Содержание к диссертации
Введение
Список сокращений 2
Актуальность 10
Цель работы 13
Задачи 13
Научная новизна 14
Положения, выносимые на защиту 15
ГЛАВА 1 Поверхностные белки-мишени клеток, образующих гематоэнцефалический барьер, и адресная терапия низкодифференцированных глиом (обзор литературы). 17
Введение 17
Методология поиска новых белков ЭЦМ 18
Маркеры эндотелия церебральных микрососудов 21
Базиджин (НТ7, 5А11, CD147, Мб, EMMPRIN, 0X47) 21
Эндотелиальный барьерный антиген (ЕВА) 25
Перицит-ассоциированный 140 кДа антиген (аминопептидаза-N) 29
Кавеолины 30
Трансферриновый рецептор (CD71) 32
Ферментные и транспортные системы церебральных эндотелиоцитов у-Глутамилтранспептидаза 36
Переносчики глюкозы из семейства GLUT 38
Транспортеры аминокислот 40
Транспортеры органических анионов семейства ОАТР 41
Монокарбоксильные транспортеры (МСТ) 45
Транспортер активного выброса (Р-гликопротеин, MDR1) 46
Белки межклеточных контактов структур ГЭБ 49
Белки плотных контактов 49
Белки щелевых контактов 57
Изменения поверхностных белков ЭЦМ при патологии ГЭБ 60 Моноклональные антитела к белкам-мишеням для диагностики и терапии
низкодифференцированных глиом 61
Общие аспекты адресной терапии глиом с помощью моноклональных антител 63
Адресная терапия с помощью антител к рецепторам факторов роста 64
Адресная радиоиммунотерапия с помощью антител к белкам внеклеточного матрикса...69
Перспективы адресной терапии с помощью антител к эндотелиальным антигенам
опухолевых микрососудов 72
Адресная доставка наноконтейнерных форм цитостатических препаратов 75
Активная загрузка наноконтейнеров цитостатиками 77
Контролируемое высвобождение активного вещества 80
Придание наноконтейнерам «векторных» свойств 82
Заключение 85
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 90
Препаративные методы вьщеления и очистки нативных мембранных белков церебральных
эндотелиоцитов 90
Выделение фракции церебральных микрососудов 90
Солюбилизация мембранных белков 91
Фракционирование и очистка мембранных белков 92
Дизайн рекомбинантных внеклеточных фрагментов BSAT1, Сх43 и VEGFR1 (sFlt) а также рекомбинантного VEGF 92
Первичная структура и мембранная топология внеклеточных фрагментов
исследуемых белков 93
Клонирование и экспрессия внеклеточных фрагментов В SAT 1 и Сх43 95
Методы анализа полученных нативных и рекомбинантных белков 100
Определение концентрации ДНК и белка 100
Диск-электрофорез в ПААГ с SDS 101
Иммуноблоттинг 103
Иммуноферментный анализ 103
Лиганд-рецепторный анализ 105
- Маркеры эндотелия церебральных микрососудов
- Транспортеры аминокислот
- Адресная доставка наноконтейнерных форм цитостатических препаратов
- Дизайн рекомбинантных внеклеточных фрагментов BSAT1, Сх43 и VEGFR1 (sFlt) а также рекомбинантного VEGF
Маркеры эндотелия церебральных микрососудов
На данный момент идентифицированы более 40 различных белков, входящих в состав ПК эпителиальных, эндотелиальных и глиальных клеток [165, 169]. К ним относятся белки Zonula ocludens (ZO)l-3, контактные адгезивные молекулы (JAM), окклю дины и клаудины (Рис. 2). Структурно белки плотных контактов можно поделить на трансмембранные и цитоплазматические, а функционально можно выделить белки, отвечающие за формирование и поддержание барьера, межклеточную адгезию, паракле-точную проницаемость и передачу сигналов. Трансмембранные белки ПК связаны с внутриклеточными белками-адапторами, образующими «цитоплазматический якорь», взаимодействующий с белками цитоскелета. Этот белковый комплекс тесно взаимосвязан с различными сигнальными молекулами, регулирующими не только функциональное состояние ПК, но и процессы пролиферации и дифференцировки [162, 170]. Из сигнальных белков со структурами плотных контактов взаимодействуют G-белки, различные протеинкиназы, протеин- и липидфосфатазы, различные ГТФ-связывающие белки. С помощью этих сигнальных молекул регулируется сборка и деградация ПК, а также, путём модуляции функций тех или иных компонентов ПК, селективная проницаемость межклеточных пространств для различных веществ [171]. Кроме того, передача сигналов от ПК осуществляется особым классом белков «челноков», получивших название NAC-белки (от англ. Nucleus and Adhesion Complexes). Эти белки характеризуются двойной локализацией: они обнаруживаются в области ПК и в ядре, куда они мигрируют и регулируют там генетическую экспрессию. Большинство этих белков являются транскрипционными факторами (Y-box фактор ZONAB, huASHl, c-fos, c-jun), либо белками, с ними взаимодействующими, в частности киназа CDK4 [170].
Важным моментом является то, что в ЭЦМ в большом количестве экспресси-руются не только интегральные белки плотных контактов, но и трансмембранные белки адгезивных контактов (кадгерины), а также периферические молекулы обоих типов контактов (белки ZO и катенины). При этом с помощью конфокальной микроскопии определяется ко локализация этих белков. Такая ко локализация показана для Е-кадгерина, Р-катенина, окклюдина и белка JAM-A (junctional adhesion molecule-A). С перечисленными белками также колокализуется а-адаптин — маркер клатрин-опосредованного эндоцитоза [172]. В этой же работе обнаружен интересный факт, что снижение концентрации кальция в среде, приводящее к нарушению кальций-зависимых кадгериновых контактов клеток с субстратом сопровождается интернализа-цией как белков адгезивных, так и белков плотных контактов. Пространственная взаимосвязь белков плотных и адгезивных контактов с системами эндоцитоза свидетельствует о тесной функциональной взаимосвязи всех этих компонентов в мембране [166]. Окклюдин Окклюдин — фосфопротеин с молекулярной массой 65-кДа, обнаруженный первым и поэтому наиболее изученный интегральный контактный белок плотных контактов [173]. Окклюдин был открыт и локализован как компонент фибрилл ПК в 1993 году методом иммуноэлектронной микроскопии [174]. Это политопный белок, имею щий четыре трансмембранных домена, цитоплазматические С- и N-концы и две внеклеточные петли, состоящие в основном из глицина и тирозина [162]. Мембранная топология окллюдина первоначально была предсказана теоретически, а затем подтверждена многочисленными экспериментами, включающими определение сайтов связывания с цитоплазматическими (ZOl-З) и экстраклеточными белками, N-гликозилирование участков внеклеточных цепей и оценку доступности тех или иных эпитопов белка в клетках с ненарушенной целостностью мембраны [175]. Экспрессия окклюдина у позвоночных обеспечивается одним геном, однако описаны пять различных изоформ белка, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга [176].
Окклюдин — важный, но не основной интегральный компонент ПК. Это было доказано в экспериментах по трансфекции или, наоборот, интерференции его гена [177]. Примечательно, что у мышей с нокдауном гена окклюдина не наблюдается каких-либо очевидных нарушений функции ПК, однако, такие мыши бесплодны и имеют комплекс фенотипических нарушений, обусловленных дефектами дифференцировки эпителия в различных органах и тканях, что подтверждает взаимосвязь окклюдина с передачей дифференцировочных сигналов [161].
Клаудины
Клаудины — небольшие олигомерные белки с молекулярной массой 20 — 22 кДа, функционирующие в мембране в виде димеров. Название «клаудины» происходит от латинского "claudere" — закрывать. Существование этих белков первоначально было предположено теоретически, после открытия того, что эмбриональные стволовые клетки с нокаутированным геном окклюдина сохраняли возможность дифференцироваться в эпителиальные клетки и формировать плотные контакты [178]. В дальнейшем клаудины-1 и -2 были выделены и идентифицированы с помощью стандартного биохимического протокола выделения мембранных белков, исходя из предположения, что неизвестный трансмембранный белок, колокализованный с окклюдином, должен содержаться в тех же фракциях во время очистки [179]. Оказалось, что мембранная топология и параметры солюбилизации клаудинов действительно совпадают с аналогичными у окклюдина, несмотря на существенно меньшую молекулярную массу. Подобно окклюдину, клаудины имеют две внеклеточные петли, с помощью которых осуществляется взаимодействие близлежащих клеток; более короткие чем у окклюдина NH2- и СООН терминали у клаудинов также расположены внутриклеточно. (Рис. 2).
В настоящее время в базе данных GenBank содержится информация о 20 кла-удинах человека и животных, каждый из которых может иметь несколько различных изоформ с гомологией первичной последовательности от 12.5% до 70% (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), причем наибольшая вариабельность у клауди нов наблюдается во внеклеточных петлях. В соответствие с гомологией клаудины объединяют в подсемейства, у членов которых наиболее вероятны общие функции.
Клаудины широко представлены в плотных контактах различных тканей. Считается, что полиморфизм членов этого семейства а также различные варианты их экспрессии в органах и тканях определяют функциональные особенности того или иного вида ПК [162] У человека гены клаудинов локализованы на 3, 7, 16, и 21 хромосомах. Примечательно, что белок, аналогичный клаудинам позвоночных, обнаруживается и у других, более древних животных. В частности, аналоги клаудинов выделены из сеп-тальных контактов эпителия Drosophila melanogaster [180].
Функциональные характеристики клаудинов позволяют с уверенностью говорить об их непосредственном участии в формировании барьера. Так, все клаудины обладают способностью спонтанно полимеризоваться в линейные фибриллы и формировать разветвленную параклеточную сеть при трансфекции гена клаудина в несодержа-щие этот белок фибробласты [169]. Этот феномен отличает клаудины от окклюдина, петли которого формируют только короткие фрагменты, напоминающие бусы. Возможность полимеризации в латеральном направлении, более выраженные, чем у окклюдина, адгезивные свойства, а также многократное повышение электрического сопротивления монослоя клеток и снижение уровня диффузии средне- и высокомолекулярных соединений после трансфекции генов клаудинов позволяет считать именно их основными формирующими ПК белками [45].
Тканевая и клеточная специфичность клаудинов, определяемые различными методами, могут существенно разниться. Клаудин-5, например, обнаруживается только в эндотелиальных клетках, образующих ПК, вне зависимости от их тканевой локализации [181]. Аналогично этому довольно узкие паттерны экспрессии характерны для клаудинов-11 (олигодендроглиоциты и клетки Сертоли) и -16 (почечный эпителий). Несмотря на то, что тканевая и клеточная специфичность всех открытых клаудинов пока окончательно не выяснена, считается, что клаудины 1, 4 и 5 более характерны для эндотелия ГЭБ [162].
Транспортеры аминокислот
Изотипирование полученных моноклональных антител проводили с помощью набора IS02 (Sigma-Aldrich) в соответствии с рекомендациями производителя. Кратко: в лунки высокоадгезивной полистироловой планшеты (Corning) вносились очищенные поликлональные изотип-специфические антитела козы к IgGl, -2а, -2Ь, -3, IgM и IgA мыши. После инкубации в течение 2 часов при 37С и промывки PBS в лунки добавлялись тестируемые образцы супернатантов, а затем, после соответствующей промывки — антимышиные антитела А9917 (Sigma-Aldrich) меченные пероксидазой. Проявление иммуноферментной реакции проводили с помощью раствора ТМВ (readyo-use, Amresco).
Определение коэффициента аффинности проводили по методу, предложенному J.D. Beatty et al. [377]. Для этого в лунки полистироловой планшеты вносили анти 110 ген в известной концентрации, подобранной таким образом, чтобы она была заведомо меньше ёмкости высокоадгезивного пластика (например — 10 нг) и в концентрации в два раза больше первой. Затем методом непрямого ИФА определяли концентрацию антител, соответствующую 50% связыванию антител с антигеном, иммобилизованным на плашке [АЬ1], а также концентрацию антител, соответствующую 50% связыванию с антигеном при вдвое большем количестве антигена [АЬ]. Далее константу вычисляли по формуле: Kaj=l/2(2[Ab ]-[Ab]) Модификации моноклональных антител Биотинилирование Биотинилирование моноклональных антител проводили с помощью набора ProtOn (Vector Lab, USA) по протоколам производителя. Кратко: к 1 мг очищенных антител, диализованных против буфера, не содержащего первичные амины (обычно — PBS) добавляли 100 мкг сукцинэмидного эфира биотина (biotin labeling reagent) и аккуратно перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 1М этаноламина или 1М триса. Избыток несвязавшегося биотина удаляли с помощью гель-фильтрационной колонки, входящей в состав набора. Эффективность биотинилирования определяли с помощью Авидин-агарозы, входящей в состав набора. Для этого к5ц1 биотинилированных антител добавляли 50 ці суспендированной Авидин-агарозы, инкубировали 30 минут, после чего центрифугировали и в надосадке определяли концентрацию белка. По соотношению концентрации белка до и после инкубации с Авидин-агарозой определяли % биотинилированных антител.
Мечение флюоресцентной меткой
При проведении экспериментов с флюоресцентной визуализацией in vitro и in vivo очищенные моноклональные антитела метили флюоресцентными красителями серии Alexa Fluor (Invitrogen, USA). Для этого антитела диализовали против PBS, чтобы полностью удалить первичные амины, и инкубировали с сукцинэмидными эфирами Alexa Fluor 488, -555 или 660 в молярном соотношении 1:10 в течение часа. Избыток несвязавшегося красителя удаляли с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадек-сом G-50. Мечение радиоактивным изотопом (1 51) Для проведения экспериментов по биораспределению моноклональных антител мы метили их 1251. Все работы с радиоактивными метками проводили на базе ра 111 диоизотопного блока Института биоорганической химии им. Н.Н. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (руководитель блока, д.х.н. Ю.С. Скоблов). В качестве реактива выбора при иодировании антител предлагается Иодоген, поскольку по сравнению с другими применяемыми для этих целей окислителей (например - с хлорамином-Т) Иодоген в наименьшей степени вызывает денатурацию антител [378]. Кроме того, Иодоген водонерастворим, и таким образом, в отличие от других окислителей, не попадает в образец и не требует дополнительных стадий очистки. Принцип метода заключается в том, что Иодоген окисляет I до h, который вступает в реакцию электрофильного замещения в ароматическое кольцо тирозина в ортополо-жении. Иодирование проводили по следующему протоколу.
1. Сухой Иодоген (Sigma-Aldrich) разводили в дихлорметане в концентрации 1 мг/мл, аликвотировали по 50 и 100 \ig в полипропиленовых пробирках объёмом 2 мл и высушивали под током аргона. Полученные аликвоты хранили при -80С (использовали в течение 5 лет без потерь активности).
2. Разводили 40 мкл (37мБк) Na125I («Изотоп», СПб) добавлением 10 мкл 50мМ фосфатного буфера.
3. В пробирку с иодогеном добавляли Na125I из расчета 37мБк (1 mCi)/100 - 200 мкг белка и инкубировали при комнатной температуре 20 минут.
4. По окончании реакции йодирования аккуратно отбирали жидкую фазу (иодоген, нерастворимый в воде остается на стенках пробирки) и проводили обессолива-ние меченного белка.
Обессоливание
Удаление несвязавшегося йода проводили двумя способами: гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 и центрифугированием на микроколонках с сефадексом G-15 — G-50. Последний способ позволяет быстро и одномоментно обессоливать несколько различных препаратов без сопутствующего классической гель-фильтрации разведения белка. Обессоливание проводили по следующему протоколу:
1. Замочить сефадекс G-15 — G-50 в фосфатном буфере на несколько часов, декантировать получившийся сорбент.
2. Инкубировать 1 час в 1%-ном BSA
3. Сформировать микроколонки из шприцов на 2-, 3- или 5 мл, промыть несколько раз фосфатным буфером, центрифугировать при 1000 об/мин в бакет-роторе для удаления из колонок лишнего буфера ("столбики" сорбента должны слегка от 112
слаиваться от стенок). Следует учитывать, что сефадекс G-50 во время центрифугирования уплотняется, a G-15 — нет.
4. Нанести на подготовленные микроколонки радиоактивный препарат, подлежащий обессоливанию из расчета 20-30% от объема колонки и центрифугировать 1000 об/мин - 2 мин. Для контроля обессоливания в одну из микроколонок можно нанести смесь Blue Dextran и K3Fe[Fe(CN)6] (красная кровяная соль).
5. Отобрать элюат (обессоленный белок). Для повторного использования микроколонки промыть 20 V фосфатного буфера.
Радиохимическую чистоту меченных I антител определяли методами тонкослойной хроматографии и диск-электрофореза в полиакриламидном геле с SDS с последующим анализом радиоактивности фракций в сцинтилляционной камере Imager (HP). Удельная радиоактивность полученных меченных препаратов обычно находилась в пределах 0,1 — 0,3 mCi/100 ug, таким образом эффективность мечения с помощью иодогена колебалась от 10 до 30%. Радиохимическая чистота полученных препаратов составляла не менее 98%.
Методы иммунопероксидазной и флюоресцентной визуализации
Иммуноцитохимический анализ
Иммуноцитохимический анализ проводили на фиксированных и живых клетках низкодифференцированных глиом крысы (С6, 101/8) и человека (U87, U251), а также фиксированных астроцитах и фибробластах крысы. В зависимости от цели иммуно-цитохимического анализа исследуемые клетки высевали в 35 мм чашки Петри с дном в виде покровного стекла (Costar), или в 48 луночные планшеты, с покровными стёклами (110мм на дне или на пластик в 96 луночные планшеты (Costar) и культивировали в среде DMEM с 10%) FBS при 37С во влажной атмосфере с 5% С02.
Иммуноцитохимический анализ на фиксированных клеточных препаратах
Для иммуноцитохимического анализа на фиксированных препаратах клетки наращивали до 80-100% конфлюентности, после чего удаляли среду, трехкратно промывали PBS, добавляли 4%-ный раствор формальдегида на PBS и инкубировали 30 минут в холодильнике, после чего снова трехкратно отмывали в PBS и окрашивали в соответствии с одним из приведенных ниже протоколов:
Адресная доставка наноконтейнерных форм цитостатических препаратов
Полученная в результате градиентного центрифугирования в декстране и последующего осмотического лизиса очищенная фракция мембран эндотелиоцитов (препарат №2) была использована для иммунизации и последующего слияния, в результате которого были получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела (МАЬ2В6), специфичные к антигену эндотелиоцитов церебральных микрососудов.
В дальнейшем, получив высокоочищенный препарат антител МАЬ2В6, мы показали наличие большого количества антигена в препарате №2 и попытались произвести доочистку антигена под контролем иммуноблоттинга.
Дальнейшие эксперименты уже с контролем в виде иммуноблоттинга МАЬ2В6 показали, что все попытки получить водорастворимую форму церебрального эндотелального антигена, специфичного для этих антител (осмотический лизис и сонификация, экстракция в различных концентрациях тритона Х-100 и Твина-20) приводят к потере его иммунохимической активности, вследствие чего белок не удаётся визуализировать методом иммуноблотт-анализа. С подобной проблемой сталкивались и исследователи ЕВА: L. Sternberger et al. [78, 42], получившие SMI -71 — моноклональные антитела специфичные к эндотелиальному барьерному антигену, не смогли очистить ЕВА вследствие потери его иммунохимической активности после деструкции эндотелиальных мембран. Этот феномен позволяет предположить, что антитела к ЕВА распознают некую конформационную детерминанту, которая разрушается при лизисе мембран (L. Sternberger, личное сообщение).
Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к AMVB1 и характеристика специфичности моноклональных антител
В результате проведения 6 слияний и анализа около 5000 образцов супернатан-тов из большого количества положительно реагирующих гибридом было выбрано 8, супернатанты которых содержали аффинные МАЬ к антигенам эндотелиоцитов церебральных микрососудов. Поскольку проводить последовательные серии реклонирова-ния и анализа супернатантов для каждой из этих гибридом одномоментно не представлялось возможным, была отобрана одна гибридома (2В6), характеризующаяся наибольшим процентом антитело-продуцирующих гибридных клеток и наибольшей аффинностью специфических иммуноглобулинов (класс G), обозначенных нами МАЬ2В6 (антитела к AMVB1).
Клетки гибридомы 2В6 были проведены через серию реклонирований под контролем высокочувствительного иммуногистохимического метода, разработанного нами на основе авидин-биотинового пероксидазного кита «ABC-Vectastain» (Vector Lab., USA) с усилением окрашивания DAB с помощью СоС12. После проведения седьмой процедуры реклонирования, супернатанты из 97% лунок окрашивали эндотелиоциты микрососудов мозга с одинаковой интенсивностью, что свидетельствовало об устойчивой секреции гибридными клетками моноклональных антител. Таким образом, было получено более 50 положительно реагирующих субклонов 2В6, из которых для дальнейшей работы отобрали один, характеризующийся максимальным выходом антител к AMVB1.
Гибридные клетки этого субклона были введены внутрибрюшинно 50 мышам Balb/c для получения асцита. Асцит также проверяли иммуногистохимически, положтельные пробы объединялись и хранились в холодильнике глубокого холода (-80). Гибридные клетки из асцита отделяли центрифугированием и либо снова вводили в мышь, либо стерильно замораживали в жидком азоте в среде с ДМСО и нормальной сывороткой лошади. Данная технология позволяет в любое время провести размораживание гибридных клеток и, после процедуры реклонирования, снова ввести их в мышь и получить асцит в неограниченном количестве.
Для проведения иммуногистохимического анализа специфичности и экспериментов по адресной доставке МАЬ2В6 очищали с помощью аффинной хроматографии на протеин-А-сефарозе. Фракцию IgG отбирали под контролем фотометра, концентрировали методом ультрафильтрации и хранили при -20 в растворе 50% глицерина. Им-мунохимическая целостность антител контролировалась иммуногистохимически на каждом этапе очистки и концентрирования. Чистота полученных МАЬ2В6 была оценена в диск-электрофорезе в ПААГ с SDS и составляла не менее 90%.
Иммуногистохимическая характеристика AMVB1
Иммуногистохимический анализ очищенного препарата МАЬ2В6 показал, что они высокоаффинно связывались с антигеном эндотелиоцитов церебральных микрососудов, преимущественно синтезируемом в микрососудах мозжечка (Рис. 10, Рис. 11). Церебральные микрососуды визуализировались с применением как иммунопероксидазной, так и иммунофлюоресцентной техники при разведении МАЬ2В6 от 1:1000 до 1:100000. При больших разведениях (вплоть до 1:300000) также визуализировались микрососуды, но интенсивность окрашивания снижалась. При разведениях менее 1:1000 резко увеличивалось тонирование фона, вследствие неспецифической сорбции антител. Рекомендуемый рабочий диапазон разведений полученного препарата МАЬ2В6 составляет 1:5000 — 1:10000 (при концентрации стокового раствора 2,5 мг/мл), что эквивалентно концентрациям 0,25 — 0,5 мкг/мл. Столь низкие рабочие концентрации свидетельствовали о высокой константе аффинности МАЬ2В6. И действительно, определенная по методу Beatty et al. [377] константа аффинности МАЬ2В6 составила l,5xlO"9M"\
При усилении окрашивания DAB с помощью импрегнации СоС12 чувствительность метода повышалась в 3 — 5 раз (Рис. 10Б).
1 МАЬ2В6. А. Проявление диаминобензидином. Увеличение 1x200. Б. Усиление иммуно-гистохимического окрашивания с помощью импрегнации СоСЬ Увеличение 1x400. В. Иммунофлюоресцентная визуализация с помощью вторичных антител, меченных Alexa 594 (Invitrogen). Ядра клеток докрашены DAPI (Invitrogen)
Рис. 11. Иммуногистохимический анализ эндотелиального антигена AMVB1 с помощью моноклинальных антител 2тВ6 на срезах мозга крысы. А. Кора мозжечка. Б. Кора больших полушарий. Вторичные биотинилированные антитела ВА-2000 (Vector Lab, USA); проявление с помощью комплекса авидин -биотин-пероксидаза (Vector Lab, USA). xlOO.
При иммунопероксидазном окрашивании AMVB1 на срезах коры мозга церебральные микрососуды также визуализировались, однако интенсивность их окрашивания снижалась. Помимо коры мозжечка, наиболее выраженное окрашивание наблюдалось в ростральных отделах неокортекса, в гипоталамусе в среднем и в продолговатом мозге. Визуализировались как мелкие микрососуды (8 — 10 мкм), так и довольно крупные элементы сосудистого русла (100 и более мкм).
Абсорбция первичных антител сухой плазмой крови и экстрактами органов и тканей не оказывала видимого влияния на интенсивность окрашивания. В то же время абсорбция гомогенатом ткани головного мозга приводила к резкому снижению интенсивности окрашивания, вплоть до его исчезновения.
Дизайн рекомбинантных внеклеточных фрагментов BSAT1, Сх43 и VEGFR1 (sFlt) а также рекомбинантного VEGF
МАЬЕ2Сх43 + липосомы со стрептави-дином. Б. Конкурентное ингибирование связывания биотинилированных антител прединкубацией с избытком небиотинилированных. В. Биотинилированные неспецифические IgGm + липосомы со стрептавидином. Г. Биотинилированные МАЬЕ2Сх43 + липосомы без стрептавидина. Увеличение 630. В экспериментах по направленному транспорту бинарная авидин-биотиновая система была выбрана из нескольких соображений. Во-первых константа диссоциации ком 204 плекса стрептавидин-биотин (10"15 М) на шесть порядков ниже, средней константы диссоциации комплекса антиген-антитело (не менее 10"9 М), вследствие чего применение первого комплекса должно многократно повысить специфичность накопления транспортируемых липосомальных контейнеров. Во-вторых в случае применения бинарной системы, конъюгация стрептавидина с молекулой липосом приводит к образованию существенно меньшего комплекса, чем при конъюгации с липосомои антител (молекулярная масса стрептавидина почти в три раза меньше молекулярной массы иммуноглобулинов G). Кроме того, весьма важным является следующий методический аспект: при биотинилирова-нии сукцинимидным методом иммунохимическая активность моноклональных антител изменяется в меньшей степени, чем при тиолировании, необходимом для пришивки антител к липосомам малеимидным методом. С учётом всех перечисленных факторов, для экспериментов in vitro и, особенно, in vivo двухкомпонентные системы на основе биоти-нилированных антител и липосом со стрептавидином предпочтительнее, чем иммуноли-посомы.
Разработанная нами двухкомпонентная система на основе биотинилированных антител к Сх43 и липосом со стрептавидином показала высокую селективность по отношению к Сх43-положительным клеткам глиомы in vitro. Адгезия векторных липосом на мембранах клеток может способствовать слиянию билипидных слоев и интернализации содержимого липосом. Для интенсификации процесса интернализации в состав векторных липосом могут быть введены дополнительные компоненты (в частности ТАТ пептид или другие факторы, способствующие проникновению через мембрану клетки).
Адресная доставка иммунолипосом с флюоресцентной меткой или МРТ-контрастом в очаг экспериментальной глиомы С6 с помощью моноклональных антител к Сх43 и GFAP
Дефект гематоэнцефалического барьера в опухолевых микрососудах делает возможным пассивное проникновение наноконтейнеров из опухолевых микрососудов в ин-терстициальную жидкость. Однако селективное (активное) накопление наноконтейнера в опухоли возможно лишь при наличии опухоль-специфического вектора — моноклональ-ного антитела, аптамера, аффинного пептида или другого лиганда, избирательно распознающего какой-либо белок-мишень на опухолевых клетках. Применение гетеробифунк-циональных агентов (например, DSPE-PEG с maleimide group) позволяет ковалентно пришивать к липосомам такие молекулы, обеспечивающие адресность наноконтейнеров.
В случае высокоинвазивных глиальных опухолей (high-grade gliomas) наиболее актуальной зоной для наноконтейнерной доставки лекарств является периферия опухоли. Именно в этой перитуморальной области происходит активная инвазия глиомных клеток, внедряющихся в нормальную нервную ткань длинными перивазальными и периневраль-ными тяжами. Перитуморальная зона со стороны здоровой ткани окружена мощным валом из реактивных астроцитов, в большом количестве продуцирующих GFAP и Сх43. Как отмечалось выше, моноклональные антитела к этим белкам способны накапливаться в перитуморальной зоне, там, где гибнет наибольшее количество реактивных астроцитов и высвобождается антиген-мишень. Получив обнадёживающие результаты в экспериментах in vitro, мы спланировали эксперимент по оценке эффективности доставки ПЭГилирован-ных иммунолипосом на основе моноклональных антител к GFAP и МАЬЕ2Сх43 в периту-моральную зону экспериментальной интракраниальной глиомы in vivo.
К сожалению, первые же опыты с бинарной системой (биотинилированные МАЬ Е2Сх43 + стрептавидин, меченный I) in vivo показали отсутствие специфического накопления стрептавидина в опухоли, вне зависимости от количества и времени экспозиции вводимых биотинилированных антител. Вероятнее всего, это обусловлено наличием эндогенного биотина, доля которого в организме остаётся достаточно высокой, несмотря на безбиотиновую диету и др. приёмы, рекомендуемые в ряде работ. В этой связи, в экспериментах in vivo мы решили применить классические иммунолипосомы, векторизованные непосредственно моноклональными антителами.
При приготовлении липосом для экспериментов с МРТ в смесь липидов добавляли GD-DTPA-BSA (iQsynthesis, USA) до 37 мольных %. К синтезированным ПЭГилиро-ванным липосомам пришивали МАЬЕ2Сх43 или МАЬ GFAP, предварительно модифицированные 2-иминотиоланом, который реагирует со свободными первичными аминогруппами белка (є-аминогруппьі лизина), присоединяя к ним защищенную SH-группу. Очистку stealth-липосом с ковалентно связанными антителами от несвязавшихся антител проводили с помощью гель-фильтрации на сефадексе G100. Эффективность связывания антител с липосомами оценивалась по соотношению концентрации белка во фракциях липосом и несвязавшихся антител. Этот показатель составил около 80%.
Внутривенное введение липосом. 24 животных с экспериментальной глиомой случайным образом поделили на две группы по 12 животных. В первой группе вводили флюоресцентно меченые липосомы с антителами к GFAP (3 животных), антителами к Е2 Сх43 (3 животных), неспецифическими иммуноглобулинами мыши (3 животных), а также флюоресцентно меченные липосомы без антител (3 животных). Во второй группе вводили парамагнитные липосомы, конъюгированные с антителами к GFAP (3 животных) к Е2 Сх43 (3 животных), неспецифическими иммуноглобулинами мыши (3 животных), а также невекторные парамагнитные липосомы (3 животных). Дополнительной группе из трех животных вводили Gd-DTPA, контрастирующий глиому, в качестве положительного контроля.
Стерилизованные иммунолипосомы вводили внутривенно животным с 18-ти дневной-глиомой в концентрации по общему белку 500 jo.g на кг веса. Животных, которым вводили флюоресцентно меченные иммунолипосомы глубоко наркотизировали через 48 часов после введения, перфузировали 4% параформальдегидом на PBS, мозг дофиксиро-вали в течение 12 часов, приготавливали срезы толщиной 40 um, которые затем анализировали с помощью сканирующего лазерного конфокального микроскопа Nikon Al MP.
Животных, получивших иммунолипосомы с Gd-DTPA подвергали динамическому МРТ исследованию головного мозга. Первое исследование проводили под кетамино-вым наркозом непосредственно перед введением парамагнитных иммунолипосом на 18 сутки после имплантации глиомы. Сроки следующих исследований определялись фарма-кокинетикой вводимых веществ. В группе, получившей Gd-DTPA, повторные исследования выполняли через 20 мин и через час после введения. Мозг животных, получивших ли-посомальные препараты повторно сканировали через час, 6 часов и через 24 часа после введения. Данные сроки проведения МРТ были выбраны с учётом того, что по данным литературы и по нашим собственным данным ТІ/2 ПЭГилированных иммунолипосом при внутривенном введении крысе составляет не менее 15 часов.
МРТ исследование головного мозга крыс выполняли на томографе ClinScan (Bruker) с постоянным магнитным полем 7 Тесла. Для получения MP изображений использовался линейный трансмиттер (передающая катушка - резонатор) с внутренним диаметром 72 мм и поверхностная приемная катушка для детектирования радиочастотного сигнала. В ходе работы были использованы следующие импульсные последовательности: Т2 RARE (Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement) - режим на основе «мульти-эхо». В последовательности RARE во время каждого эхо-сигнала воздействуют различные фа-зово-кодирующие градиенты. Это позволяет использовать эхо-сигналы для построения различных строк одного изображения. Основные параметры RARE: TR = 6000 мс, ТЕ = 63,9 мс, число эхо - 8, толщина среза 0,5 мм, размер матрицы 256 х 384, разрешение 0,164 х 0,164 мм/пиксель. ТІ-ВИ MDEFT (Modified Driven Equilibrium Fourier Transform) - метод усиления ЯМР-сигнала за счет неполного восстановления ТІ времени релаксации. Данный режим использовался после введения контраста. Основные параметры MDEFT: TR = 6000 мс, ТІ = 1500 мс, ТЕ = 4,3 мс, толщина среза 1,0 мм, размер матрицы 192 х 192, разрешение 0,178 х 0,178 мм/пиксель.
