Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследование механизмов адаптации организма к действию токсических агентов является важной фундаментальной проблемой, которая имеет отношение как к вопросам экологической безопасности, так и клинической медицины. Известны некоторые молекулярно-клеточные механизмы, связанные с каскадом реакций, инициированных токсинами грамотрицательных бактерий и представляющие собой систему врожденной антимикробной резистентности. Между тем, механизмы действия низкоинтенсивных химических агентов, широко распространенных в сфере существования биологических систем, до сих пор остаются почти неизученными.
Несмотря на то, что исследования эффектов бактериальных токсинов проводятся достаточно активно, до сих пор имеются проблемы, связанные с септическими воспалениями у человека, вызывающими высокий процент случаев гибели пациентов. Достаточно отметить, что уровень смертности пациентов в результате воспалений септической природы позволил включить сепсис в пятерку важнейших социально-значимых заболеваний. Большинство исследований по выявлению механизмов взаимодействия бактериальных токсинов с живыми системами выполнены с использованием трансформированных клеток (Nishina et. al., 2004, Li et.al., 2010), у которых чувствительность к патогенам значительно отличается от той, что свойственна нормальным животным клеткам. Кроме того, наибольшее количество работ, посвященных этим проблемам, выполнено с использованием клеточных моделей in vitro. С учетом перечисленных обстоятельств, представляется актуальным исследование новых закономерностей возникновения и развития септических состояний с использованием более адекватных животных моделей.
Очевидно, что изучение механизмов ответа клетки на бактериальные и химические токсины целесообразно проводить с учетом современных представлений о роли различных каскадов внутриклеточной сигнализации в формировании резистентности клеток к повреждающим агентам. Действительно, имеется большой пробел в изучении роли белков сигнальных
каскадов в формировании ответов организма на действие повреждающих факторов сверхслабой интенсивности, которые, тем не менее, присутствуют в сфере деятельности человека. Среди этих каскадов в первую очередь, следует исследовать путь активации NF-кВ, а также стресс-актив ируемой протеинкиназы SAPK/JNK, которая активируется многими типами экстраклеточных сигналов (Wada et al., 2004). Кроме того, актуально исследовать пути активации рецептора TLR4, ответственного за связывание эндотоксина с клеткой-мишенью, и выяснить степень его участия при формировании ответа клетки на действие химических сигналов. Наконец, очень важно провести поиск подходов для снижения последствий действия токсических факторов на клетку. В этом плане представляется актуальным исследование закономерностей функционирования защитных систем клетки с оценкой общего состояния цитокиновой сети (продукция про- и антивоспалительных цитокинов), уровень экспрессии белков теплового шока БТШ70 и БТШ90, продукцию оксида азота и уровень активации каскадов сигнальной трансдукции NF-кВ, SAPK/JNK и рецептора TLR4 при действии модифицирующих факторов, включая иммуномодуляторы и ингибиторы отдельных участков путей сигнализации.
Цели и основные задачи:
Целью данной работы было сравнительное исследование эффектов in vivo и in
vitro эндотоксина (ЛПС) и ряда химических токсинов в предельно допустимой концентрации (аммиак, уксусная кислота и диэтиловый эфир) на ключевые звенья клеточного иммунитета. Кроме того, актуальным было изучение способов модуляции уровня резистентности животных и рецепторной чувствительности клеток к действию токсинов разной природы и поиск методов, снижающих чувствительность клеток к ЛПС и к химическим токсинам. Поскольку клетки иммунной системы очень быстро формируют ответ на внешние сигналы, в качестве главного объекта исследования были использованы макрофаги и лимфоциты животных, а также макрофагальные клетки RAW 264.7. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Исследовать роль некоторых цитокинов: фактора некроза опухолей (ФНО-а), интерферона-у (ИФН-у), интерлейкина-1а (ИЛ-1а), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-3 (ИЛ-3), интерлейкина-6 (ИЛ-6), интерлейкина-10 (ИЛ-10), а также белков теплового шока БТШ72 и БТШ90, оксида азота в защитной реакции животных клеток и целого организма в условиях токсического стресса, индуцированного эндотоксином или химическими агентами в предельно допустимых концентрациях. Провести сравнительную оценку степени активации сигнальных каскадов NF-кВ, SAPK/JNK и экспрессии рецептора TLR4 при действии in vivo и in vitro бактериального и химических токсинов.
Учитывая развитие окислительного стресса при токсическом воздействии, использовать комплекс липорастворимых природных антиоксидантов, способных снизить продукцию активных форм кислорода в клетках животных. Исследовать защитный потенциал антиоксидантов путем оценки уровня продукции белка теплового шока БТШ72, а также уровней активации двух сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK в клетках мышей.
Изучить закономерности воздействия in vitro (на клетках RAW 264.7) ряда ингибиторов активации сигнальных каскадов NF-кВ, SAPK/JNK и рецептора TLR4 на уровень провоспалительного ответа клетки в условиях действия ЛИС и химических токсинов путем оценки продукции цитокинов (ФНО-а, ИЛ- 1а, ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-у), белков теплового шока БТШ72 и БТШ90, а также оценить эффект снижения активации сигнальных каскадов NF-кВ, SAPK/JNK и экспрессии рецептора TLR4.
Научная новизна. С использованием животных моделей in vitro и in vivo было
установлено, что химические вещества в предельно допустимой концентрации
способны вызывать активацию сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK, а
также стрессовый ответ лимфоидных клеток, сопровождающийся увеличением
продукции провоспалительных цитокинов, оксида азота и белков теплового
шока HSP70 и HSP90. При этом доказано, что эндотоксин в оптимально
действующей концентрации и аммиак в предельно допустимой концентрации
вызывают сопоставимые по уровню стрессовые ответы в лимфоцитах и
макрофагах мышей. Впервые установлено, что диета, обогащенная
липорастворимыми антиоксидантами (а-токоферол, Р-каротин и кофермент Q9)
снижает токсические эффекты ЛПС и аммиака, уменьшая пики продукции
белков теплового шока, а также подавляет активацию каскадов NF-кВ и
SAPK/JNK. С использованием линии макрофагальных клеток RAW 264.7 было
показано, что эндотоксин и аммиак в предельно допустимой концентрации
стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов, рецептора TLR4, а
также вызывают активацию каскадов сигнальной трансдукции NF-кВ и
SAPK/JNK. Несмотря на схожесть эффектов, вызванных аммиаком и
эндотоксином, ингибиторный анализ выявил различие механизмов
формирования стрессового ответа на токсины разной природы.
Научно-практическая ценность. В работе содержатся новые сведения о механизмах стрессового ответа, индуцированного токсинами различной природы. Результаты исследования указывают на перспективу использования ингибиторов сигнальных каскадов при разработке новых препаратов для лечения острых и хронических воспалений. В работе получены результаты,
указывающие на возможность применения профилактических подходов для снижения риска развития тяжелых септических состояний.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции молодых ученых и III школе им. академика Н.М. Эмануэля, (Москва, 2008), на конференциях и семинарах по Программе "Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2008, 2009, 2010), на 13-й и 14-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА (Пущино, 2009, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 статей в реферируемых журналах.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 листах машинописного текста и содержит 36 рисунков. Библиографический указатель содержит 250 источников литературы.
Список сокращений ЛПС - липополисахарид, TLR -сигнальный toll-like (toll-подобный) рецептор, ФНО - фактор некроза опухолей, ИФН - у - интерферон -гамма, ИЛ - интерлейкины, АО - антиоксиданты, HSP - белки теплового шока, NF-kB - ядерный фактор кВ, phNF-кВ - фосфорилированная форма NF-kB, ІкВа - nuclear factor of kappa - ингибиторный ІкВ-белок, IKK - ІкВ киназа, SAPK/JNK - стресс-активируемая протеинкиназа.
