок) или ингибирующего (Gi-белок) типа, который состоит из трех типов субъединиц - а, р и у, и фермент адеиилатциклаза (АЦ), генерирующий образование вторичного посредника цАМФ. цАМФ активирует протеинкииазу А (ПКА) и через нее регулирует широкий спектр эффекторных систем клетки.
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы в изучении АЦС, молекулярные механизмы передачи через нее гормонального сигнала остаются до конца невыясненными. Недостаточно информации о молекулярных детерминантах в белках, компонентах АЦС, вовлеченных в процесс их функционального взаимодействия и являющихся ключевыми звеньями в сигнал передающей цепи. Много вопросов остается и в отношении регуляции АЦС гормонами, которые действуют через рецепторы, не относящиеся к серпантинному типу. По-прежнему мало изученными остаются АЦС беспозвоночных животных, в первую очередь одноклеточных эукариот.
Понимание того, каким образом функционирует АЦС, является одним из магистральных направлений в современной биохимии и молекулярной эндокринологии, поскольку через эту систему свое регуляторное влияние на клетку оказывают более сотни различных по своей природе гормонов, а сама АЦС играет ключевую, координирующую роль в регуляции практически всех жизненно важных клеточных процессов - роста, метаболизма, апоптоза, дифференцирования. Решению актуальной проблемы функционирования АЦС и посвящено настоящее исследование, в котором изучены молекулярные механизмы функционального сопряжения компонентов АЦС и, в первую очередь, взаимодействия между активированным рецептором и G-белком, как ключевого
этапа передачи гормонального сигнала через эту систему. В работе применен эволюционный подход, который заключался в сравнительном исследовании функциональных блоков АЦС у животных различного филогенетического уровня -высших позвоночных (крысы), многоклеточных беспозвоночных (моллюски, черви) и одноклеточных эукариот (инфузории). Оригинальным и перспективным является использование для выяснения молекулярных механизмов сопряжения рецепторов с G-белками пептидной стратегии, которая представляет собой принципиально новый подход в изучении функционирования сигнальных систем и их компонентов на субмолекулярном уровне.
Открытие в лаборатории АЦ сигнального механизма действия инсулина (Pertseva et al., 2003), заставляет по-новому взглянуть и на молекулярные механизмы действия на АЦС родственного ему релаксина. Релаксин регулирует широкий спектр физиологических процессов в организме человека и рассматривается как перспективный лекарственный препарат для лечения заболеваний репродуктивной, сердечно-сосудистой и нервной систем. Однако до сих пор молекулярные механизмы действия релаксина на клетку изучены недостаточно. Расшифровка этих механизмов представляет собой важнейший этап в понимании общих закономерностей регуляторного влияния релаксина и других пептидов инсулинового суперсемейства на функциональную активность эффекторных, в том числе цАМФ-зависимых, систем клетки, и является необходимым условием для практического применения релаксина в медицине.
Создание новых, более эффективных, гормональных препаратов, обладающих высокой специфичностью и селективностью регуляторного действия на АЦС, требует разработки функциональных зондов для изучения молекулярных механизмов взаимодействия рецепторов с G-белками. Одним из перспективных подходов для разработки таких зондов является синтез негормональных регуляторов АЦС - пептидов, которые мимикрируют функционально важные для взаимодействия с G-белками участки рецепторов и способны влиять на функциональную активность компонентов АЦС. В настоящем исследовании нами были впервые синтезированы различные по своей структуре поликатионные пептиды, которые по независимому от рецептора механизму активируют G-белки и влияют на передачу гормональных сигналов через АЦС.
В настоящее время сравнительно мало известно о структурно-функциональной организации АЦС одноклеточных, в частности инфузорий. В то же время, исследование сигнальных систем одноклеточных представляет как теоретическую, так и практическую ценность. Согласно развиваемым в нашей лаборатории представлениям (Перцева, 1989; Pertseva, 1991), именно на уровне одноклеточных эукариот начинают формироваться гормональные сигнальные системы высших эукариот. Инфузории Dileplus anser и Tetrahymena pyriformis, избранные нами в качестве объектов, широко используются в экотоксикологических исследованиях. Поскольку АЦС является одной из мишеней внешних воздействий, то выяснение ее функционирования поможет в разработке новых эффективных подходов для оценки последствий таких воздействий и их мониторинга. Цели и задачи исследования. Цель исследования состояла в выяснении молекулярных механизмов функционального сопряжения гормональных рецепторов и гетеротримерных G-белков, компонентов АЦС, в клетках животных различного филогенетического уровня.
Задачи исследования состояли:
1) С помощью сравнительного теоретического анализа выявить в рецепторах
серпантинного типа и гетеротримерных G-белках молекулярные детерминанты,
ответственные за их функциональное сопряжение и вовлеченные в процесс передачи
гормонального сигнала.
Использовать пептидную стратегию, заключающуюся в синтезе пептидов, которые соответствуют взаимодействующим с рецепторами С-концевым участкам а-субъединиц G-белков, для исследования молекулярных механизмов передачи гормональных сигналов через АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных животных.
С применением впервые синтезированных пептидов, соответствующих С-концевому участку третьей цитоплазматической петли (С-ЦП-3) рецептора релаксина LGR7, выявить и изучить молекулярные механизмы передачи релаксинового сигнала через АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных животных.
4) Расшифровать и исследовать структурно-функциональную организацию АЦ
сигнального механизма действия релаксина, обнаруженного в скелетных мышцах крысы
и гладких мышцах моллюска Anodonta cygnea.
5) Исследовать чувствительность АЦС к биогенным аминам и пептидным гормонам при
стрептозотоциновом (СТЦ) диабете 1-го и 2-го типов у крыс и выявить локализацию
нарушений в АЦС, возникающих в условиях этой патологии.
6) Провести сравнительное исследование механизмов действия синтетических
поликатиоиных пептидов, не имеющих гомологии с сигнальными белками, но способных
мимикрировать функционально важные для сопряжения с G-белками участки
рецепторов, на функциональную активность компонентов АЦС.
7) Охарактеризовать АЦС одноклеточных эукариот - инфузорий D. anser и Т. pyriformis,
и изучить молекулярные механизмы передачи через нее гормональных сигналов на этапе
сопряжения рецептора с G-белком и АЦ.
Научная новизна. В результате проведенных теоретических и экспериментальных исследований показано, что одним из основных молекулярных механизмов, лежащих в основе функционального сопряжения рецепторов с G-белками в тканях позвоночных и беспозвоночных, является способность поликатиоиных спиралей цитоплазматических петель активированного гормоном рецептора взаимодействовать с С-концевым сегментом а-субъединицы гетеротримерного G-белка и опосредовать, таким образом, передачу гормонального сигнала к АЦ и цАМФ-зависимым эффекторным системам.
Впервые показано, что С-концевые пептиды а-субъединиц Gs- и Gj-белков способны с высокой селективностью прерывают передачу гормонального сигнала через те типы G-белков, производными первичной структуры которых они являются, вследствие чего их можно применять для идентификации G-белков, участвующих в сигнальной траисдукции.
Показано, что впервые синтезированные нами пептиды, соответствующие С-ЦП-3 релаксинового рецептора LGR7, не только влияют на передачу релаксинового сигнала через АЦС в сердце и мозге крыс, но и независимым от рецептора способом активируют G-белки и АЦ. Это указывает на участие рецептора LGR7 в трансдукции релаксинового сигнала в этих тканях и свидетельствует о вовлечении в процесс функционального сопряжения с G-белком С-ЦП-3 рецептора LGR7.
Впервые расшифрован АЦ сигнальный механизм действия релаксина, реализуемый в скелетных мышцах крысы, который включает: рецептор тирозинкиназного типа => С-белок (GPy-димер) => фосфатидилинозитол-3-киназу (ФИ-5-
К) => протеинкиназу СС, (UKCQ=> Gs-белок => АЦ. По своей структурно-функциональной организации он сходен с открытым в лаборатории АЦ сигнальным механизмом действия инсулина (Pertseva et al., 2003).
В работе впервые показано, что основные нарушения в АЦС при СТЦ диабете 1 -го и 2-го типов у крыс, возникают на этапе сопряжения рецепторов биогенных аминов и пептидных гормонов с различными типами G-белков. Для изучения этих нарушений была применена разработанная автором пептидная стратегия.
Впервые охарактеризована АЦС представителей одноклеточных эукариот -инфузорий D. anser и Т. pyriformis, сходная по ряду свойств с АЦС позвоночных. Показано, что ее функциональная активность регулируется биогенными аминами и пептидными гормонами млекопитающих. Эти данные и результаты проведенного нами сравнительного теоретического анализа первичных структур компонентов АЦС одноклеточных, свидетельствуют о раннем формировании АЦС в эволюции. Научно-практическая значимость работы. Синтезированные нами и исследованные в работе пептиды, соответствующие участкам рецепторов и G-белков, ответственным за взаимодействие между ними, а также синтетические поликатионные пептиды, мимикрирующие эти участки, но не имеющие гомологии с сигнальными белками, могут быть в дальнейшем применены как в качестве функциональных зондов для изучения молекулярных основ функционирования АЦС, так и в качестве высокоэффективных и селективных негормональных регуляторов активности сигнальных белков. В перспективе на основе этих пептидов могут быть разработаны лекарственные препараты, избирательно действующие на функциональную активность гормональных сигнальных систем. Материалы диссертации могут быть использованы в курсах лекций для студентов и аспирантов в Санкт-Петербургском государственном университете, Медицинском университете, Химико-фармацевтической Академии и других Университетах и вузах России.
Положения, выносимые на защиту.
1. Основные молекулярные детерминанты, ответственные за взаимодействие с G-белками, локализованы в проксимальных к мембране участках цитоплазматических петель (ЦП) рецепторов и характеризуются наличием кластеров положительно заряженных аминокислот и способностью формировать спиральные структуры.
Синтетические пептиды, которые соответствуют участкам рецепторов и G-белков, ответственным за их функциональное взаимодействие, способны с высокой эффективностью и селективностью по конкурентному механизму прерывать проведение гормонального сигнала через АЦС.
2. Молекулярные механизмы стимулирующего АЦ действия релаксина являются ткане- и
видоспецифичными и реализуются через гетеротримерные G-белки. В сердце и мозге
крысы релаксин осуществляет свое действие через трехкомпонентную АЦС, в скелетных
мышцах крысы и гладких мышцах моллюска A. cygnea - через шестикомпонентный АЦ
сигнальный механизм.
3. В условиях СТЦ диабета 1-го и 2-го типа у крыс наблюдаются нарушения
функционирования чувствительной к биогенным аминам и пептидным гормонам АЦС, в
первую очередь на этапе сопряжения активированного гормоном рецептора с G-белком.
Синтетические поликатионные пептиды, мимикрирующие взаимодействующие с G-белками участки рецепторов, способны по независимому от рецептора механизму активировать G-белки и влиять на проведение гормонального сигнала через АЦС.
В клеточных культурах инфузорий D. anser и Т. pyriformis имеется функционально активная АЦС, чувствительная к гормонам млекопитающих. Это согласуется с присутствием у одноклеточных эукариот сигнальных белков, гомологичных компонентам АЦС позвоночных, что свидетельствует об эволюционной консервативности АЦС эукариотических организмов.
Апробация работы. Основные результаты и положения работы широко представлены на большом числе отечественных и зарубежных научных конференций и симпозиумов, в том числе: на VI Международном конгрессе по нейроэндокринологии (Питтсбург, США, 2006), на III Международном симпозиуме по пептидам (Прага, Чехия, 2004), на III и IV Международных конференциях по релаксину и родственным пептидам (Брум, Австралия, 2000; Виоминг, США, 2004), на XVII, XXI и XXII Конференциях сравнительных эндокринологов (СБСЕ; Кордоба, Испания, 1994; Бонн, Германия, 2002; Уппсала, Швеция, 2004), на Международном симпозиуме по сигнальной трансдукции (FEBS; Брюссель, Бельгия, 2003), на Симпозиуме "Cell Signalling Mechanisms: from Membrane to Nucleus" (FEBS; Амстердам, Нидерланды, 1997), на Европейской конференции "Cell signaling, transcription, and translation as therapeutic targets" (Люксембург, 2002), на
Международном симпозиуме "Structure, stability and folding of proteins: fundamental and medical aspects" (Москва, 1998), на Международной научно-практической конференции «Инфузории в биотестировании» (Санкт-Петербург, 1997), на VII Восточноевропейской конференции по нейробиологии беспозвоночных (Калининград, 2003), на IV Международной конференции по простейшим нервным системам (Пущино, 1994), на XI, XII и XIII Международных конференциях по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996, 2002, 2006), на Международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004), на II Международной конференции «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии», посвященной памяти М.Г. Колпакова (Новосибирск, 2002), на I и II Всероссийских симпозиумах по химии и биологии пептидов (Москва, 2003, Санкт-Петербург, 2005), на XV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), на Всероссийском физиологическом съезде (Екатеринбург, 2004), на Конференции «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», посвященной памяти П. М. Альбицкого (Санкт-Петербург, 2003), на I съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской конференции «Нейрофармакология в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2002).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 85 научных работ, в том числе 45 статей в рецензируемых отечественных и международных научных изданиях и 40 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 300 страницах, состоит из введения, 6 отдельных глав, включающих обзор литературы, результаты экспериментальных и теоретических исследований и их обсуждение, главы с описанием методов исследования, заключения, выводов и списка литературы, включающего 342 источника, в том числе 78 отечественных и 264 иностранных. Работа иллюстрирована 87 рисунками и 11 таблицами.
ВВЕДЕНИЕ
Участие первой цитоплазматической петли рецепторов в связывании G-белков
Проблема функционального взаимодействия между белками-компонентами гормональных сигнальных систем, сопряженных с G-белками, и поиск молекулярных детерминант, вовлеченных в это взаимодействие, занимает одно из центральных мест в современной молекулярной эндокринологии. Нарушение молекулярных механизмов, лежащих в его основе, приводит к развитию тяжелых заболеваний человека (Шпаков, 2001; Lania et al., 2001; Thompson et al., 2005), что послужило основой для разработки нами концепции молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринной патологии (Перцева, Шпаков, 2004). Обнаружение молекулярных детерминант в структуре сигнальных белков, ответственных за процессы передачи гормонального сигнала, позволит в будущем разработать новые поколения лекарственных препаратов, регуляторов и модуляторов функциональной активности гормональных сигнальных систем (Ballesteros, Palczewski, 2001).
Несмотря на то, что проблему функционального взаимодействия белков, компонентов сопряженных с G-белками сигнальных систем, исследуют более 30 лет, она до сих пор далека от своего решения. Недавно было обнаружено, что важную роль в образовании комплекса между активированным рецептором и G-белком играют дополнительные белки, находящиеся в микроокружении молекул рецептора и G-белка и способные регулировать их функциональную активность, в том числе способность взаимодействовать друг с другом (Sato et al., 2006). Показано также, что некоторые рецепторы в процессе активации их гормонами образуют димерные или олигомерные комплексы, которые в дальнейшем и взаимодействуют с G-белками (Breitwieser, 2004).
Имеются многочисленные свидетельства в пользу того, что во взаимодействии с G-белком участвуют расположенные в цитоплазме ЦП и СКД рецептора, а также ТМ/ЦП интерфейсы, образующие цитоплазматический выход из ТМК рецептора. В свою очередь, важную роль во взаимодействии с рецептором и эффектором играют С-концевые участки ос-субъединицы G-белка, а также короткие участки GP-субъединицы (в составе GPy- димера), мозаично расположенные в ее молекуле. Следует, однако, отметить, что до сих пор отсутствует структурно-функциональное картирование молекулярных детерминант, вовлеченных во взаимодействие между компонентами АЦС, и до конца не выяснено, какими структурными особенностями они должны обладать для эффективного осуществления ими функции передачи гормонального сигнала.
Цель наших теоретических исследований состояла в выявлении и структурном анализе молекулярных детерминант в молекулах рецепторов серпантинного типа и гетеротримерных G-белков, опосредующих взаимодействие между ними, с применением подхода, основанного на анализе первичной и вторичной структур участков этих сигнальных белков, а также с привлечением данных литературы. Результаты этих исследований были необходимы для конструирования синтетических пептидов, соответствующих участкам АКП рецепторов и Ga-субъединиц, компонентов АЦС, примененных нами для исследования молекулярных механизмов функционального сопряжения рецепторов с G-белками.
В процессе функционального сопряжения с G-белками ЦП-1 рецепторов играет лишь вспомогательную роль, влияя в большей степени на связывание рецептора с лигандом, чем с G-белком (Mathi et al., 1997; Jin et al., 1998; Шпаков, 2002a). Этот вывод базируется на том, что ЦП-1 в большинстве рецепторов серпантинного типа сравнительно короткие и необходимы в основном для фиксации ТМ-1 и ТМ-2. Имеются многочисленные данные, указывающие на то, что замены и делении АКО в этой петле не влияют на способность рецептора связываться с G-белками и активировать их. Однако имеются исключения. Замена участка Arg54—Не62 в ЦП-1 рецептора N-форм ил пептида снижает его способность сопрягаться с Саіб-субьединицей, что, вероятно, вызвано искажением пространственной структуры ТМК мутантного рецептора и нарушением конформации его лигандсвязывающего кармана (Amatruda et al., 1995). Обнаружено также участие ЦП-1 простациклинового рецептора в функциональном взаимодействии с Gas-субъединицей (Zhang et al., 2006).
Проведенный нами теоретический анализ показал, что ЦП-1 рецепторов серпантинного типа, за исключением СРід, имеют положительный заряд (в среднем +2.9), причем положительно заряженные АКО отчетливо преобладают над отрицательно заряженными (соотношение 5:1) (табл. 1) (Шпаков, 2002а, 2003). Доля положительно заряженных АКО в ЦП-1 55 рецепторов составляет 27.5 %, в то время как в сигнальных белках, согласно нашим расчетам, она не превышает 14.7 %. С отрицательно заряженными АКО ситуация обратная. В ЦП-1 доля этих АКО составляет всего 2.4 %, в то время как их встречаемость в сигнальных белках равна 13.2 %, т. е. в пять с половиной раз выше. Для оценки среднестатистической встречаемости АКО в сигнальных белках нами были проанализированы первичные структуры 750 таких белков, относящихся к различным их классам и участвующих в функционировании широкого спектра сигнальных систем.
Доля положительно заряженных АКО в ЦП-1 рецепторов пептидных и белковых гормонов существенно выше таковой в рецепторах биогенных аминов и МХР (33.6 % против 21.9 %). В полтора раза выше и усредненный заряд их ЦП-1: +3.6 против +2.4. В ЦП-1 бактериальных родопсинов доля положительно заряженных АКО значительна (33.9 %), но при этом сравнительно высока и доля отрицательно заряженных АКО (10.7 %), вследствие чего соотношение между ними составляет только 3.2:1, а их усредненный заряд равен +2.6. Сравнительно высокое содержание положительно заряженных АКО в ЦП-1 бактериальных рецепторов и рецепторов пептидных и белковых гормонов, которые являются более древними в сравнении с рецепторами биогенных аминов, может свидетельствовать о том, что на ранних этапах эволюции еще могло не быть столь жесткого разграничения функций и связанных с ними структурных особенностей ЦП рецептора, как это имеет место в рецепторах биогенных аминов.
Исследование молекулярных механизмов действия биогенных аминов на активность АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных с применением С-концевых пептидов а-субъединиц Gs- и Gj-белков
Принципиальных различий между модификацией пептида сегментом ТМ-5 и пальмитатом обнаружено не было, в то время как длина гидрофобного участка имела определяющее значение - пептиды с гидрофобными сегментами короче 7 АКО были неэффективны. Пептиды обладали способностью регулировать функциональную активность Gq и Gj/0 только в присутствии PARI, на основании чего был сделан вывод о том, что они взаимодействуют с их цитоплазматическими участками, локализованными в СКД рецептора, и, таким образом, запускают сигнальный каскад. Действие пептидов было высоко специфичным. Пальмитоилированный пептид, производный ЦП-3 PARI, активировал PARI и высоко гомологичный ему PAR2, но при этом не влиял на активность рецепторов холецистокинина, соматостатина и субстанции Р, негомологичных PARI. Наличие гидрофобного радикала важно как для пептидов, производных ЦП рецепторов, сопряженных с Gq и Gj/o, так и для пептидов, производных рецепторов, сопряженных с Gs-белками. Пальмитоилированный пептид, производный ЦП-3 Gs-сопряженного рецептора меланокортина-4, с высокой эффективностью (ЕС50100 нМ) стимулировал АЦ в культуре фибробластов (Covic et al., 2002а).
Основываясь на всей совокупности полученных данных, Кович и соавт. выдвинули гипотезу о существовании внутриклеточных пептидных агонистов и антагонистов, способных проникать через мембрану и с высокой эффективностью взаимодействовать с внутриклеточными сайтами рецепторов, которые определяют их сопряжение с G-белками (Covic et al., 2002b). Важнейшими характеристиками таких пептидных регуляторов, названных пепдуцинами, являются наличие гидрофобного радикала, размеры которого должны быть достаточны для проникновения пептида через мембрану, и соответствие по первичной структуре функционально важным для сопряжения с G-белками участкам ЦП рецептора. Высокая специфичность и селективность действия пепдуцинов позволяет использовать их как мощные терапевтические препараты, предназначенные для регуляции сигнальных путей.
Селективность и специфичность взаимодействия G-белков с рецепторами в основном определяется С-концевыми сегментами их Ga-субъединиц, что хорош объясняет способность синтетических пептидов, соответствующих этим сегментам, по конкурентному механизму ингибировать процессы передачи гормонального сигнала, осуществляемые через те типы Ga-субъединиц, производными первичной структуры которых они являются.
Наиболее изученным среди пептидов, производных С-концевых участков Ga-субъединиц, является С-концевой пептид 340-350 at (Hofmann, 1999; Morizumi et al., 2003). Показано, что он влияет на сопряжение родопсина в мета-Н-форме с активированным, ГТФ-связанным, Gt-белком. В отсутствие Gt пептид 340-350 мимикрирует его действие на мета-lb- и мета-Н-интермедиаты родопсина, стабилизируя их конформацию, и одновременно с этим препятствует взаимодействию между родопсином и трансдуцином.
Подход, заключающийся в использовании пептидов, соответствующих С-концевым сегментам Ga-субъединиц, был распространен и на другие их семейства. Показано, что пептиды, производные С-концевого сегмента Gas, по конкурентному механизму нарушают функциональное взаимодействие между рецепторами и сопряженными с ними Gs-белками, а также влияют на сродство рецепторов к гормону (Rasenick et al., 1994; Novotny et al., 1996). При этом С-концевые пептиды, производные одних типов Ga-субъединиц, практически не влияли на процессы передачи гормональных сигналов, осуществляемые через другие их типы. Так пептид 384-394 Gas блокировал стимуляцию р-агонистами активности АЦ, реализуемую через Gs-белки, в то время как пептид 335— 355 Gaj не влиял на этот процесс (Rasenick et al., 1994).
Для определения пространственной структуры С-концевого сегмента Gas была исследована конформация соответствующих ему пептидов (Albrizio et al., 2000; Dursi et al., 2002). Исследование структуры сравнительно короткого пептида 384-394 Gas показало, что он может находиться в двух стабильных конформациях, одна из которых включает a-поворот, другая - р-поворот 3-го типа (Albrizio et al., 2000). Повороты образованы пятью С-концевыми АКО пептида подобно тому, как это показано для Gas-субъединицы и более протяженных пептидов 380-394 и 374-394, в которых эти повороты участвуют в стабилизации спиральной конформации.
Обнаружено, что с увеличением длины пептидов, как правило, повышается их биологическая активность. Так среди С-концевых пептидов, производных Gas, наиболее активным был самый протяженный пептид 374-394 Gas. Пептид, 380-394, обладал очень низкой активностью. Это может быть связано с нахождением его N-концевых АКО в неупорядоченной конформации, что препятствует эффективному связыванию пептида с рецептором (Dursi et аі., 2002).
Для выяснения того, какой тип Ga-субъединиц участвует в реализации регуляторного влияния холецистокинина на цитоскелет, была использована трансфекция с помощью плазмид генов, кодирующих С-концевые участки Gcti2-, Ga - и Gaq-субъединиц (Le Page et al., 2003). Биологический эффект холецистокинина ингибировался С-концевыми пептидами Gotn- и, в меньшей степени, Са -субъединиц, и не менялся в присутствии С-концевого пептида Gctq-субъединицы. На основании этого был сделан вывод о том, что G12/13-, но не Gq/ii-белки участвуют в активации холецистокинином RhoA-зависимого механизма, осуществляющего реорганизацию актинового цитоскелета.
В настоящее время высказывается предположение о том, что двухкомпонентная система рецептор-С-белок функционирует как протонный насос, в котором в ответ на связывание гормона протоны переносятся с гуаниннуклеотидсвязывающего сайта G-белка на лигандсвязывающий сайт рецептора. С-концевой сегмент Goc-субъединицы рассматривается как ключевое звено, обеспечивающее такой межмолекулярный перенос протонов (Broadley et al., 2000). Это предположение подтверждается тем, что связывание пептида 340-350 трансдуцина с активированным светом родопсином увеличивает подвижность протонов и вызывает быстрое перераспределение водородных связей в пептиде (Aris et al., 2001).
Множественность молекулярных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства на клетку и участие в них гетеротримериых G-белков
Пептиды инсулинового суперсемейства представляют собой многочисленную группу полипептидных гормонов, включающую более 50 пептидов эндокринного и нейроэндокринного происхождения, которые характеризуются сходством структурно-функциональной организации их молекул. К этому семейству, наряду с инсулином, относятся релаксин, инсулиноподобные факторы роста-1 и -2 (ИФР-1 и ИФР-2), инсулиноподобные пептиды (ИПП) позвоночных и беспозвоночных животных, релаксиновый фактор INSL3 и релаксин/инсулин-подобные факторы 1 (INSL6) и 2 (INSL4), бомбиксины насекомых. Пептиды инсулинового суперсемейства имеют общее эволюционное происхождение (Murray-Rust et al., 1992; Smit et al., 1998). Предполагается, что они возникли в ходе эволюции примерно 600 миллионов лет назад у представителей Archaemetazoa, предшественников беспозвоночных и позвоночных животных, из общего анцестрального гена в результате его дупликации и последующей дивергенции образовавшихся генетических линий. Филогенетическое древо пептидов инсулинового суперсемейства, построенное на основе анализа их первичных структур, указывает на существование в его пределах трех кластеров, объединяющих наиболее близкие по структуре пептиды (Murray-Rust et al., 1992). Первый кластер включает инсулин и ИФР млекопитающих и гормоны насекомых - бомбиксины. Второй представлен релаксинами и релаксиноподобными пептидами рыб и млекопитающих. Третий включает ИПП моллюсков, в том числе группу ИПП моллюска Lymnaea stagnalis (Smit et al., 1998) и группу ИПП двустворчатого моллюска A. cygnea, открытых и охарактеризованных в нашей лаборатории (Русаков и др., 2003, 2004; Шипилов, 2004). Несмотря на то, что все пептиды инсулинового суперсемейства обладают существенной гомологией по отношению к инсулину, такое структурное сходство вовсе не означает сходства молекулярных механизмов их действия на клетку, о чем убедительно свидетельствуют результаты наших исследований и данные других авторов (подробный анализ дан в обзорах: Перцева и др., 1996; Pertseva et al., 2003; Перцева, Шпаков, 2002).
Схема действия инсулина на клетку включает следующие основные этапы: 1-й этап - связывание гормона с лигандсвязывающим доменом а-субъединицы инсулинового рецептора (ИР); 2) 2-й этап - активацию тирозинкиназы ИР и аутофосфорилирование остатков Туг, локализованных в р-субъединице ИР; 3-й этап - каскадное фосфорилирование активированным ИР широкого спектра адапторных и эффекторных белков, ответственных за конечные митогенные и метаболические эффекты гормона. На этом этапе возможно как прямое взаимодействие ИР с белками, содержащими Src-гомологичные домены (8Н2-белками), так и сопряжение с ними через посредство эндогенных субстратов ИР - IRS- и She-белков (подробный анализ дан в обзорах: Шпаков, 1999а; Шпаков, Перцева, 1999а, 19996). Среди БН2-белков наиболее важны ФИ-3-К, Sl-12-протеинфосфотирозинфосфатаза и адапторный ОРчВ2-белок, определяющие различные пути передачи генерируемого инсулином сигнала.
Однако описанный выше тирозинкиназный каскад является далеко не единственным молекулярным механизмом, через который осуществляется передача инсулинового сигнала. Как нами, так и другими авторами установлено, что вторичными посредниками в процессе передачи этих сигналов могут быть цАМФ и фосфолипиды (диацилглицерин и инозитолфосфогликаны) (подробный анализ дан в обзорах: Перцева и др., 1996; Pertseva et al., 2003). Исследование регуляторного действия инсулина на уровень цАМФ в клетке позволило нам открыть новый АЦ сигнальный механизм действия инсулина (Перцева и др., 1995, 1996; Pertseva et al., 1995, 1996, 2003; Шпаков, 1996а, 1996в; Plesneva et al., 2001; Шпаков и др., 20026, 2003е; Kuznetsova et al., 2003). Первый его этап включает активацию инсулином тирозинкиназы ИР и фосфорилирование Gi-белка, ведущего к его диссоциации на Gotj-субъединицу и GPy-димер. На втором этапе Gpy активирует ФИ-5-К, что ведет к образованию 3-фосфоинозитидов. На третьем этапе один из 3-фосфоинозитидов - фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат активирует атипичную форму UKCC,. На четвертом этапе ПКСС, фосфорилирует ccs-субъединицу G-белка и через нее стимулирует АЦ. Итогом этой сигнальной цепи является повышение уровня цАМФ в клетке, запускающего цАМФ-зависимые каскады (Pertseva et al., 2003).
Таким образом, сопрягающими компонентами в АЦ сигнальном механизме действия инсулина являются гетеротримерные G-белки, подобно тому, как это происходит в случае рецепторов серпантинного типа. Прямыми доказательствами их участия в АЦ сигнальном механизме действия инсулина являются обнаружение потенцирования ГН стимулирующего АЦ эффекта инсулина, а также тот факт, что обработка мембран КТ и XT либо полностью, либо в значительной степени блокирует этот эффект (Pertseva et al., 1996, 2003; Plesneva et al., 2001; Шпаков и др., 20026).
Об участии G-белков в регуляторных эффектах инсулина и родственного ему ИФР-1 свидетельствуют и данные других авторов (Malbon, 2004; Patel, 2004). Японские ученые синтезировали пептиды 1039-1061, 1135-1156 и 1319-1333, соответствующие участкам Р-субъединицы ИР (первый локализован в АТФ-связывающем, второй - в тирозинкиназном, третий - в С-концевом доменах) и содержащие ВВххВ-мотивы, которые непосредственно активировали G-белки (Okamoto et al., 1993). Пептиды 1039-1061 и 1325-1345 стимулировали ГТФ-связывание и ГТФазную активность соответственно Gs- и Gj/o-белков.
Нами был проведен теоретический сравнительный анализ АКП цитоплазматических доменов ИР с участвующими во взаимодействии с G-белками ЦП-3 рецепторов серпантинного типа (Шпаков, 1996а, 1996в; Шпаков, Перцева, 1999а). Его результатом стало обнаружение в юкстамембранном, АТФ-связывающем и С-концевом доменах ИР протяженных участков, обладающих высокой гомологией (до 30 % идентичности) по отношению к ЦП-3 ДР, СР, МХР и АР, причем при выравнивании совпадали кластеры положительно заряженных АКО, которые играют ключевую роль в сопряжении рецепторов с G-белками. В этой связи следует отметить, что эти кластеры высоко консервативны и среди рецепторов-тирозинкиназ инсулиновой группы. Так ВВххВ-мотив, расположенный в АТФ-связывающем домене ИР, высоко консервативен в рецепторах ИФР-1 и ИПП человека. Высоко консервативными являются и кластеры положительно заряженных АКО в N-концевом сегменте юкстамембранного домена этих рецепторов. Расположенный в С-концевом домене ИР ВВххВ-мотив KKNGR1341 1345 имеет гомолог и в рецепторе ИФР-1 (RKNER1323"1327). Таким образом, результаты наших теоретических исследований (Шпаков, 1996а, 1996в; Шпаков, Перцева, 1999а) и экспериментальные данные группы Окамото (Okamoto et al., 1993) дают основания полагать, что ВВххВ-мотивы, локализованные в АТФ-связывающем и С-концевом доменах ИР, играют определяющую роль во взаимодействии с Gs- и Gj-белками. Следовательно, консенсусные мотивы типа ВВххВ являются универсальными молекулярными детерминантами, которые ответственны за сопряжение с G-белками различных по своей структуре рецепторов, в том числе тирозинкиназного типа.
Регуляторное влияние биогенных аминов на активность АЦС в миокарде и скелетных мышцах крыс со стрептозотоциновым диабетом 1-го типа
Первый АЦ механизм действия релаксина включает три компонента - рецептор серпантинного типа, относящийся к LGR-семейству, гетеротримерный Gs-белок и фермент АЦ. Нами показано, что этот механизм функционирует в миокарде и мозге крысы, представителя позвоночных, но отсутствует в других исследованных нами объектах - скелетных мышцах крысы и мышцах беспозвоночных, моллюска A. cygnea и червя L. terrestris (Шпаков и др., 2005ж, 2006в, 2006г). Для исследования этого механизма нами был применен комплексный подход, который включал пептидную стратегию и АДФ-рибозилирование бактериальными токсинами. Это позволило не только доказать ключевую роль релаксинового рецептора LGR7 в процессе передачи генерируемого гормоном сигнала к ферменту АЦ в мозге и сердце крыс, но и выявить в его структуре детерминанты, ответственные за взаимодействие с Gs-белком.
Пептидная стратегия заключалась в применении как пептидов, соответствующих С-концевым сегментам 385-394 Gocs- и 346-355 Ga/2-субъединиц млекопитающих, так и впервые синтезированных нами пептидов, производных С-ЦП-3 релаксинового рецептора LGR7 серпантинного типа (Шпаков и др., 2005ж, 2006в, 2006г). Для выбора пептидов, производных LGR7, мы провели сравнительный анализ АКП различных рецепторов серпантинного типа, сопряженных с G-белками, и, основываясь на результатах этого анализа, предположили, что основную функцию в сопряжении и активации G-белка в рецепторе LGR7 должен выполнять его С-ЦП-3, что и подтвердилось в ходе дальнейших исследований.
Как известно, эффективность действия пептида в значительной степени определяется тем, насколько вторичная структура G-белок-связывающего и(или) G-белок-активирующего участка рецептора в его нативном состоянии соответствует таковой в синтетическом пептиде. Вследствие этого, в состав пептида необходимо включать не только сайты, непосредственно взаимодействующие с G-белком, но и соседние с ними участки, которые способствуют формированию оптимальной для такого взаимодействия конформации. В противном случае пептид может оказаться не активным. Для стабилизации биологически активной конформации применяются следующие подходы: (1) увеличение длины пептида; (2) введение в него гидрофобных радикалов или сегментов ТМ; (3) создание циклических и разветвленных структур, имитирующих ЦП рецептора. Последние два подхода являются наиболее перспективными (Covic et al., 2002а, 2002b, подробный анализ дан в главе 2).
Для выяснения того, как длина и наличие гидрофобных радикалов влияют на способность пептидов взаимодействовать с G-белками и конкурентно нарушать процесс передачи гормонального сигнала, были синтезированы различающиеся по своей протяженности пептиды 619-629 (11 АКО) и 615-629 (15 АКО), а также пептиды 619-629-Lys(Palm) и 615-629-Lys(Palm), модифицированные пальмитатом. К сожалению, пептид 615-629-Lys(Palm) обладал очень низкой растворимостью и не мог быть использован в биологических экспериментах. Действительно, нами было установлено, что с увеличением длины пептида всего на 4 АКО эффективность его взаимодействия с G-белками и способность ингибировать проведение релаксинового сигнала через АЦС резко возрастают. Так 11-членный пептид 619-629 практически не влиял на стимуляцию релаксином АЦ и ГТФ-связывания. В то же время, 15-членный пептид 615-629 был в этом отношении активен. Введение гидрофобного радикала в пептид 619-629 настолько повысило его биологическую активность, что по своему влиянию на стимулирующий ЛЦ эффект релаксина, он даже превосходил более протяженный пептид 615-629. Полученные нами данные указывают на то, что молекулярные детерминанты, необходимые и достаточные для взаимодействия с G-белком, локализованы в участке 619-629 рецептора. В то же время для стабилизации конформации, позволяющей пептиду 619-629 эффективно взаимодействовать с молекулой G-белка, в его структуру необходимо либо введение гидрофобного радикала, либо удлинение пептида, что и реализуются в случае пептидов 619-629-Lys(Palm) и 615-629. Не исключено также, что наличие гидрофобного радикала позволяет пептиду заякориваться в мембране вблизи сайтов рецептора и G-белка, что обеспечивает более эффективное взаимодействие между ними. Это приводит к повышению концентрации пептида в периплазматическом пространстве и позволяет достичь выраженного биологического эффекта при более низких его концентрациях.
Исследование регуляторного действия релаксина на компоненты АЦС в различных тканях и объектах показало, что, хотя он и оказывает на функциональную активность ЛЦ и ГТФ-связывание G-белков стимулирующее влияние, но действует через различные типы рецепторов и, следовательно, его действие характеризуется тканевой и видовой специфичностью. В мозге и миокарде крысы релаксин-2 млекопитающих осуществляет свой стимулирующий АЦ эффект через релаксиновый рецептор LGR7 серпантинного типа, сопряженный с Gs-бслком. Об участии в процессе передачи релаксинового сигнала рецептора LGR7 свидетельствует тот факт, что пептиды 619-629-Lys(Palm) и 615-629, производные С-ЦП-3 рецептора LGR7, по конкурентному механизму с высокой эффективностью ингибируют стимуляцию релаксином активности АЦ и ГТФ-связывания (Шпаков и др., 2005ж, 2006в, 2006г).
О функциональном сопряжении релаксинового рецептора LGR7 с Gs-белком в мозге и миокарде крысы свидетельствуют следующие факты. Во-первых, ингибирование стимулирующего АЦ и ГТФ-связывание эффекта гормона пептидом 385-394 Gas. Во-вторых, блокирование АЦ эффекта гормона в мембранах, подвергнутых АДФ-рибозилированию XT, который переводит Gs-белок в перманентно активированное состояние и выключает его из процесса передачи гормонального сигнала. В свою очередь, Gi-белок в реализации эффекта релаксина на АЦ в мозге и миокарде не участвует, поскольку ни пептид 346-355 Gaj2, по конкурентному механизму нарушающий взаимодействие рецепторов с Gj-белком, ни АДФ-рибозилирование КТ, ведущее к инактивации Gj-белка, заметно не влияют на регуляцию релаксином АЦ в этих тканях.
В то же время пептиды 619-629-Lys(Palm) и 615-629 были не эффективны в отношении стимуляции АЦ релаксином в скелетных мышцах крысы и мышечных тканях беспозвоночных - моллюска A. cygnea и червя L. terrestris, что согласуется со следующими фактами. Во-первых, у человека рецептор LGR7 экспрессируется в различных отделах головного мозга и сердечной мышце, но практически не обнаруживается в скелетных мышцах (Hsu et al., 2003). Во-вторых, в геномах беспозвоночных не выявлено генов, которые бы кодировали белки, обладающие заметной гомологией по отношению к релаксиновыми рецепторами серпантинного типа позвоночных, на что указывают результаты проведенного нами с помощью программы BLASTx (www.ncbi.nlm.nih.gov) сравнительного анализа аминокислотных и нуклеотидных последовательностей, имеющихся в GenBank. Все это свидетельствует в пользу функционирования в скелетных мышцах крысы и мышечных тканях моллюска и червя другого АЦ сигнального механизма действия релаксина, который осуществляется через шестикомпонентную цепь сигнальных белков (Шпаков и др., 2004е; Shpakov et al., 2005b; Pertseva et al., 2006). Структурно-функциональная организация этого механизма сложнее той, которая предполагается для АЦ механизма, осуществляемого через релаксиновые рецепторы серпантинного типа, относящиеся к LGR-семейству.
